分子與血清學(xué)檢測確診2017年西非塞拉利昂1例猴痘病毒感染病例

宋敬東趙 莉張 益夏連續(xù)祝令偉任 嬌王文玲武桂珍田厚文譚文杰

猴痘是由猴痘病毒感染引起的急性人獸共患傳染病。猴痘病毒是一種基因組長達(dá)200 kbp 左右的DNA病毒，屬于痘病毒科正痘病毒屬，同一屬的病毒還包括天花病毒、牛痘病毒等[1]。猴痘病毒最早是1958年在哥本哈根的實驗猴體內(nèi)分離得到[2]，是一種重要的動物源性感染病原。人感染猴痘病毒后臨床癥狀主要表現(xiàn)為類似天花感染的早期發(fā)熱類癥狀，包括發(fā)熱、頭疼、乏力和皮膚出痘等。與天花感染者不同的是，猴痘感染病人有典型的淋巴結(jié)相關(guān)疾病，可以通過接觸感染者傷口和呼吸道傳播[3-4]。19世紀(jì)70年代以來，隨著天花病毒被消滅，已經(jīng)有不少猴痘病毒感染人類的病例報道。首個猴痘病毒感染人的病例是1971年民主剛果共和國發(fā)現(xiàn)并報道的，目前猴痘病例主要分布在非洲中、西部熱帶雨林地帶的國家。2003年，由于進(jìn)口了西非地區(qū)加納的野生動物，美國有47例猴痘病毒感染病例的報道[6]。近幾年在非洲，猴痘病毒感染病例常有報道，剛果(金)2013報道 104例病例，50例被確診，10例死亡。2016年9月4日至10月7日，WHO在中非報道了26例的確診病例。從2017年9月4日至12月9日，西非的尼日尼亞有172例疑似病例，其中有61例確診病例(http://www.who.int)。

2017年3月16日，在塞拉利昂南部普杰洪省，一位35歲的獵人出現(xiàn)發(fā)燒、身體疼痛、吞咽困難和淋巴結(jié)腫大。3月17日皮膚出痘，進(jìn)入當(dāng)?shù)蒯t(yī)院治療。分別于3月28日(出現(xiàn)癥狀后12 d)和5月10日(出現(xiàn)癥狀后55 d)，采集病人的血清進(jìn)行實驗室檢測。本文對該病人的血清樣本分別進(jìn)行核酸和血清學(xué)檢測，結(jié)合臨床學(xué)特征和病人野生動物接觸史，確診該病人為猴痘病毒感染。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1送檢樣本 疑似病人感染后第12 d、55 d血清，由塞拉利昂衛(wèi)生部采集并提供相關(guān)流行病學(xué)信息，樣本按不明原因發(fā)熱出疹送中塞友好生物安全實驗室進(jìn)行Zika與Ebola病毒檢測(檢測結(jié)果皆為陰性)。樣本滅活及核酸提取皆在塞拉利昂-中國友好生物安全三級實驗室操作。

1.1.2引物、探針與多肽 猴痘特異性引物是針對MPXV F3L 基因設(shè)計[7](D14L)，F(xiàn)3L-F290:5′-CTCATTGATTTTTCGCGGGATA-3′，F(xiàn)3L-R396:5′-GACGATACTCCTCCTCGTTGGT-3′，熒光標(biāo)記探針為F3Lp333S-MGB：5′-FAM-CATCAGAATCTGTAGGCCGT MGBNFQ-3′，由美國Applied Biosystems Inc合成。DNA提取試劑盒購自Qiagen公司，TaqMan Universal PCR Master Mix 購自Applied Biosystems Inc公司。猴痘特異性多肽(B21R-179-BSA, B21R-185-BSA)參考2005年文獻(xiàn)[8]，由中科亞光生物科技公司合成，純度大于90%。

1.1.3其他實驗材料 滅活的痘苗病毒由本科室利用143TK-細(xì)胞(ATCC)擴(kuò)增獲得，為痘苗病毒天壇株(TK+)來自衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所，批號7601。辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG、IgM抗體購自碧云天。96孔板、封閉液、樣本稀釋液、顯色液和終止液均購自北京索萊寶生物科技有限公司。痘苗病毒陽性血清(痘苗病毒天壇株實驗室感染者恢復(fù)期血清)和陰性血清(正常成年人體檢血清)由本科室提供和保存。

1.2 方 法

1.2.1利用real-time PCR對猴痘病毒核酸特異性檢測[7]按照QIAamp DNA Mini kit (Qiagen, USA)的說明書從200 μL 病毒血清中提取DNA。提取好的基因組放置于-70 ℃冰箱保存。實時定量 PCR在 Bio-rad公司的CFX96機(jī)器上進(jìn)行，程序如下:95 ℃,10 min，95 ℃，30 s，60 ℃，60 s，40個循環(huán)。 每個反應(yīng)重復(fù)2次，孔板對照的模板為水，陽性對照模板為含有該段基因的質(zhì)粒(本實驗室構(gòu)建)。

1.2.2正痘病毒IgG和IgM抗體檢測[8]用100 μL含有滅活的痘苗病毒的包被液(106PFU)包被96孔ELISA板，4 ℃過夜。以含有0.05% Tween、5%脫脂奶粉、2% BSA和2%山羊血清的PBS封閉ELISA板。將病人血清樣本以1∶50～1∶6 400進(jìn)行倍比稀釋后，按照每孔100 μL 加入ELISA板中，37 ℃反應(yīng)1 h。 PBST洗板拍干后，加入1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗人IgG或者IgM抗體，37 ℃反應(yīng)1 h。PBST洗板拍干后加入TMB底物顯色液，反應(yīng)5 min后加入終止液，用酶標(biāo)儀測定反應(yīng)板中每孔液體450 nm 處的吸光度值。將陰性對照的平均值的2.1倍定義為cutoff值，OD值大于或等于cutoff值判定為陽性。

1.2.3猴痘病毒IgG和IgM抗體檢測[8]用包被液稀釋猴痘特異性多肽(B21R-179-BSA, B21R-185-BSA)至500 ng/mL，100 μL/孔包被，4 ℃過夜。剩余步驟同正痘病毒IgG和IgM抗體檢測。

2 結(jié) 果

2.1流行病學(xué)史 2017年3月16日，一位塞拉利昂南部普杰洪省的35歲獵人出現(xiàn)發(fā)燒、身體疼痛、吞咽困難和淋巴結(jié)腫大。第2 d，皮膚出現(xiàn)痘狀水皰。在出現(xiàn)癥狀的10 d前，該病人曾去野外狩獵，并食用捕獲野生動物。經(jīng)過住院治療后，病人逐漸康復(fù)。當(dāng)?shù)蒯t(yī)院將16位曾有病人接觸史的居民，進(jìn)行隔離21 d觀察，沒有疑似感染癥狀出現(xiàn)。

2.2核酸檢測 于3月28日(SL-D12：出現(xiàn)癥狀后12 d)與5月10日(SL-D55：出現(xiàn)癥狀后55 d)，分別采集病人的血清進(jìn)行核酸提取以及猴痘特異性Real-time PCR檢測。結(jié)果如圖1所示，SL-D12的Ct值為35左右(3次實驗結(jié)果)，SL-D55的檢測結(jié)果為陰性。

2.3正痘病毒IgG和IgM檢測 正痘病毒IgM檢測結(jié)果，SL-D12血清進(jìn)行50～200倍稀釋后，IgM檢測為陽性；SL-D55樣本，50倍稀釋的IgM為陽性；而正痘病毒IgG檢測結(jié)果，50～800倍稀釋的SL-D12血清檢測結(jié)果均為陽性，而50～400倍稀釋的SL-D55血清檢測后均為陽性 (表1)。

2.4猴痘病毒IgG檢測 為了進(jìn)一步判斷是否為猴痘病毒特異性IgG，我們以猴痘特異性多肽作為抗原包被ELISA微孔板，檢測猴痘特異性IgG水平。50～800倍稀釋的SL-D12血清，猴痘IgG結(jié)果為陽性，而SL-D55血清稀釋至3 200倍，仍為陽性，提示55 d較22 d抗體滴度有4倍升高(表1)。

注：1.陽性對照；2. 樣本SL-D12；3.樣本SL-D55；每組均設(shè)置復(fù)孔圖1 疑似感染者血清中猴痘病毒核酸檢測結(jié)果Fig.1 Results of nucleic acid detection to Monkeypox virus of suspected patient

表1 疑似感染者血清ELISA檢測結(jié)果
Tab.1 ELISA results of sera samples from suspected patient

血清稀釋倍數(shù)痘苗病毒 IgM 痘苗病毒 IgG 猴痘病毒 IgG SL-D12 SL-D55SL-D12SL-D55SL-D12SL-D55505.222.684.834.7711.4314.261005.211.844.433.96 9.4113.572002.801.293.883.74 6.9711.864001.680.893.682.90 4.5911.048001.350.522.741.59 2.629.041 6000.760.581.520.57 1.846.463 200NDNDNDNDND2.816 400NDNDNDNDND1.34

ND: 未檢測。

3 討 論

猴痘病例主要分布在非洲中、西部熱帶雨林地帶的國家，美國2003年發(fā)生猴痘流行，共發(fā)現(xiàn)72例疑似病例，47例經(jīng)實驗室證實[6]，大部分病例可能是由于接觸了來自動物經(jīng)銷商的進(jìn)口非洲土撥鼠而感染的動物引起。這是首次發(fā)生在非洲大陸之外的猴痘流行，說明在全球一體的貿(mào)易和旅游時代，一些罕見的或外來的病原體可以跨越自然疫源區(qū)的地理界限而迅速蔓延。我國目前雖無猴痘輸入性病例，但在中西非的勞務(wù)及援外人員數(shù)以千計，且經(jīng)常往返，隨時有病例輸入的可能性。因此，我國應(yīng)該加強(qiáng)痘病毒鑒別診斷新技術(shù)儲備與研發(fā)，為應(yīng)對可能突發(fā)出現(xiàn)的猴痘病毒或其他危害嚴(yán)重的正痘病毒傳入與感染流行提供技術(shù)支持。

塞拉利昂是一個有超過七百萬人口的西非國家，1970年，塞拉利昂出現(xiàn)過1例的猴痘感染確診病例，之后數(shù)十年沒有病例的報道[9]。有研究對西非報道的猴痘病毒基因組進(jìn)行測序、進(jìn)化樹分析及地理分布模型的預(yù)測顯示，塞拉利昂的南部適合猴痘病毒的傳播[10]。1967-1968年起，為了消滅天花，在當(dāng)?shù)叵破鸫笠?guī)模的疫苗接種運(yùn)動，疫苗接種率達(dá)到了80%[11]。而疫苗的接種，會在接種者體內(nèi)產(chǎn)生抗正痘病毒的保護(hù)性抗體，持續(xù)數(shù)十年之久[12]。有文章通過血清學(xué)調(diào)查，報道了在塞拉利昂東南部人群中存在正痘病毒IgG和IgM陽性的血清，其中血清抗體陽性多為出生在天花疫苗接種之后，提示該地區(qū)存在正痘病毒區(qū)域流行情況[13]。

由于當(dāng)?shù)貧夂蜓谉?，?dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)水平和基礎(chǔ)設(shè)施較差，樣本的儲存和運(yùn)輸存在著困難，目前中塞友好生物安全實驗室也沒有條件進(jìn)行病毒分離實驗。利用二代測序技術(shù)研究猴痘病毒基因組已經(jīng)成為一種重要的實驗方法，猴痘病毒主要存在西非株和剛果株2個不同的基因型[14]。由于本研究得到的樣本質(zhì)量較差，通過二代測序，沒能獲得完整的猴痘病毒基因組全序列。下一步將利用特異性PCR方法，對在進(jìn)化樹上保守基因組區(qū)進(jìn)行序列擴(kuò)增克隆分析，研究其進(jìn)化情況。

猴痘病毒特異性IgG和IgM 血清學(xué)診斷方法一直存在困難，特別是cutoff值的確定[15]。本研究利用痘苗病毒作為抗原，進(jìn)行正痘病毒IgG和IgM檢測，結(jié)果顯示，二者均為陽性，而這是否因為患者曾經(jīng)接種過天花病毒，需要進(jìn)一步研究。猴痘病毒特異性多肽作為抗原包被，確定是否存在猴痘病毒特異性IgG和IgM，結(jié)果顯示在急性期(SL-D12)和恢復(fù)期(SL-D55)血清中，猴痘病毒特異性IgG存在超過4倍升高，且有良好的重復(fù)性(表1)。而猴痘病毒特異性IgM的方法重復(fù)性較差，這與文獻(xiàn)[8]報道的類似。由于國內(nèi)目前尚無猴痘感染病例，本實驗室建立的方法也存在不足之處，下一步需要更多的樣本進(jìn)行驗證。

本文首次應(yīng)用猴痘病毒核酸檢測和血清學(xué)檢測的方法確診了2017年西非塞拉利昂一例臨床疑似病人為猴痘病毒感染。同時，也采用猴痘病人感染樣本對本實驗建立的猴痘病毒檢測方法進(jìn)行了應(yīng)用驗證，下一步將繼續(xù)密切關(guān)注該地區(qū)猴痘病毒感染情況，不斷優(yōu)化完善猴痘病毒快速診斷與鑒定技術(shù)。