豬丹毒絲菌滅活疫苗制備及其對(duì)小鼠免疫效力的評(píng)價(jià)

陳 章，劉曉露，姚焱彬，吳瓊娟，孫 裴，魏建忠，李東風(fēng)，李 郁

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036；2.安徽省獸藥飼料監(jiān)察所，合肥 230001)

豬丹毒(Swine erysipelas)是由豬丹毒絲菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)引起的一種急性、熱性人畜共患傳染病。早在20世紀(jì)80年代，該病就與豬瘟、豬肺疫并稱(chēng)為中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的三大傳染病，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。隨著規(guī)?；B(yǎng)豬的發(fā)展、抗生素的大量使用以及疫苗的免疫預(yù)防，其危害減輕，防控被忽視。然而，近年來(lái)，在中國(guó)廣西、廣東、四川、福建、江西、安徽、吉林、黑龍江等多地均有豬丹毒的發(fā)生，且呈逐漸嚴(yán)重之勢(shì)[1]。不僅如此，臨床上多見(jiàn)豬丹毒絲菌與鏈球菌、副豬嗜血桿菌、豬圓環(huán)病毒2型以及豬藍(lán)耳病病毒等混合感染或繼發(fā)感染，致使病情復(fù)雜化，增加發(fā)病率和病死率[2]。

目前，防控豬丹毒的方式主要有抗生素治療和疫苗免疫?？股仉m然臨床使用效果較好，但隨著養(yǎng)殖業(yè)中的過(guò)度使用和濫用，引起豬丹毒絲菌耐藥性的產(chǎn)生[3]。在無(wú)抗養(yǎng)殖逐漸成為共識(shí)的今天，疫苗免疫仍然是預(yù)防豬丹毒最有效的辦法。豬丹毒商品化疫苗主要包括豬丹毒滅活疫苗(以血清型2型為主)和弱毒疫苗(以血清型1a型或2型為主)。弱毒苗有毒力返強(qiáng)、加重豬群關(guān)節(jié)損傷等風(fēng)險(xiǎn)，效果常受到母源抗體和抗生素的影響。羅雪剛等[4]發(fā)現(xiàn)豬丹毒弱毒疫苗對(duì)現(xiàn)有的流行菌株缺乏較好的免疫保護(hù)作用。就安全性而言，滅活疫苗明顯優(yōu)于弱毒疫苗，且相對(duì)穩(wěn)定、可制備多聯(lián)苗，但存在免疫效力不足、免疫維持時(shí)間較短等問(wèn)題。此外，滅活疫苗質(zhì)量常受到菌種、抗原含量、滅活劑及佐劑等因素影響[5-6]。

本研究將3株受試菌株(AEr21、AEr31和AEr32)[7]在改良豬丹毒疫苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)至穩(wěn)定期，經(jīng)終質(zhì)量濃度為2mg/L的甲醛滅活11h后，用礦物油佐劑ISA201VG制備成滅活疫苗，與商品化疫苗分別免疫小鼠。通過(guò)檢測(cè)免疫小鼠血清IgG抗體、細(xì)胞因子(IL-4、IL-10、MCP-1、TNF-β、IFN-γ)、CD4+/CD3+和CD8+/CD3+T細(xì)胞亞群以及疫苗免疫后對(duì)攻毒小鼠的免疫保護(hù)率，確定受試菌株制備的滅活疫苗的免疫效果，從而為提高豬丹毒滅活疫苗的免疫效力、有效防治豬丹毒提供技術(shù)儲(chǔ)備。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株 受試菌株：從臨床病豬分離鑒定的42株豬丹毒絲菌，血清型均為1a型。首先通過(guò)小鼠100% 致死性試驗(yàn)(攻毒劑量為100 cfu/mL)篩選出4株強(qiáng)毒菌株；經(jīng)致病力試驗(yàn)、抗原性試驗(yàn)和穩(wěn)定性試驗(yàn)，進(jìn)一步篩選出3株用于制備疫苗的菌株，分別編號(hào)為AEr21、AEr31和AEr32(表1)。由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病研究室保存和提供。

攻毒菌株：編號(hào)為L(zhǎng)A 20130329，血清型為1a型，分離自臨床急性敗血型病豬，對(duì)小鼠的LD50為845 cfu/mL，由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病研究室保存和提供。依據(jù)豬丹毒絲菌標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)小鼠的LD50為50 cfu/mL，將LA 20130329確定為攻毒菌株，攻毒劑量設(shè)定為100LD50。

表1 3株受試菌株的背景資料Table 1 Background information of 3 strains for producing seedlings

1.1.2 商品化疫苗 豬丹毒弱毒疫苗(GC42株)購(gòu)自廣西麗原生物股份有限公司；豬丹毒滅活疫苗購(gòu)自浙江詩(shī)華諾倍威生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 試劑 36 g/L酵母浸膏胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基 (TSB-YE) 、 48 g/L 酵母浸膏胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基 (TSA-YE) 購(gòu)自紹興天恒生物科技公司；豬丹毒(疫苗)培養(yǎng)基購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)公司；MONTANIDE TM ISA 201 VG礦物油佐劑、葡萄糖購(gòu)自西隴化工公司；吐溫80、氫氧化鈉、氫氧化鋁均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醛購(gòu)自上海蘇懿化學(xué)試劑公司；三羥甲基氨基甲烷 (Tris) 購(gòu)自博奧拓達(dá)有限公司；細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)試劑盒(IL-4、IL-10、TNF-β、IFN-γ、MCP-1)購(gòu)自美國(guó) RB 公司；CD4+/CD8+流式細(xì)胞抗體試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 體質(zhì)量為18～22 g SPF級(jí)雌性昆明小鼠購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 滅活疫苗的制備 3株受試菌株(AEr21、AEr31、AEr32)在改良豬丹毒絲菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)至穩(wěn)定期后，經(jīng)終質(zhì)量濃度為2 mg/L甲醛37 ℃振蕩滅活(150 r/min)11 h，與礦物油佐劑 ISA 201 VG制備成滅活疫苗。經(jīng)無(wú)菌性檢驗(yàn)和安全性檢驗(yàn)合格后，與商品化疫苗以相同免疫程序免疫小鼠。

1.2.2 免疫小鼠分組 將140只小鼠隨機(jī)分成6組，A、B、C、D、E組，每組20只，F(xiàn)組40只，包括陰性對(duì)照組和攻毒對(duì)照組各20只，具體分組見(jiàn)表2。A、B、C組分別為AEr21全菌體滅活疫苗、AEr31全菌體滅活疫苗和 AEr32全菌體滅活疫苗；D、E組分別為商品化豬丹毒弱毒疫苗和商品化豬丹毒滅活疫苗；F組為生理鹽水對(duì)照組。免疫途徑均為皮下多點(diǎn)注射，劑量為0.2 mL(濃度為1.5×1010cfu/mL)。一免14 d后采用同樣方式和同等劑量進(jìn)行第 2 次免疫。

1.2.3 血清IgG抗體檢測(cè) 采集一免及二免 14 d后各組小鼠的血清，每組5只。參照文獻(xiàn)[8]，用純化的重組SpaA[9]包被酶標(biāo)板的ELISA方法進(jìn)行抗體檢測(cè)。同時(shí)用全菌體超聲裂解物包被酶標(biāo)板的ELISA方法進(jìn)行抗體檢測(cè)，用包被液將全菌體超聲裂解物稀釋成10 μg/mL，包被酶標(biāo)板4 ℃過(guò)夜。洗板 3 次后，50 g/L 的脫脂奶粉37 ℃封閉 2 h。洗板 3 次后，血清從1∶25 ～ 1∶819 200(2倍梯度進(jìn)行)加入板孔，37 ℃作用1 h。洗板 3 次后加入稀釋的羊抗鼠 HRP-IgG，反應(yīng) 1 h。洗板 3 次后加入TMB顯色液，室溫條件下避光靜置 10 min后加入終止液，輕輕振蕩后放于酶標(biāo)儀中測(cè)定 OD450。根據(jù)待檢血清OD(P)/陰性血清OD(N)≥ 2.1的界限判斷為陽(yáng)性，測(cè)定其抗體效價(jià)。

1.2.4 外周血CD4+、CD8+T 細(xì)胞亞群百分比測(cè)定 利用小鼠眼球摘除法，分別取一免及二免14 d后的小鼠外周血，每組5只。取100 μL的外周血放入2 mL的離心管中，再加入1.8 mL的細(xì)胞裂解液，利用掌上離心機(jī)1 500 r/min渦旋8～10 s，生物安全柜中靜置30 min。然后1 500 r/min離心5 min，輕輕拿起離心管，棄去上清液。分別在樣品管中加入2 mL滅菌PBS緩沖液(pH為7.4)，掌上離心機(jī)1 500 r/min 徹底渦旋8～10 s。建立陰性對(duì)照組和待檢測(cè)組。陰性對(duì)照共 4 組，第 1 組為不加染料組，另外3組分別加入CD3+、CD4+和 CD8+單一熒光染料；待檢測(cè)組加入CD3+、CD4+和CD8+3種熒光染料，避光靜置30 min。用1 mL的 PBS(pH為7.2)吹洗樣品，2 000 r/min 離心5 min后，加入滅菌的PBS調(diào)節(jié)細(xì)胞至105mL-1，轉(zhuǎn)移至流式細(xì)胞管中，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析數(shù)據(jù)。

1.2.5 血清細(xì)胞因子檢測(cè) 一免及二免14 d后，采集小鼠血清，每組5只。按照細(xì)胞因子(IL-4、IL-10、MCP-1、TNF-β、IFN-γ)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行各組小鼠血清中細(xì)胞因子含量的檢測(cè)。

1.2.6 免疫保護(hù)率測(cè)定 二免14 d后，將各組剩余的10只小鼠平均分成2組，一組采用腹腔注射方式攻毒小鼠，另一組采用灌胃方式攻毒小鼠。攻毒菌株為 LA 20130329，劑量為100 LD50，陰性對(duì)照組注射等量PBS。計(jì)算各組的免疫保護(hù)率，收集各組小鼠的內(nèi)臟(肝臟、脾臟、肺臟和腎臟)，置于福爾馬林(φ=10%的甲醛)中固定并保存。

1.2.7 病理組織切片制作 所有固定的小鼠內(nèi)臟(肺臟、肝臟、脾臟和腎臟)經(jīng)常規(guī)石蠟包埋、切片、蘇木精—伊紅染色等步驟，制備成病理組織切片，觀察各臟器的病理組織變化。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)的繪圖采用軟件Excel 2007和Graphpad 6.0制作，差異性統(tǒng)計(jì)采用 SPSS 20.0軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)LSD分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清IgG抗體檢測(cè)

采集一免及二免14 d后的各組小鼠血清，應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)小鼠血清中IgG抗體。用重組SpaA作為包被抗原，A、B、C、D、E組的二免抗體效價(jià)分別為1∶3 200、1∶6 400、1∶1 600、 1∶6 400、1∶3 200，B組和D組免疫小鼠產(chǎn)生的IgG抗體效價(jià)最高；用全菌體超聲破碎裂解物作為包被抗原，A、B、C、D、E組的二免抗體效價(jià)分別為 1∶3 200、1∶6 400、1∶3 200、1∶25 600和 1∶6 400，D組免疫小鼠產(chǎn)生的IgG抗體效價(jià)最高(表3)。

2.2 外周血CD4+、CD8+ T細(xì)胞亞群百分比檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 外周血CD4+細(xì)胞亞群在總T細(xì)胞中所占百分比 由圖1可知，各滅活疫苗免疫組CD4+/CD3+T細(xì)胞比率與對(duì)照組相比均顯著增加(P<0.05)。在A、B、C 3 組中，B組 CD4+/CD3+T細(xì)胞的比率最高，組間差異不顯著(P>0.05)。與商品化疫苗組相比，二免后D組 CD4+/CD3+T細(xì)胞比率最高，且與所有的滅活疫苗組差異顯著(P<0.05)。結(jié)果顯示，二免后，D組小鼠產(chǎn)生的 CD4+/CD3+T細(xì)胞比率高于其他疫苗組。

相同免疫后時(shí)間內(nèi)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，下同 Different lowercase letters in the same number of weeks after immunization indicate significant difference(P<0.05),the same below

圖1 小鼠外周血中CD4+細(xì)胞亞群在總T細(xì)胞中所占百分比
Fig.1 Percentage of CD4+Tsubsets in T cellsafter immunization of mice

2.2.2 外周血 CD8+細(xì)胞亞群在總T細(xì)胞中所占百分比 由圖2可知，在A、B、C 3 組中，B組CD8+/CD3+T細(xì)胞比率最高，但差異不顯著(P>0.05)。與商品化疫苗組相比，第2次免疫后D組的CD8+/CD3+T細(xì)胞比率最高，與C組差異顯著(P<0.05)，但與其他疫苗組差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果顯示，二免后，C組小鼠產(chǎn)生的CD8+/CD3+T細(xì)胞比率低于其他疫 苗組。

2.3 血清細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果

由圖3可知，各滅活疫苗組的小鼠血清中細(xì)胞因子質(zhì)量濃度與對(duì)照組相比均有所升高，且差異顯著(P<0.05)。在A、B、C 3 組中，B組細(xì)胞因子質(zhì)量濃度較高，但組間差異不顯著(P> 0.05)。二免后，IL-4和IL-10的質(zhì)量濃度，D組與A、C、E組差異顯著(P<0.05)；TNF-β的質(zhì)量濃度，D組與C組差異顯著(P<0.05)，其他各組間差異均不顯著(P>0.05)。結(jié)果顯示，各疫苗組均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的細(xì)胞因子，其中D組誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的細(xì)胞因子質(zhì)量濃度最高。

圖2 小鼠外周血中 CD8+細(xì)胞亞群 在總T細(xì)胞中所占百分比Fig.2 Percentage of CD8+ Tsubsets in T cells after immunization of mice

2.4 免疫保護(hù)率測(cè)定結(jié)果

二免14 d后，采用腹腔注射和灌胃2種方式對(duì)免疫后的小鼠進(jìn)行攻毒，結(jié)果見(jiàn)表4。陰性對(duì)照組(F組)所有小鼠全部死亡，B、D、E 3 組均具有良好的免疫保護(hù)水平，保護(hù)率為100%。

2.5 各臟器組織病理組織學(xué)觀察

2.5.1 肺臟 由圖 4 可以看出，A1、A3、A4、A6、A7和A8組均無(wú)明顯病理變化；A2組肺泡壁增寬，嚴(yán)重充血；A5組大量肺泡壁斷裂，充血嚴(yán)重；A9組大量肺泡壁斷裂，肺泡壁增寬且充血 嚴(yán)重。

2.5.2 肝臟 由圖 5 可以看出，B1組少量肝細(xì)胞發(fā)生變性、壞死，出現(xiàn)少量的肝吞噬細(xì)胞；B2組肝細(xì)胞發(fā)生空泡變性，部分細(xì)胞核消失，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；B3組少量肝細(xì)胞胞質(zhì)濃縮；B4組大量肝細(xì)胞胞質(zhì)濃縮，部分細(xì)胞核淡染、消失；B5組肝細(xì)胞發(fā)生壞死，大量炎性細(xì)胞發(fā)生浸潤(rùn)；B6組大量肝細(xì)胞胞質(zhì)濃縮，部分細(xì)胞核淡染、消失，出現(xiàn)少量的肝吞噬細(xì)胞；B7組少量肝細(xì)胞胞質(zhì)濃縮；B8組無(wú)明顯病理變化；B9組局部肝細(xì)胞壞死，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.5.3 脾臟 由圖 6 可以看出，C1組紅髓與白髓間隙不明顯，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；C2組充血嚴(yán)重，脾小體腫大，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；C3組大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；C4 組脾小體腫大，充血嚴(yán)重；C5 組脾小體腫大，紅髓與白髓間隙不明顯，充血嚴(yán)重；C6組少量充血，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；C7組充血嚴(yán)重，脾小體腫大；C8組無(wú)明顯病理變化；C9組充血嚴(yán)重，中央動(dòng)脈周?chē)?xì)胞疏松，脾小體腫大。

圖3 小鼠血清中細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Determination of cytokine levels after immunization of mice

組別Group感染數(shù)Number of infection感染途徑Routeof infection接種劑量Inoculatingdose死亡數(shù)Number of death死亡率/%Rate of death保護(hù)率/%Rate of protectionA5腹腔注射 Intraperitoneal injection100LD50120805灌胃 Gavage100LD5012080B5腹腔注射 Intraperitoneal injection100LD50001005灌胃 Gavage100LD5000100C 5腹腔注射 Intraperitoneal injection100LD50240605灌胃 Gavage100LD5000100D 5腹腔注射 Intraperitoneal injection100LD50001005灌胃 Gavage100LD5000100E5腹腔注射 Intraperitoneal injection100LD50001005灌胃 Gavage100LD5000100攻毒對(duì)照組 5腹腔注射 Intraperitoneal injection100LD5051000Challenge control5灌胃 Gavage100LD5051000陰性對(duì)照組5腹腔注射 Intraperitoneal injection等量 PBS Equal PBS00100Negative control5灌胃 Gavage等量 PBS Equal PBS00100

2.5.4 腎臟 由圖7可以看出，D1組腎小管上皮細(xì)胞腫脹；D2組腎臟充血嚴(yán)重，腎小囊上皮細(xì)胞腫脹；D3組腎小管上皮細(xì)胞腫脹；D4組腎小球上皮細(xì)胞腫脹、充血；D5組腎臟充血嚴(yán)重，腎小囊上皮細(xì)胞腫脹、充血；D6組腎小球上皮細(xì)胞腫脹、充血；D7組腎小管上皮細(xì)胞腫脹；D8組無(wú)明顯病理變化；D9組腎臟充血嚴(yán)重，腎小球上皮細(xì)胞腫脹、充血，腎小囊上皮細(xì)胞腫脹。

A1.A組存活小鼠 Surviving mice in group A；A2.A組死亡小鼠 Dead mice in group A；A3.B組存活小鼠 Surviving mice in group B；A4.C組存活小鼠 Surviving mice in group C；A5.C組死亡小鼠 Dead mice in group C；A6.D組存活小鼠 Survival mice in group D；A7.E組存活小鼠 Surviving mice in group E；A8.陰性對(duì)照組 Negative control group；A9.攻毒對(duì)照組 Drug attacking control group

圖4 各組小鼠肺臟病理學(xué)組織觀察(HE 染色， 200×)
Fig.4 Histopathological observation of lung in each group of mice(HE staining，200 ×)

B1.A組存活小鼠 Surviving mice in group A ；B2.A組死亡小鼠 Dead mice in group A；B3.B組存活小鼠 Surviving mice in group B；B4.C組存活小鼠 Surviving mice in group C ；B5.C組死亡小鼠 Dead mice in group C；B6.D組存活小鼠 Survival mice in group D；B7.E組存活小鼠 Surviving mice in group E；B8.陰性對(duì)照組 Negative control group；B9.攻毒對(duì)照組 Drug attacking control group

圖5 各組小鼠肝臟病理學(xué)組織觀察(HE 染色， 200×)
Fig.5 Histopathological observation of liver in each group of mice(HE staining，200×)

C1.A組存活小鼠 Surviving mice in group A；C2.A組死亡小鼠 Dead mice in group A；C3.B組存活小鼠 Surviving mice in group B；C4.C組存活小鼠 Surviving mice in group C；C5.C組死亡小鼠 Dead mice in group C；C6.D組存活小鼠 Survival mice in group D；C7.E組存活小鼠 Surviving mice in group E；C8.陰性對(duì)照組 Negative control group；C9.攻毒對(duì)照組 Drug attacking control group

圖6 各組小鼠脾臟病理學(xué)組織觀察(HE 染色，200×)
Fig.6 Histopathological observation of spleen in each group of mice(HE staining，200×)

D1.A組存活小鼠 Surviving mice in group A；D2.A組死亡小鼠 Dead mice in group A；D3.B組存活小鼠 Surviving mice in group B；D4.C組存活小鼠 Surviving mice in group C；D5.C組死亡小鼠 Dead mice in group C；D6.D組存活小鼠 Survival mice in group D；D7.E組存活小鼠 Surviving mice in group E；D8.陰性對(duì)照組 Negative control group；D9.攻毒對(duì)照組 Drug attacking control group

圖7 各組小鼠腎臟病理學(xué)組織觀察(HE 染色， 200×)
Fig.7 Histopathological observation of kidney in each group of mice(HE staining，200×)

3 討 論

豬丹毒作為一種老病新發(fā)的疾病，近年來(lái)在中國(guó)的廣州、云南、江蘇、安徽等地均有報(bào)道，在其他國(guó)家諸如美國(guó)、日本、加拿大等豬丹毒的檢出率也明顯增多[10]。從目前的感染情況來(lái)看，該病已從單純感染逐漸演變?yōu)閺?fù)雜的混合感染、繼發(fā)感染，導(dǎo)致臨床上豬群的發(fā)病率和死亡率明顯升高[11]。急性豬丹毒具有病程短、病死率高等特點(diǎn)，而抗生素的應(yīng)用存在藥物殘留、細(xì)菌耐藥性等弊端，使用率正逐年減少[12-13]。目前，疫苗免疫仍然是防控豬丹毒的首選。

疫苗能否刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性的體液免疫反應(yīng)，是用來(lái)評(píng)價(jià)疫苗免疫效果的重要指標(biāo)。IgG是介導(dǎo)體液免疫的主要抗體，在參與抗感染的過(guò)程中扮演重要角色[14]。良好的佐劑不僅有助于增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答能力，而且能夠使體內(nèi)產(chǎn)生的IgM完全轉(zhuǎn)換為IgG[15]。包被抗原的質(zhì)量對(duì)ELISA檢測(cè)抗體水平的靈敏度和特異性具有決定性影響。在豬丹毒絲菌滅活疫苗免疫刺激的抗體效價(jià)比較中，本研究采用全菌體超聲破碎裂解物和重組SpaA分別作為ELISA的包被抗原，在用重組SpaA作為包被抗原建立的ELISA檢測(cè)方法中，AEr31全菌體滅活疫苗組和商品化弱毒滅活疫苗組的抗體效價(jià)最高，均為 1∶6 400；而在用全菌體超聲破碎裂解物作為包被抗原建立的ELISA檢測(cè)方法中，商品化弱毒疫苗免疫組的抗體效價(jià)達(dá)到1∶25 600。原因可能有：(1)弱毒疫苗與滅活疫苗相比，可在體內(nèi)繁殖，因而可持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生較高水平的抗體；(2)SpaA蛋白是豬丹毒絲菌的主要保護(hù)性蛋白，說(shuō)明2種疫苗在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生主要保護(hù)性抗體效果相同，滅活疫苗在滅活過(guò)程中可能會(huì)使一些非保護(hù)性蛋白失去活性，因而在針對(duì)全菌體超聲破碎裂解物作為包被抗原建立的ELISA檢測(cè)方法中，抗體效價(jià)低于弱毒疫苗刺激產(chǎn)生的抗體效價(jià)。

細(xì)胞因子是一類(lèi)具有多功能的蛋白分子，在參與并介導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[16]。Th細(xì)胞是機(jī)體免疫應(yīng)答的啟動(dòng)細(xì)胞，它能夠促進(jìn)T細(xì)胞和B細(xì)胞的免疫應(yīng)答。Th1細(xì)胞(輔助性T細(xì)胞1)主要分泌TNF-β、IFN-γ、IL-2等，介導(dǎo)著細(xì)胞免疫和炎癥反應(yīng)；Th2細(xì)胞(輔助性T細(xì)胞2)主要分泌IL-4、IL-5、IL-10等，參與體液免疫。MCP-1作用于Th1和Th2的細(xì)胞分化。本研究結(jié)果表明，在豬丹毒絲菌滅活疫苗的免疫效果比較中，商品化豬丹毒弱毒疫苗組免疫小鼠后產(chǎn)生的Th1細(xì)胞明顯優(yōu)于滅活疫苗組(P>0.05)。T細(xì)胞是機(jī)體免疫應(yīng)答的核心細(xì)胞，通常檢測(cè)T細(xì)胞相應(yīng)的CD分子作為細(xì)胞亞群的測(cè)定指標(biāo)，一般CD3+作為T(mén)細(xì)胞的總數(shù)，CD4+代表Th細(xì)胞，CD8+代表Tc細(xì)胞(殺傷性T細(xì)胞)[15]。Tc細(xì)胞可在Th細(xì)胞的輔助下，發(fā)揮特異性殺傷或溶解靶細(xì)胞的功能，采用流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測(cè)T細(xì)胞可以了解各免疫組誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的細(xì)胞免疫。商品化豬丹毒弱毒疫苗組誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的CD4+/CD3+T細(xì)胞比率明顯高于滅活疫苗組，且差異顯著(P>0.05)。說(shuō)明商品化豬丹毒弱毒疫苗在迅速誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的啟動(dòng)方面優(yōu)于滅活疫苗。商品化豬丹毒弱毒疫苗組誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的CD8+/CD3+T細(xì)胞比率高于滅活疫苗組，且與AEr32全菌體滅活疫苗組差異顯著(P>0.05)，與其他滅活疫苗組差異均不顯著 (P>0.05)，除AEr32全菌體滅活疫苗外，其他所有疫苗均能誘導(dǎo)小鼠免疫系統(tǒng)特異性殺傷或溶解靶細(xì)胞。

豬丹毒絲菌主要是通過(guò)消化道或損傷皮膚引起機(jī)體產(chǎn)生局部或全身性的感染[17]。當(dāng)病原進(jìn)入機(jī)體后，在造成機(jī)體產(chǎn)生永久性病理性損傷的同時(shí)，也引起機(jī)體產(chǎn)生一系列的抵抗反應(yīng)行為。炎癥的本質(zhì)是機(jī)體在應(yīng)對(duì)病原菌入侵時(shí)引起損傷產(chǎn)生的一種防御性反應(yīng)[18]。本研究結(jié)果表明，由抗原所引起的特異性免疫細(xì)胞在誘發(fā)慢性炎癥中具有重要作用[19]。在免疫效力檢驗(yàn)過(guò)程中，本研究采用腹腔注射和模擬自然感染的灌胃2種方式對(duì)免疫后的小鼠進(jìn)行攻毒。2種攻毒方式的攻毒對(duì)照組的小鼠全部呈急性死亡且肺臟、脾臟、肝臟及腎臟充血嚴(yán)重，腎小球、腎小囊上皮細(xì)胞及脾小體腫脹，部分肝細(xì)胞壞死。AEr21全菌體滅活疫苗組和AEr32全菌體滅活疫苗組，腹腔攻毒的保護(hù)率分別為80%和60%，灌胃的保護(hù)率分別為80%和100%。病理組織切片觀察可見(jiàn)小鼠的肝細(xì)胞出現(xiàn)變性、壞死，產(chǎn)生少量的肝吞噬細(xì)胞(KCs)。KCs具有吞噬血液循環(huán)的抗原抗體復(fù)合物、清除肝血竇中的細(xì)菌以及清除衰老的紅細(xì)胞等作用[20]。KCs的產(chǎn)生是因?yàn)槊庖吆蟮男∈髾C(jī)體被病原菌刺激，增大KCs的體積，從而導(dǎo)致其數(shù)量上的增多。脾臟雖出現(xiàn)脾小體腫脹，但部分細(xì)胞核出現(xiàn)漸染的現(xiàn)象，這一現(xiàn)象說(shuō)明免疫小鼠的機(jī)體對(duì)組織損傷進(jìn)行一定的自我修復(fù)，經(jīng)修復(fù)后可恢復(fù)原組織的結(jié)構(gòu)和功能[9]。AEr31全菌體滅活疫苗組、商品化弱毒疫苗組和商品化滅活疫苗組對(duì)二種攻毒的保護(hù)率均為100%，且各臟器病理變化較輕，免疫效果較好。

本研究以3株豬丹毒絲菌制苗用菌株(AEr21、AEr31和AEr32)為受試菌株，礦物油佐劑ISA 201 VG作為制備滅活疫苗的免疫佐劑。在豬丹毒絲菌滅活疫苗的免疫效力研究中進(jìn)一步證實(shí)：(1)滅活疫苗的免疫效果與制苗用菌株的免疫原性有關(guān)。AEr31株制備的滅活疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的細(xì)胞免疫和體液免疫以及免疫保護(hù)率均最高，AEr31株制備的滅活疫苗的抗原性?xún)?yōu)于其他菌株。(2)滅活疫苗的質(zhì)量與抗原的質(zhì)量濃度以及免疫佐劑的性質(zhì)有關(guān)。在與商品化豬丹毒滅活疫苗的免疫效力比較中，AEr31全菌體滅活疫苗組誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的抗體水平和細(xì)胞因子水平優(yōu)于商品化豬丹毒滅活疫苗，對(duì)免疫后小鼠能提供100%的保護(hù)，AEr31全菌體滅活疫苗可作為防控豬丹毒的候選疫苗。(3)疫苗安全性是前提，免疫效力是關(guān)鍵[21]。在與豬丹毒弱毒疫苗免疫效果比較中，雖然弱毒疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫方面優(yōu)于滅活疫苗，但有研究報(bào)道，豬丹毒弱毒疫苗對(duì)于慢性型豬丹毒的效果較差，甚至?xí)哟筘i群感染關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險(xiǎn)，免疫的效果也常受到豬群母源抗體和抗生素干擾的影響[22]。而本研究結(jié)果可有助于提高豬丹毒滅活疫苗的免疫效果，也為豬丹毒有效防控提供技術(shù)儲(chǔ)備。