馬錢子堿對(duì)人乳腺癌裸鼠移植瘤生長的影響及機(jī)制探討

宋萬吉，徐夢(mèng)冉，董文欽，朱耀東，張 梅，李 平

乳腺癌(breast cancer，BC)是全世界婦女中最常見的癌癥類型，為美國女性癌癥死亡的第一大原因[1]。其中三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer， TNBC)占所有乳腺癌的10%～15%[2]，與其他BC亞型相比，TNBC具有預(yù)后差、復(fù)發(fā)率高、轉(zhuǎn)移率高等特性[3]，逐漸引起人們的重視。馬錢子堿為通絡(luò)藥馬錢子的主要生物堿單體，課題組前期體外研究[4]顯示馬錢子堿對(duì)BC細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用。該實(shí)驗(yàn)觀察馬錢子堿在體內(nèi)對(duì)TNBC生長的影響及探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 腫瘤細(xì)胞株與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)人TNBC細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞庫，用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液，在 37 ℃、5% CO2濕度穩(wěn)定的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。BALB/c(nu /nu) 裸鼠，15～20 g，5～6周齡，雌性，SPF級(jí)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20～26 ℃，濕度40%～70%，共20只，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(京)2016-0006。在本實(shí)驗(yàn)全過程中, 動(dòng)物處置方法確保符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.2 主要試劑高糖DMEM培養(yǎng)基、雙抗、PBS購自美國Hyclone公司；胎牛血清、胰蛋白酶-EDTA消化液購自美國Gibco公司；馬錢子堿(批號(hào):399027, HPLC≥98%) 購自美國Sigma公司；紫杉醇購自海南魯泰制藥有限公司；二甲基亞砜(DMSO) 購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；Matrigel基質(zhì)膠(貨號(hào)：356234)購自美國Corning公司；凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Anti-Ki-67(ab15580)、Anti-Caspase-3(ab13847)抗體購自上海艾博抗(abcam)貿(mào)易有限公司，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(二抗) 購自美國Santa Cruz公司，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光自顯影試劑盒(enhanced chemiluminescence, ECL)購自美國Biological Industries公司。

1.3 方法

1.3.1蛋白質(zhì)印跡法檢測Caspase-3的表達(dá)水平 將收集到的細(xì)胞加入RIPA細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解, 提取細(xì)胞總蛋白。然后加入等體積的電泳上樣緩沖液，于沸水中煮10 min制成電泳樣品, 將樣品等量上樣后進(jìn)行電泳分離, 冰水浴中恒壓濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。配置鼠抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase-3)單抗(1 ∶5 000),4 ℃反應(yīng)過夜; PBST洗膜3次, 加入HRP標(biāo)記的二抗(體積稀釋比例為1 ∶10 000), 室溫反應(yīng)1 h；PBST洗膜3次, 用ECL顯影試劑盒發(fā)光顯影。

1.3.2人BC裸鼠皮下移植瘤的建立 取處于對(duì)數(shù)生長期的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化成細(xì)胞懸液，用DMEM將細(xì)胞濃度配置成1×106/ml,并與Matrigel基質(zhì)膠等比例混勻，按0.2 ml/只接種于裸鼠右側(cè)腋窩皮下。6周后，共有16只裸鼠造模成功，成功率為80%，移植瘤長徑約0.5 cm，其中1只因進(jìn)食及營養(yǎng)狀況較差，舍棄不用。余下15只裸鼠隨機(jī)分為5組：馬錢子堿低、中、高劑量組(15、30、60 mg/kg),陽性對(duì)照組(紫杉醇5 mg/kg)和陰性對(duì)照組(DMSO)，每組3只。馬錢子堿組和陰性對(duì)照組采用灌胃給藥，1次/d；紫杉醇組采用腹腔注射，兩天一次，共用藥4周。期間每周兩次對(duì)裸鼠體質(zhì)量、移植瘤長、短徑進(jìn)行測量，并按公式計(jì)算移植瘤的體積(體積V=a×b2/2，a為長徑，b為短徑)。治療結(jié)束后隔天采用脫頸處死法處死裸鼠，剝離移植瘤。

1.3.3荷瘤裸鼠腫瘤生長抑制率 處死小鼠后,剝離完整移植瘤,稱取瘤體質(zhì)量,計(jì)算腫瘤生長抑制率。以每組小鼠的平均瘤重作為療效指標(biāo)。腫瘤生長抑制率=(1-治療組平均瘤重/陰性對(duì)照組平均瘤重)×100%。

1.3.4HE染色 將剝離下來的移植瘤置于4% 的多聚甲醛溶液中固定,依次行脫水,石蠟包埋,行4 μm厚切片。染色前將片子置于60 ℃培養(yǎng)箱加熱過夜,脫蠟，最后進(jìn)行HE染色并進(jìn)行顯微鏡下觀察。

1.3.5TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 取各組裸鼠石蠟包埋的移植瘤組織切片和多聚賴氨酸包被的玻片，經(jīng)裱片、烤片處理后，按照原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒提示的步驟進(jìn)行操作，在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)目。

1.3.6免疫組化檢測Ki-67及凋亡蛋白Caspase-3 先進(jìn)行切片脫蠟，用現(xiàn)配3%過氧化氫封閉15 min；PBS洗3次，每次5 min；10%正常山羊血清封閉30 min；封閉后不洗，加一抗孵育(細(xì)胞增殖相關(guān)核抗原Ki-67為1 ∶5 000；Caspase-3為1 ∶200)。4 ℃過夜;在室溫平衡30 min，用PBS洗3次，每次5 min；二抗孵育，37 ℃ 1 h；PBS洗3次，每次5 min；DAB顯色；顯色完畢置于蒸餾水，梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的馬錢子堿對(duì)凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)的影響分別用DMSO、馬錢子堿(25、50、100、200、400 μg/ml)處理TNBC MDA-MB-231細(xì)胞48 h，蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示：200、400 μg/ml的馬錢子堿組細(xì)胞中Caspase-3剪切體蛋白的表達(dá)水平與對(duì)照組相比明顯增高，其余濃度與對(duì)照組相比，未見明顯改變，見圖1。

圖1 各組馬錢子堿對(duì)凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)的影響

2.2 馬錢子堿對(duì)TNBC移植瘤體積及抑瘤率的影響將TNBC細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞注射于裸鼠右側(cè)腋窩皮下，約2周后，部分裸鼠在注射部位可觸及小結(jié)節(jié)，質(zhì)地堅(jiān)硬，邊緣清楚，移植瘤長徑約0.3 cm，未出現(xiàn)融合。給藥期間各組裸鼠未出現(xiàn)腹瀉血便以及死亡等不良情況。各組給藥前移植瘤體積無明顯差異，給藥后馬錢子堿高、中劑量組及紫杉醇組移植瘤體積增長較其他兩組明顯變慢；給藥后期，部分馬錢子堿低劑量組及陰性對(duì)照組因移植瘤較大，表面出現(xiàn)壞死破潰。治療結(jié)束后處死裸鼠，并對(duì)小鼠移植瘤體積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。在處死過程中發(fā)現(xiàn)馬錢子堿高、中劑量組及紫杉醇組移植瘤內(nèi)部存在液性壞死。結(jié)果提示：馬錢子堿(30、60 mg/kg)組移植瘤體積與陰性對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；各組移植瘤體積、平均瘤重及腫瘤生長抑制率結(jié)果見表1。各組裸鼠移植瘤大體圖片見圖2。

2.3 馬錢子堿對(duì)TNBC移植瘤細(xì)胞增殖的影響將各組移植瘤進(jìn)行HE染色及Ki-67免疫組化。HE染色顯示：BC細(xì)胞密度隨馬錢子堿濃度的升高而變的相對(duì)稀疏；Ki-67免疫組化提示：隨著馬錢子堿濃度升高，陽性細(xì)胞逐漸減少，并且馬錢子堿(30、60 mg/kg)組與陰性對(duì)照組及紫杉醇組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(組間單因素方差分析：F=525.891,P<0.01)。見圖3、4。

表1 馬錢子堿對(duì)移植瘤體積及抑瘤率的影響

與陰性對(duì)照組比較：**P<0.01；與紫杉醇組比較：#P<0.05,##P<0.01

圖2 治療結(jié)束后各組小鼠剝離的移植瘤大體圖片

A：陰性對(duì)照組； B：馬錢子堿低劑量組；C：馬錢子堿中劑量組；D：馬錢子堿高劑量組；E：紫杉醇組

2.4 馬錢子堿對(duì)TNBC移植瘤細(xì)胞凋亡的影響將各組移植瘤進(jìn)行TUNEL實(shí)驗(yàn)及Caspase-3免疫組化檢測，結(jié)果提示：隨著馬錢子堿濃度升高，陽性細(xì)胞數(shù)均呈上升趨勢(shì)；并且兩組實(shí)驗(yàn)均提示：馬錢子堿(30、60 mg/kg)組陽性細(xì)胞數(shù)與陰性對(duì)照組及紫杉醇組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(組間單因素方差分析：TUNEL實(shí)驗(yàn)陽性細(xì)胞數(shù)F1=102.344,P<0.01；Caspase-3免疫組化陽性細(xì)胞數(shù)F2=214.065,P<0.01)。見圖5、6。

3 討論

BC是全球女性常見的惡性腫瘤之一，同時(shí)也是女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因[5]。其中TNBC是BC的一個(gè)亞型，其特征是黃體酮受體、雌激素受體的缺乏和人表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)的低表達(dá)[6]。與BC其他亞型相比，它具有預(yù)后差、復(fù)發(fā)率高和死亡率高等不良特點(diǎn)[3]?；加羞@種亞型的患者，內(nèi)分泌治療及HER2靶向治療效果不佳，對(duì)細(xì)胞毒性化療的長期效果也不太理想[7]，而傳統(tǒng)中藥在抗腫瘤方面有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，不僅可作用于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等多個(gè)環(huán)節(jié)，還具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多效應(yīng)的特點(diǎn)。因此，對(duì)中藥成分在抗腫瘤治療機(jī)制進(jìn)行積極探索是非常有意義的。

圖3 對(duì)各組裸鼠移植瘤進(jìn)行HE染色及Ki-67染色 SP×200

A：陰性對(duì)照組；B：馬錢子堿低劑量組；C：馬錢子堿中劑量組；D：馬錢子堿高劑量組；E：紫杉醇組；1：HE染色；2：Ki-67染色

圖4 各組移植瘤Ki-67免疫組化陽性細(xì)胞數(shù)占陰性對(duì)照組百分比

與陰性對(duì)照組比較：**P<0.01；與紫杉醇組比較：##P<0.01

圖5 各組移植瘤TUNEL實(shí)驗(yàn)及Capase-3免疫組化 SP×200

A：陰性對(duì)照組；B：馬錢子堿低劑量組；C：馬錢子堿中劑量組；D：馬錢子堿高劑量組；E：紫杉醇組；1：TUNEL實(shí)驗(yàn)；2：Caspase-3

圖6 各組移植瘤TUNEL實(shí)驗(yàn)及Caspase-3免疫組化陽性細(xì)胞數(shù)

與陰性對(duì)照組比較：**P<0.01；與紫杉醇組比較：##P<0.01

馬錢子堿為中藥馬錢子的主要生物堿單體。馬錢子為馬錢科植物長籽馬錢或馬錢的干燥種子，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤和抑制免疫等藥理作用[8]。本實(shí)驗(yàn)組前期研究表明，馬錢子堿能夠抑制BC骨轉(zhuǎn)移[9]，誘導(dǎo)體外BC細(xì)胞凋亡[10]，本實(shí)驗(yàn)通過建立裸鼠BC皮下移植瘤模型，給予不同濃度馬錢子堿治療，結(jié)果顯示：隨馬錢子堿濃度的升高，移植瘤體積逐漸變小，并且對(duì)BC細(xì)胞的增殖起到抑制作用。為進(jìn)一步研究馬錢子堿對(duì)BC移植瘤抑制作用的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)對(duì)馬錢子堿在體內(nèi)對(duì)BC的凋亡作用進(jìn)行探討。

凋亡是一種由基因介導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡，在發(fā)育、免疫和疾病的過程中可以消除受損或多余的細(xì)胞有助于確保機(jī)體的健康[11]。而細(xì)胞凋亡大多數(shù)通過Caspase介導(dǎo)的信號(hào)途徑完成，其中心環(huán)節(jié)為Caspase-3的激活，它能激活Caspase活化的核酸內(nèi)切酶,進(jìn)而對(duì)DNA進(jìn)行切割[12]。本實(shí)驗(yàn)通過體外蛋白質(zhì)印跡法檢測不同濃度的馬錢子堿對(duì)凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)的影響，結(jié)果提示相對(duì)較高濃度的馬錢子堿(200、400 μg/ml)組細(xì)胞中Caspase-3剪切體蛋白的表達(dá)水平與馬錢子堿其他劑量組及對(duì)照組相比明顯增高；對(duì)裸鼠移植瘤進(jìn)行TUNEL實(shí)驗(yàn)及Caspase-3免疫組化，結(jié)果提示馬錢子堿可以誘導(dǎo)BC細(xì)胞的凋亡，對(duì)TNBC細(xì)胞在體內(nèi)的無限增殖起到抑制作用。但誘導(dǎo)凋亡的具體機(jī)制未明確，還需進(jìn)一步探討。

綜上所述，馬錢子堿可以抑制TNBC移植瘤的生長，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)BC細(xì)胞凋亡有關(guān)。