小窩蛋白-1在肝癌細(xì)胞及間質(zhì)中的表達(dá)及意義

陳甜 張燁瓊 吳藝鋒

原發(fā)性肝癌是發(fā)病率較高的四大惡性腫瘤之一，具有較高的死亡率和術(shù)后復(fù)發(fā)率。小窩蛋白-1(Cav-1)是細(xì)胞膜上的一種支架蛋白，在多種信號(hào)途徑中起重要調(diào)節(jié)作用，是機(jī)體維持正常生理功能所必需的。研究表明，Cav-1在腫瘤的進(jìn)展中扮演著重要的角色[1]。Cav-1的表達(dá)能夠激活腫瘤微環(huán)境，與腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。邱艷等[2]研究發(fā)現(xiàn)，Cav-1與肝臟損傷的發(fā)生有重要的關(guān)聯(lián)，其在肝臟損傷模型小鼠中的表達(dá)顯著上升。但就目前而言，Cav-1在肝癌細(xì)胞及其間質(zhì)的表達(dá)水平尚不明確。本研究選取80例肝癌及其癌旁組織標(biāo)本為研究對象，檢測其中Cav-1的表達(dá)情況，旨在分析其與肝癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

資料與方法

一、一般資料

80例肝癌及其癌旁組織標(biāo)本，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)診斷均符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2011年版)》標(biāo)準(zhǔn)[3]，且經(jīng)病理確診；(2)行治療性肝大部切除或部分切除術(shù)的原發(fā)性肝癌患者，獲得活體組織標(biāo)本；(3)術(shù)前均未行任何治療；⑷均簽署知情同意書；排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)復(fù)發(fā)性宮頸癌；(2)合并其他惡性腫瘤；其中男58例，女22例。年齡(58.12±7.85)歲。肝功能A級53例，B級27例。右半肝切除25例，左半肝切除27例，聯(lián)合兩個(gè)肝葉切除28例。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟的分類組織學(xué)分級Ⅰ級 0 例、Ⅱ級 16例、Ⅲ級 64 例。

二、方法

(一) 免疫組化的方法 將所取得的肝癌及癌旁組織經(jīng)10%甲醛溶液浸泡后采用石蠟包埋，制作切片，厚度為4 μm。選擇相應(yīng)的試劑盒行免疫組化染色，具體過程為：組織切片經(jīng)處理后與一抗孵育過夜，磷酸鹽(PBS)緩沖液沖洗3次，3 min/次。與生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG孵育30 min。隨后與過氧化氫酶標(biāo)記的鏈霉親和素室溫孵育15 min，PBS緩沖液沖洗3次，3 min/次。然后DBA(0.02%3,9-氨基聯(lián)苯胺的Tris-HCl溶液，pH 7.6)中染色5 min，經(jīng)蘇木精復(fù)染，無水乙醇脫水，二甲苯透明，封片后在顯微鏡(高倍鏡，×400)下觀察Cav-1的表達(dá)情況。

(二)陽性結(jié)果的判定 以已知陽性肝組織切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。以半定量的積分法判斷Cav-1的表達(dá)情況，由兩位病理醫(yī)師在雙盲的情況下進(jìn)行。分為陰性(0分)、弱陽性(1分)、強(qiáng)陽性(2分)三個(gè)等級，其中陰性為不著色，弱陽性為彌漫弱陽性，染色強(qiáng)陽性細(xì)胞數(shù)≤30%；強(qiáng)陽性為染色強(qiáng)陽性細(xì)胞數(shù)≥30%[3]。最終結(jié)果取兩位病理醫(yī)師的平均數(shù)，低表達(dá)0～1分，高表達(dá)1.5～2分?？笴av-1購自美國Cambridge公司，DBA試劑盒購自武漢博士德生物制藥有限公司，整個(gè)免疫組化過程嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行。

三、 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件。計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，Cav-1與各臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性采用spearman相關(guān)性檢驗(yàn)進(jìn)行。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、 Cav-1在肝癌細(xì)胞、癌旁細(xì)胞及其間質(zhì)中的表達(dá)情況

Cav-1在癌旁肝細(xì)胞中的表達(dá)主要在細(xì)胞質(zhì)，而在肝癌細(xì)胞膜和間質(zhì)均有所表達(dá)。Cav-1在間質(zhì)中的表達(dá)主要集中于血管壁。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，Cav-1在肝癌細(xì)胞中表達(dá)顯著高于癌旁組織，在肝癌間質(zhì)的表達(dá)明顯低于癌旁間質(zhì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 Cav-1在肝癌細(xì)胞、癌旁細(xì)胞及其間質(zhì)中的表達(dá)情況

二、Cav-1與肝癌實(shí)質(zhì)及間質(zhì)組織各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系分析

Cav-1在肝癌實(shí)質(zhì)中的表達(dá)與肝硬化、周圍器官侵犯、血管侵犯、癌栓形成有關(guān)(P<0.05)。見表2。Cav-1在肝癌間質(zhì)中的表達(dá)與最大徑，是否多發(fā)，是否有衛(wèi)星、周圍器官侵犯、血管侵犯、癌栓形成有關(guān)(P<0.05)。見表3。

討 論

小窩(caveolae)是一個(gè)直徑為50～100 nm的膜結(jié)構(gòu)，主要由細(xì)胞膜表面內(nèi)陷而形成，是各種信號(hào)分子和信號(hào)通道的“整合器”，是細(xì)胞膜生物功能的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。小窩(caveolin)是小窩結(jié)構(gòu)形成的重要蛋白，對小窩的形成至關(guān)重要，在細(xì)胞吞噬、脂類運(yùn)輸和代謝、細(xì)胞增殖、分化和凋亡方面有重要的生理功能，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4]。小窩蛋白被認(rèn)為是參與惡性轉(zhuǎn)化和惡性發(fā)展的關(guān)鍵因子。Cav-1能夠維持膽固醇的穩(wěn)態(tài)，在調(diào)控細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)(表皮生長因子受體、C反應(yīng)蛋白、Src家族酪氨酸激酶)中也有重要作用。Cav-1被認(rèn)為是抑癌基因或癌基因，其在一些腫瘤如乳腺癌、小細(xì)胞型肺癌中呈低表達(dá)，而在另一些腫瘤如食管癌[5]、前列腺癌、胰腺癌中呈高表達(dá)。

表2 Cav-1在肝癌實(shí)質(zhì)中的表達(dá)與各臨床病理 參數(shù)之間的關(guān)系分析

本研究通過檢測Cav-1在肝癌及其間質(zhì)中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，Cav-1在肝癌細(xì)胞中表達(dá)顯著高于癌旁組織(P<0.05)，這與劉振華等[6]研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果顯示，Cav-1與肝硬化、周圍器官侵犯、血管侵犯、癌栓形成有關(guān)(P<0.05)。這提示Cav-1與肝癌的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。Cav-1的表達(dá)可導(dǎo)致E-鈣黏素的減少，蔡曉曼等[7]研究表明，Cav-1可能通過調(diào)節(jié)E-鈣黏素的表達(dá)而影響食管癌的轉(zhuǎn)移，這也許可以解釋Cav-1 過表達(dá)的肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力提高。王冰等[8]研究結(jié)果顯示，原發(fā)性肝癌組織中Cav-1蛋白的表達(dá)顯著低于肝硬化組織。這可能與肝硬化導(dǎo)致肝結(jié)構(gòu)的紊亂，進(jìn)一步破壞血液循環(huán)，引起肝細(xì)胞缺血、缺氧有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，Cav-1與衛(wèi)星結(jié)節(jié)雖然無顯著相關(guān)性，但有正相關(guān)趨勢。張帥等[9]研究認(rèn)為，Cav-1能促進(jìn)肝星形細(xì)胞的增殖、遷移來修復(fù)肝癌損傷的肝細(xì)胞以及促進(jìn)肝組織再生。本研究未發(fā)現(xiàn)顯著性差異可能與癌細(xì)胞侵入到衛(wèi)星結(jié)節(jié)形成之間受到了其他因素的影響。本研究還發(fā)現(xiàn)，Cav-1在肝癌間質(zhì)的表達(dá)明顯低于癌旁間質(zhì)(P<0.05)。但Cav-1在間質(zhì)中的高表達(dá)與最大徑、是否多發(fā)、是否有衛(wèi)星、周圍器官侵犯、血管侵犯、癌栓形成有關(guān)(P<0.05)。Cav-1可能與腫瘤血管的形成有關(guān)，國外蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，Cav-1—/—的乳腺成纖維細(xì)胞可大量分泌促血管生成因子[10]。而本研究發(fā)現(xiàn)，Cav-1在間質(zhì)中的表達(dá)主要在血管壁上，其促進(jìn)肝癌的侵襲、遷移可能在一定程度上與其促進(jìn)間質(zhì)血管生成有關(guān)。本研究的局限之處在于，Cav-1表達(dá)與腫瘤進(jìn)展之間的關(guān)系及分子水平仍未明確，在下一步的研究中將著重進(jìn)行探討。

表3 Cav-1在肝癌間質(zhì)中的表達(dá)與各臨床病理 參數(shù)之間的關(guān)系分析