染色體微陣列分析技術(shù)在210例發(fā)育遲緩/智力低下患兒中的應(yīng)用

李 紅，童光磊，張 敏，鮑勁松，李司南，周陶成，易 昕，蔡云飛，董文旭，陳露露，康倩倩，陳 婧

發(fā)育遲緩/智力低下(developmental delay/intellectual disability,DD/ID)是一組在18周歲前發(fā)病，以認(rèn)知功能障礙和社會(huì)適應(yīng)能力缺陷為特征的疾病。一般人群中的發(fā)病率較高，為1%～3%[1]。DD/ID的病因較為復(fù)雜，主要包括非遺傳因素和遺傳因素[2]。近年來，國際臨床遺傳學(xué)會(huì)(international collaboration for clinical genoemics,ICCG)、國際標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞基因組微陣列(international standard for cytogenomic array,ISCA)學(xué)會(huì)以及美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(American college of medical genetics and genomics,ACMG)等將染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis,CMA)作為DD/ID患兒的一線臨床診斷方法[3-4]，染色體微陣列分析是近幾年迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)分子檢測(cè)技術(shù)，能覆蓋全基因組DNA，具有高通量、高分辨率、檢測(cè)速度快的特點(diǎn)。該研究對(duì)210例DD/ID患兒進(jìn)行了CMA檢測(cè)，以探討其在診斷、治療、預(yù)后、評(píng)估DD/ID患兒方面的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2016年1月1日～2018年8月30日在安徽省兒童醫(yī)院神經(jīng)康復(fù)科就診，被確診為DD/ID的210例患兒臨床資料，年齡在2月～10歲。入選標(biāo)準(zhǔn):① 采用以下測(cè)評(píng)量表測(cè)評(píng)：0～4歲使用蓋塞爾發(fā)育商量表中文修訂版(Gessell development scale)；4～6歲使用學(xué)前和學(xué)齡初期中國韋氏兒童智力量表(Chinese Wechsler preschool and primary scale intelligence，WPPSI)；>6歲使用中國韋氏兒童智力量表(Chinese Weehsler intelligence scale for children，C-WISC)；嬰兒初中學(xué)生社會(huì)生活能力量表；智力商數(shù)(intelligence quotient，IQ)/發(fā)育商數(shù)(developmental quotient，DQ)<70分，同時(shí)伴社會(huì)適應(yīng)性能力缺陷者診斷為智力低下?；純喊榛蛘卟话樯L遲緩等其他表現(xiàn)；② 排除顱內(nèi)出血、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、宮內(nèi)窘迫等影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的相關(guān)病史；③ 排除脆性X綜合征、苯丙酮尿癥、三體綜合癥等已知遺傳因素導(dǎo)致的智力低下。根據(jù)是否合并其他異常將DD/ID患兒分成2組，分別為單純性DD/ID組和合并其他異常組120例(合并癲癇、合并頭顱磁共振異常、合并心血管系統(tǒng)、合并多發(fā)結(jié)構(gòu)畸形)。所有家長接受檢測(cè)前遺傳咨詢及簽署知情同意書，該研究獲該中心醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本采集及處理 采集患兒靜脈血2 ml，EDTA抗凝管2～8 ℃保存運(yùn)輸，用于CMV檢測(cè)。

1.2.2基因組DNA提取 DNA提取試劑盒與提取儀(Lab-Aid820核酸提取儀)購自廈門致善生物科技有限公司；SNParay芯片及掃描儀購自美國Ilumina公司。

1.2.3染色體微陣列檢測(cè) 嚴(yán)格按照操作說明，應(yīng)用珀金埃爾默醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所用含有60 K寡核苷酸探針的CGX v1.1芯片進(jìn)行染色體片段重復(fù)/缺失檢測(cè)，應(yīng)用Iluminaiscan進(jìn)行芯片掃描、GenomeStudio軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。從軟件分析的結(jié)果中，選擇>100 kb的重復(fù)或缺失片段進(jìn)行下一步分析；對(duì)照原始圖像檢測(cè)假陽性和假陰性結(jié)果；除外在健康人群拷貝數(shù)變異(copynumbervariations,CNVs)多態(tài)性的片段；除外片段區(qū)域內(nèi)不包含基因的CNVs。查閱4種常用國際病理性CNV數(shù)據(jù)庫：ClinVar(htp://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)、Decipher(htps://decipher.sanger.ac.uk/)、OMIM(www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)和健康人群DGV數(shù)據(jù)庫(database of genomic variants, htps://projects.tcag.ca/variatin)，并檢查 PubMed數(shù)據(jù)庫相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)檢出的CNVs致病性進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，兩組率或多組率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CMA結(jié)果CMA分析顯示210例DD/ID患兒的基因組都存在CNVs，每例患者基因組含1～10個(gè)CNVs，片段大小50 kb～50 Mb不等，CMA在83例患兒中檢測(cè)到染色體拷貝數(shù)異常，檢出率為39.5%(83/210)。其中，檢出已知致病的常見微缺失/微重復(fù)綜合征66例(79.5%，66/83)，見表1；罕見綜合征1例(1.2%，1/83，Kleefstra綜合征)，見圖1?？梢芍虏∽儺惖奈⑷笔?微重復(fù)9例(10.8%，9/83)，可能良性變異1例(1.2%，1/83)，臨床意義不明6例(7.2%，6/83)。

2.2 分組及致病性CNVs的檢出率臨床患兒的表型并不單一，根據(jù)伴或不伴其他異常DD/ID患兒分為2組，單純性DD/ID組90例，復(fù)雜性DD/ID組120例(合并癲癇23例，頭顱磁共振異常36例，心血管系統(tǒng)19例、多發(fā)結(jié)構(gòu)畸形42例)。并對(duì)兩組檢出率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表2)。

3 討論

CMA能夠分析全基因組范圍的微缺失或微重復(fù)(<5 Mb)、雜合性缺失及單親二倍體等，目前已成為不明原因發(fā)育遲緩、智力障礙、多發(fā)先天性畸形等多種疾病的首選檢測(cè)技術(shù)[5]。目前越來越多的研究將CMA作為DD/ID患者的一線檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于臨床診斷中，但所用的平臺(tái)不盡相同，致病性CNVs檢出率也存在差異性。Coutton et al[6]應(yīng)用Human Genome CGH Microarray Kit 180K技術(shù)平臺(tái)對(duì)66例DD患者進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)致病性CNVs的檢出率為21%。王榮躍 等[7]應(yīng)用CytoScan750K對(duì)489例DD/ID患兒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示致病性CNVs的檢出率為25.8%。袁海明 等[8]應(yīng)用CytoScanHD(195萬CNV探針+75萬SNP探針)芯片對(duì)2 000例出生缺陷患兒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)致病性CNVs的檢出率為21.6%。本研究的210例DD/ID患兒結(jié)果顯示，致病性CNVs的檢出率為39.5%，檢出率高于國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，證明了CMA技術(shù)可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)核型分析技術(shù)和FISH技術(shù)的不足，提高微小致病性CNVs的檢出率。

表1 檢測(cè)出的臨床致病性微缺失/微重復(fù)綜合征在染色體的分布

圖1 1例罕見微缺失/重復(fù)綜合征的CMA結(jié)果圖

表2 210例患兒分組及致病性CNVs的檢出率[n(%)]

研究中67例致病性CNVs，66例(31.4%，66/210)為常見微缺失/微重復(fù)綜合征，陽性例數(shù)大于3例的為Angelman/Prader-Willi綜合征10例、22q13.3微缺失綜合征5例、佩梅病3例(Pelizaeus-Merzbacher disease，PMD)。Angelman/Prader-Willi綜合征多見兒童，表現(xiàn)為快樂表情、發(fā)育遲緩、語言障礙、孤獨(dú)內(nèi)向、智力兒童低下，癲癇發(fā)作；其臨床表現(xiàn)與染色體異常具有密切聯(lián)系，染色體15q11-q13區(qū)段的UBE3A基因異常是該病發(fā)生的主要因素，不同的突變類型有不同程度的表現(xiàn)，缺失片段的大小與表型具有相關(guān)性[9-10]。研究中Angelman/Prader-Willi綜合征中6例屬于單純組，4例屬于復(fù)雜組，說明并不是疾病復(fù)雜的發(fā)病率就高。PMD致病基因位于Xq22.2的PLPl基因，該基因缺陷可以導(dǎo)致髓鞘形成異常和(或)少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡，使得腦內(nèi)廣泛白質(zhì)區(qū)域髓鞘缺乏或減少是累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)的進(jìn)展性遺傳性疾病，頭顱MRI對(duì)本病診斷意義重大，可顯示為髓鞘化異常，T2加權(quán)像和Flair像彌漫性高信號(hào)[11]，研究的3例PMD均屬于合并磁共振異常組，建議臨床醫(yī)師對(duì)發(fā)育遲緩，頭顱MRI白質(zhì)異?；純阂懦瞬?，進(jìn)行基因芯片檢查。

檢出Kleefstra綜合征1例， Kleefstra綜合征是比較罕見的基因組學(xué)疾病，由染色體區(qū)域9q34.3(85%的病例)中的微缺失或由編碼的常染色質(zhì)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶1的EHMT1基因突變引起的[12]。本例患兒為12個(gè)月女孩，主要表現(xiàn)生長發(fā)育遲緩，智力低下，先天性心肌病，特殊面容不明顯。CMA在染色體9q34.3區(qū)段檢出190 Kb缺失，數(shù)據(jù)庫提示為Kleefstra綜合征。該綜合征患者在國內(nèi)尚未見報(bào)道，不僅豐富了Kleefstra綜合征基因型-表型譜，還為治療和預(yù)后評(píng)估提供了遺傳學(xué)依據(jù)。

本研究對(duì)單純性DD/ID組與復(fù)雜性DD/ID組致病性CNVs檢出率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明DD/ID的臨床表型具有多樣性，沒有特異性。

CMA仍具有局限性：① 無法檢測(cè)染色體的平衡性改變；② 無法檢測(cè)單基因病，進(jìn)一步高通量測(cè)序可彌補(bǔ)基因突變而導(dǎo)致的漏診。CMA可檢測(cè)出核型分析無法識(shí)別的微缺失/微重復(fù)綜合征，還具有發(fā)現(xiàn)新的可疑致病性基因的能力，但新發(fā)致病基因的確定要結(jié)合父母的DNA分析，本研究中不足點(diǎn)是沒有開展父母DNA的CMA檢測(cè)工作。CMA為DD/ID疾病的診斷、咨詢、治療、預(yù)后評(píng)估以及疾病的再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了遺傳學(xué)依據(jù)。