樣品預(yù)處理方法對(duì)小麥和玉米葉子中內(nèi)源激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

羅夢(mèng)娜，楊 雪，彭 靜，劉西平

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

內(nèi)源激素調(diào)控著植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)過(guò)程以及植物對(duì)環(huán)境變化的響應(yīng)，因此，對(duì)植物源激素水平的監(jiān)測(cè)已成為衡量和評(píng)價(jià)植物生長(zhǎng)發(fā)育狀況的重要指標(biāo)。目前，除了氣態(tài)的激素——乙烯是利用氣相色譜法檢測(cè)外，其余植物內(nèi)源激素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大多采用酶聯(lián)免疫法和高效液相色譜法檢測(cè)。酶聯(lián)免疫法是利用免疫反應(yīng)的高度專(zhuān)一性和敏感性以及酶促反應(yīng)高效催化性相結(jié)合的原理進(jìn)行植物激素檢測(cè)，具有測(cè)定快速、靈敏度高、設(shè)備要求低等優(yōu)點(diǎn)，但因抗體制備較復(fù)雜及測(cè)定成本較高等因素限制了該方法的廣泛應(yīng)用。高效液相色譜法是利用流動(dòng)相推動(dòng)待檢測(cè)試樣與固定相之間的作用進(jìn)行不同組分的分離后進(jìn)行檢測(cè)，并以其較高的重復(fù)性、專(zhuān)一性和靈敏度成為應(yīng)用較為廣泛的一種檢測(cè)植物內(nèi)源激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方法[1-6]。

植物體內(nèi)其他內(nèi)含物的存在也常常會(huì)干擾和影響測(cè)定結(jié)果，而且不同植物內(nèi)含物種類(lèi)和質(zhì)量分?jǐn)?shù)上的差異也會(huì)使干擾和影響程度不盡相同，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性也會(huì)隨之降低。在利用高效液相色譜法檢測(cè)時(shí)，植物材料預(yù)處理方法的不同也會(huì)顯著影響檢測(cè)結(jié)果，這種現(xiàn)象在柑橘[7]、葡萄[8]、獼猴桃[9]、梨[10-11]和桃[12]等果實(shí)組織以及棉花幼苗葉片[13-14]、小麥[15-16]和玉米[17]的內(nèi)源激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定中也都得到了證實(shí)。這種現(xiàn)象也嚴(yán)重影響了已有文獻(xiàn)中同類(lèi)數(shù)據(jù)的相互比較和參考。因此，針對(duì)同一種植物材料，對(duì)高效液相色譜法的不同預(yù)處理方法進(jìn)行比較和甄選，將會(huì)明顯提高該分析方法的可靠性以及試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可比對(duì)性。

本試驗(yàn)將目前的預(yù)處理方法整理歸納為4種，并分別按照4種方法對(duì)小麥和玉米葉子的新鮮樣品進(jìn)行處理，然后利用高效液相色譜法測(cè)定樣品中的生長(zhǎng)素(IAA)、赤霉素(GA)、細(xì)胞分裂素(CTK)、玉米素(ZT)和脫落酸(ABA)等5種植物內(nèi)源激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以比較不同預(yù)處理方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料及預(yù)處理

在小麥播種45 d和玉米播種40 d后，分別采集完全展開(kāi)的、位于中部的葉片，置于液氮中研磨成粉末狀。稱(chēng)取1 g研磨后的樣品，加入預(yù)冷的80%(體積分?jǐn)?shù))的甲醇20 mL，密封后于4 ℃下冷浸過(guò)夜，收集上清液。在殘?jiān)屑尤?0 mL 80%的冷甲醇，于4 ℃下8 000 r/min離心10 min，收集上清液；重復(fù)上次步驟1次。合并3次收集的上清液，然后分別按照下面4種方法處理后進(jìn)行測(cè)定(每種處理重復(fù)4次)。

處理方法一：參照文獻(xiàn)[4]，將上清液在40 ℃下減壓蒸發(fā)至2 mL溶液，過(guò)0.22 μm的微孔濾膜后，取10 μL用于高效液相色譜儀檢測(cè)。

處理方法二：參照文獻(xiàn)[18]，將上清液在40 ℃下減壓蒸發(fā)至原體積的1/3，加入 20 mL的石油醚脫色3次，棄醚相。將下層提取液的pH用 1 mol/L的乙酸調(diào)至6.4，加入0.5 g的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，超聲抽濾30 min。將濾液pH調(diào)至2.9，然后加入20 mL的乙酸乙酯萃取3次，合并酯相，40 ℃下減壓蒸干后，用甲醇溶解并定容至 2 mL，過(guò)0.22 μm的微孔濾膜后，取10 μL用于檢測(cè)。

處理方法三：參照文獻(xiàn)[19-20]，將處理方法二中的PVP替換成聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)，其余步驟相同。

處理方法四：參照文獻(xiàn)[5]，將收集到的上清液在40 ℃下減壓蒸發(fā)和石油醚脫色后，下層溶液加入20 mL的乙酸乙酯萃取3次，40 ℃下減壓蒸干，加入pH為3.5的乙酸溶液2 mL，過(guò)Sep-Pak C18小柱純化，用甲醇洗脫，洗脫液在40 ℃下加壓蒸干。用甲醇溶解并定容至 2 mL，過(guò) 0.22 μm的微孔濾膜后，取10 μL用于檢測(cè)。

1.2 高效液相色譜測(cè)定條件

以甲醇為溶劑，配制質(zhì)量濃度分別為10 g/L的GA、1.0 g/L的IAA、1.0 g/L的6-BA、0.1 g/L的ABA和0.1 g/L的ZT的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用美國(guó)Water公司生產(chǎn)的高效液相色譜儀(分析型1525+2489，1525泵，7725i進(jìn)樣器，T2489紫外檢測(cè)器)進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定時(shí)，色譜柱為Symmery C18色譜柱(25 cm×4.6 cm，5 μm，美國(guó)Water公司)，流動(dòng)相A為甲醇，B為0.075%冰乙酸水溶液，梯度條件為0～7 min 35%～45% A，7～12 min 45%～50% A，12～15 min 50% A，15～25 min 50% A，流速為1 mL/min。檢測(cè)器波長(zhǎng)設(shè)置為254 nm，柱溫30 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品和植物樣品中的5種激素的分離圖譜

從標(biāo)準(zhǔn)樣品的分離圖譜(圖1-A)可以看出，在本試驗(yàn)條件下，ZT、GA、IAA、6-BA和ABA的保留時(shí)間分別為5.196 min、9.166 min、13.946 min、14.881 min和18.472 min。吸收峰之間分離良好，互不干擾。

小麥和玉米葉片不同預(yù)處理方法的比較結(jié)果也表明，采用第4種方法可以得到分離效果更為清晰的、與標(biāo)準(zhǔn)品最為相近的分離圖譜(圖1- B和1-C)，表明提取方法和色譜條件較為可靠。

2.2 激素的回歸方程和相關(guān)系數(shù)

以5種激素標(biāo)準(zhǔn)溶液為原液，分別稀釋2、3、4、6、8倍，在色譜儀中分析。以標(biāo)樣濃度為縱坐標(biāo)，峰面積為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出各激素的回歸方程和相關(guān)系數(shù)(表1)。

2.3 不同預(yù)處理方法得到的小麥葉片中5種激素的檢測(cè)結(jié)果

在相同的檢測(cè)條件下，不同預(yù)處理方法得到的小麥葉片中5種不同的激素水平存在明顯差異(表2)，且均表現(xiàn)為：經(jīng)過(guò)C18小柱除雜、純化和富集后得到的GA、IAA和6-BA 3種激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高；只用甲醇提取不進(jìn)行除雜和純化，檢測(cè)出的激素仍然較高，但卻低于經(jīng)C18小柱處理的測(cè)定結(jié)果，其他化合物的存在對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響較為明顯(圖2)；用PVP和PVPP處理后，內(nèi)源激素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低。而對(duì)于ZT和ABA，4種提取方法得到的激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的差異性不明顯。盡管只用甲醇提取不進(jìn)行除雜和純化得到的結(jié)果與經(jīng)C18小柱處理的結(jié)果相近，但提取液中雜質(zhì)對(duì)色譜結(jié)果(圖2)的干擾明顯高于后者(圖1-B)，因此，在小麥葉片激素測(cè)定時(shí)，利用上述經(jīng)C18小柱的預(yù)處理方法最為理想。

圖1 標(biāo)樣(A)、小麥葉片(B)和玉米葉片(C) 中5種激素的高效液相分離圖譜Fig.1 High performance liquid chromatogram of five hormones in standard solution(A), wheat leaves(B) and maize leaves(C)

表1 回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 1 Regression equation and correlation coefficient

圖2 高效液相色譜甲醇提取小麥 葉片中5種激素的色譜圖Fig.2 High performance liquid chromatogram of five hormones extracted by methanol in wheat leaves

表2 不同預(yù)處理方法下小麥葉片中的5種激素Table 2 Five hormones in wheat leaves of different pre-treatment methods μg/g

注：M1～M4代表4種處理方法，表中數(shù)值為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，同列不同字母表示處理間在5%水平下有顯著差異。下同。

Note: M1-M4 represents four pre-treatment methods. The values of number in the figure are “mean ± standard deviation”. Different letters in the same columns indicate significant difference between different treatments at 0.05 level.The same below.

2.4 不同預(yù)處理方法得到的玉米葉片中5種激素的檢測(cè)結(jié)果

與小麥樣品的檢測(cè)結(jié)果相一致，不同預(yù)處理方法得到的玉米葉片中5種不同的激素水平也存在明顯的差異(表3)。而且經(jīng)C18小柱預(yù)處理得到的5種內(nèi)源激素(尤其是GA和6-BA)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)都高于其他3種預(yù)處理方法(表3)。只用甲醇提取不進(jìn)行除雜和純化檢測(cè)得到的IAA和GA質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，但仍明顯低于C18小柱處理的測(cè)定結(jié)果，其他化合物的存在對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾也較大(圖3)；用PVP和PVPP除雜的處理方法檢測(cè)到的激素較少，這與小麥葉片中的結(jié)果是一致的。因而，在4種不同的預(yù)處理方法中，經(jīng)C18除雜和純化的方法最為理想。

表3 不同預(yù)處理方法下玉米葉片中的5種激素Table 3 Five hormones in maize leaves of different pre-treatment methods μg/g

2.5 主效應(yīng)分析

對(duì)試驗(yàn)中的2種植物材料、4種處理方法和5種內(nèi)源激素水平的主效應(yīng)分析表明，植物材料和提取方法均顯著影響不同內(nèi)源激素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(P<0.05)，且材料的差異大于提取方法的差異(表4)。在小麥和玉米中分別進(jìn)行檢驗(yàn)(表5)，處理方法對(duì)不同種類(lèi)激素水平有顯著的影響(P<0.05)。以上結(jié)果表明，對(duì)不同的植物材料，需要不同的提取方法檢驗(yàn)其內(nèi)源激素，適宜的預(yù)處理方法才能更準(zhǔn)確地檢測(cè)出植物中各種內(nèi)源激素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

圖3 甲醇提取玉米葉片中5種激素的色譜圖Fig.3 High performance liquid chromatogram of five hormones extracted by methanol in maize leaves

表4 主效應(yīng)檢驗(yàn)Table 4 Main effect test

注Note:a.R2=0.576(adjustmentR2=0.546).

表5 小麥和玉米中主效應(yīng)分析Table 5 Main effect test in wheat and maize

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，高效液相色譜法已成為應(yīng)用較為廣泛的一種測(cè)定植物內(nèi)源激素的方法。由于植物體內(nèi)其他內(nèi)含物的存在，常常干擾和影響著檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，這種狀況對(duì)植物材料預(yù)處理方法也提出了更高的要求。

在植物激素的提取過(guò)程中，有機(jī)溶劑能從植物組織中提取出植物激素，甲醇以其分子量小、滲透性強(qiáng)的特點(diǎn)成為應(yīng)用最廣泛的溶劑[21]。在測(cè)定植物激素時(shí)，謝君等[1]分析出了石油醚為較合適的萃取劑，經(jīng)Sep-Pak C18小柱分離能有效去除干擾物質(zhì)。為了進(jìn)一步提高檢測(cè)的精度，試驗(yàn)也采用加入PVP[6,18]或PVPP[19-20]吸附去除雜質(zhì)的方法，有效消除了色素、酚類(lèi)物質(zhì)和其他內(nèi)含物的影響。前人的研究中采用的幾種不同方法均成功分離測(cè)定出了不同植物組織中的激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，然而，因激素的種類(lèi)不同，植物材料的差異，預(yù)處理方法的不同，無(wú)法類(lèi)比出其優(yōu)略性。本試驗(yàn)以小麥和玉米葉片為材料，對(duì)這幾種常用的提取方法進(jìn)行比較，以尋求更有效的適合多種激素進(jìn)行同時(shí)分離和純化的方法。從高效液相色譜的測(cè)定結(jié)果來(lái)看，不同預(yù)處理方法顯著影響小麥葉子中IAA、GA和6-BA以及玉米葉子中IAA、GA、ZT、6-BA和ABA的檢測(cè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其中經(jīng)提取、脫色、萃取和過(guò)C18小柱的方法，得到的各種激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，且在色譜檢測(cè)過(guò)程中雜質(zhì)對(duì)結(jié)果的干擾最小，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。因此，對(duì)于小麥和玉米葉片內(nèi)源激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的高效液相色譜法測(cè)定而言，將樣品用甲醇提取后，經(jīng)石油醚脫色和乙酸乙酯萃取，再過(guò)C18小柱，是一種較為適宜的樣品預(yù)處理方法，其測(cè)定結(jié)果也可能會(huì)更為準(zhǔn)確地反映內(nèi)源激素的實(shí)際質(zhì)量分?jǐn)?shù)。