HIF-1α對大鼠內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響及作用機制

蔣智永，胡子健，孟承穎 ，黃海良，段聲梁，蔣 薇，王 歡，余又新，孫業(yè)祥，方林森，胡德林

燒傷早期組織缺血缺氧是血管通透性改變的重要機制，大量的炎癥因子及轉(zhuǎn)錄因子參與其中，而缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)在燒傷休克早期血管通透性增加中占有重要位置；此外燒傷早期血管通透性改變主要發(fā)生在微靜脈和毛細(xì)血管，微靜脈由內(nèi)皮細(xì)胞、周靜脈、基底膜及少量平滑肌組成，而內(nèi)皮細(xì)胞在血管通透性改變中起著重要作用，因此，研究血管通透性的變化及其調(diào)控機制對燒傷休克的防治以及預(yù)防燒傷早期組織器官損害均有重要意義。然而，燒傷后血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性變化的作用機制及調(diào)控途徑目前尚不清楚，該實驗以原代大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞為研究對象，通過探討HIF-1α/內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)信號通路的調(diào)控作用以期為進(jìn)一步闡明燒傷早期血管通透性改變的機制及燒傷的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料原代大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞購自武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司；RNA提取試劑盒購自購自天根生化科技(北京)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Fish公司；RT-PCR試劑盒購自大連TakaRa公司；細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自杭州碧云天生物技術(shù)研究所；磷酸甘油醛脫氫酶(reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、HIF-1α、ET-1、內(nèi)皮素受體A(endothelin receptor A，ETA)、ETB和閉鎖小帶(zonula occludens，ZO-1)抗體購自美國Santa Cruz公司；PCR引物購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 應(yīng)用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 g/ml的鏈霉素、pH 7.4的RPMI1640的培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)原代大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞，隔天換液，觀察細(xì)胞生長狀況，當(dāng)細(xì)胞匯合度約為90%時，進(jìn)行消化、傳代、種板，按1×105/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至匯合度為80%時，將培養(yǎng)基更換為無血清RPMI1640培養(yǎng)基，進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2載體構(gòu)建 HIF-1α干擾、過表達(dá)及其陰性對照組載體均由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建，干擾載體分別標(biāo)記為短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA-Ⅰ)、shRNA-Ⅱ、shRNA-Ⅲ和短發(fā)夾RNA陰性對照組(short hairpin RNA negative control group，shRNA-NC)，干擾序列見表1。過表達(dá)載體標(biāo)記為GV230/HIF-1α和GV230。

表1 HIF-1α干擾序列

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株篩選 按1×106/孔將細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至匯合度為70%～80%，使用Lipofectamine 2000并參照其說明書分別將HIF-1α干擾及過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至原代大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞，同時設(shè)置陰性對照組。6 h后更換為含200 μg/ml遺傳霉素G418(geneticin，G418)的細(xì)胞培養(yǎng)基篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。同時，抑制劑組BQ123和BQ788先于GV230/HIF-1α 1 h加入細(xì)胞培養(yǎng)基。

1.2.4RT-PCR 應(yīng)用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，參照細(xì)胞總RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA。以總RNA為模板，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。以cDNA為模板，使用ABI7500 RT-PCR儀檢測相關(guān)基因的表達(dá)。RT-PCR反應(yīng)程序為：95 ℃、5 s；60 ℃、34 s，設(shè)置循環(huán)數(shù)為40。以β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法比較分析各基因表達(dá)，PCR引物序列見表2。

表2 RT-PCR引物序列

1.2.5Western blot 從RIPA細(xì)胞裂解物中提取細(xì)胞的總蛋白。用BCA方法定量后，將樣品以50 μg/孔的劑量進(jìn)行電泳和膜轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)移完成后，5%脫脂奶粉在室溫下密封1.5 h，TBST洗滌3 min，每種蛋白抗體根據(jù)抗體說明書操作，在4 ℃下孵育過夜，每次用TBST洗滌3次，每次5 min。相應(yīng)的次級抗體在室溫下孵育1.5 h，TBST每次洗滌3次，每次洗滌10 min，ECL發(fā)光、顯影。Quantity One灰度分析軟件檢測各目的蛋白灰度值，以β-actin為內(nèi)參計算其相對表達(dá)量。

1.2.6單層內(nèi)皮細(xì)胞膜通透系數(shù)檢測 將各組內(nèi)皮細(xì)胞按1×105/孔接種于24孔Transwell小室，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)8 h待其形成細(xì)胞單層。雙層小室的頂室加入FITC-albumin，底室加入D-Hank’s液，在37 ℃、5% CO2孵育45 min并抽吸雙室的頂部和底部腔室液體。在熒光分光光度計波長為488 nm下測定各樣品熒光強度(optical density，OD)值OD488 nm，計算單層內(nèi)皮細(xì)胞膜通透系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α shRNA有效序列篩選將3條HIF-1α shRNA分別轉(zhuǎn)染原代大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞，24 h后RT-PCR和Western blot分別檢測HIF-1α的表達(dá)，同時設(shè)置shRNA-NC組作為對照組。結(jié)果顯示：shRNA-Ⅰ、shRNA-Ⅱ 和shRNA-Ⅲ 的干擾效率分別為(67.14±7.28)%、(83.55±9.16)%和(52.84±6.48)%。shRNA-Ⅰ、shRNA-Ⅱ 和shRNA-Ⅲ組分別和shRNA-NC比較(T=22.222,P<0.001；T=24.449,P<0.001；T=15.278,P<0.001)，shRNA-Ⅱ 的干擾效率最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

2.2 HIF-1α低表達(dá)及過表達(dá)對細(xì)胞膜通透性相關(guān)蛋白表達(dá)的影響分別將shRNA-Ⅱ及GV230/HIF-1α轉(zhuǎn)染原代大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞，應(yīng)用濃度為200 μg/ml G418篩選4周，構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。應(yīng)用RT-PCR和Western blot分別檢測HIF-1α、ET-1、ETA、ETB和ZO-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化。檢測結(jié)果顯示：與shRNA-NC組相比，穩(wěn)轉(zhuǎn)shRNA-Ⅱ組HIF-1α(T=22.73，P<0.001)、ET-1(T=17.99,P<0.001)、ETA(T=11.27,P=0.004)和ETB(T=23.19,P=0.001) mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低，而ZO-1(T=12.46,P=0.002)則顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖2A、2B。與轉(zhuǎn)染GV230組比較，穩(wěn)轉(zhuǎn)GV230/HIF-1α組HIF-1α(T=13.23，P=0.002)、ET-1(T=14.86,P=0.001)、ETA(T=14.86,P=0.001)和ETB(T=27.29,P=0.001) mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高，而ZO-1(T=16.17,P<0.001)則顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖2C、2D。

圖1 轉(zhuǎn)染不同shRNA對HIF-1α表達(dá)的影響

2.3 HIF-1α過表達(dá)對大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞通透性系數(shù)的影響分別檢測GV230組和GV230/HIF-1α組樣品的熒光強度值(OD488 nm)，并將GV230組細(xì)胞通透系數(shù)均一化為100%，計算GV230/HIF-1α組單層內(nèi)皮細(xì)胞膜通透性系數(shù)。結(jié)果顯示，與GV230組比，GV230/HIF-1α(T=6.765,P<0.001)組細(xì)胞通透性系數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

2.4 阻斷HIF-1α/ET-1信號通路對相關(guān)蛋白表達(dá)和細(xì)胞通透性的影響聯(lián)合應(yīng)用濃度分別為10 nmol/L的BQ123和1 nmol/L的BQ788預(yù)處理穩(wěn)轉(zhuǎn)GV230/HIF-1α大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞1 h，RT-PCR和Western blot分別檢測HIF-1α、ET-1、ETA、ETB和ZO-1 mRNA和蛋白表達(dá)。同時，熒光分光光度計檢測各組熒光度值。結(jié)果顯示，BQ123和BQ788能夠抑制HIF-1α誘導(dǎo)的ETA和ETB表達(dá)、增強ZO-1的表達(dá)，單層細(xì)胞膜通透性系數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖4、5。

圖2 干擾及過表達(dá)HIF-1α對細(xì)胞膜通透性相關(guān)基因表達(dá)的影響

A：HIF-1α干擾后相關(guān)mRNA表達(dá)；B：HIF-1α干擾后相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)；C：HIF-1α過表達(dá)后相關(guān)mRNA表達(dá)；D：HIF-1α過表達(dá)后相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)；1：轉(zhuǎn)染shRNA-NC組；2：穩(wěn)轉(zhuǎn)shRNA-Ⅱ組；3：轉(zhuǎn)染GV230組；4：穩(wěn)轉(zhuǎn)GV230/HIF-1α組；與shRNA-NC組比較：**P<0.01；與GV230組比較：##P<0.01

圖3 HIF-1α過表達(dá)對內(nèi)皮細(xì)胞通透性系數(shù)的影響與GV230組比較：**P<0.01

圖4 阻斷HIF-1α/ET-1信號通路對相關(guān)蛋白的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)影響

A：阻斷HIF-1α/ET-1信號通路相關(guān)mRNA表達(dá); B：阻斷HIF-1α/ET-1信號通路相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)；1：GV230/HIF-1α組；2：GV230/HIF-1α+BQ123/BQ788組;與GV230/HIF-1α組比較：**P<0.01

圖5 阻斷HIF-1α/ET-1信號通路對細(xì)胞膜通透性影響

3 討論

細(xì)胞通透性改變是炎性反應(yīng)、組織缺氧以及細(xì)胞代謝障礙等多種疾病的重要病理過程。燒傷早期血管通透性改變受多種因素調(diào)節(jié)，而內(nèi)皮細(xì)胞損傷占有重要地位[1]，內(nèi)皮細(xì)胞在組織和血管中起生理屏障作用[2-3]，這道屏障允許小分子物質(zhì)通過，禁止大分子物質(zhì)通過；而大分子物質(zhì)通過細(xì)胞鏈接、細(xì)胞上的窗孔和跨細(xì)胞途徑跨越細(xì)胞通過內(nèi)皮細(xì)胞屏障到達(dá)組織中，大量血漿樣液體及高分子物質(zhì)從血管內(nèi)滲出血管外，引起血容量驟減造成休克發(fā)生和發(fā)展。而機體缺氧更使血管通透性增加，這樣反復(fù)形成惡性循環(huán)[4]。燒傷早期血管活性物質(zhì)及炎性介質(zhì)釋放改變了血管結(jié)構(gòu)，從而改變血管通透性[5]。但是至目前為止，燒傷早期血管通透性改變發(fā)生的具體機制仍不明確[6]，因而臨床更無有效的預(yù)防治療手段來降低血管通透性。

HIF-1α是一種異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子并廣泛分布于人體內(nèi)，它由120 ku的HIF-1α和91～94 ku的HIF-1β兩個亞單位組成[7]。正常情況下，機體合成的HIF-1蛋白很快失去活性，HIF-1蛋白只有在機體缺氧條件下才能具有活性。其中α亞基決定著HIF-1的調(diào)控活性，被激活的HIF-1α通過增加與下游基因的缺氧反應(yīng)元素結(jié)合，從而調(diào)控多種轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯[8]。

ET-1是內(nèi)皮細(xì)胞分泌的血管活性肽，具有強烈的縮血管作用，而燒傷早期由于機體缺氧ET-1高度表達(dá)，研究[ 9]表明ET-1可以通過與其相應(yīng)受體結(jié)合而發(fā)揮各種生物活性，而ET-1啟動子的某位點可以結(jié)合HIF-1，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞ET-1表達(dá)的激活，ET-1在炎癥反應(yīng)方面有重要作用，如刺激中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放各種促炎因子，導(dǎo)致失控性炎癥反應(yīng)，結(jié)果導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷加重[10]，通透性增加，組織缺氧加重細(xì)胞損傷，形成恐性循環(huán)導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征[11]。

研究[12-14]顯示當(dāng)大鼠缺血缺氧時,HIF-1α、ET-1、ETA、ETB mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高，提示 HIF-1α可能參與了主動脈內(nèi)皮細(xì)胞通透性的調(diào)控，但是其作用機制尚未闡明。

本研究結(jié)果顯示HIF-1α能明顯提高細(xì)胞膜通透性系數(shù)，應(yīng)用ET-1信號通路抑制劑預(yù)處理HIF-1α過表達(dá)細(xì)胞株后細(xì)胞膜通透性系數(shù)則明顯降低，該結(jié)果進(jìn)一步證明HIF-1α促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性升高的可能性，同時說明，HIF-1α/ET-1信號軸在調(diào)控?zé)齻笫笱芡ㄍ感苑矫婢哂兄匾饔谩?/p>