“從小便去之”對氣道黏液高分泌模型大鼠腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)和細胞因子的影響研究

許宗穎，石少華，于瀚，鐘相根

本研究價值：

“從小便去之”為仲景治療痰飲的重要法則之一，腎氣丸為仲景溫腎利水治療痰飲的代表方劑，本研究以腎氣丸（溫腎利水）、苓桂湯（化氣利水）、腎氣丸去苓桂（溫養(yǎng)腎氣）干預(yù)氣道黏液高分泌模型大鼠，探討三者對大鼠的干預(yù)作用，以腎素-血管緊張素-醛固酮（RASS）系統(tǒng)及細胞因子為切入點，探討溫腎/利小便治療氣道黏液高分泌的生物學機制，以期為臨床診療該疾病提供一種新的思路，為豐富和發(fā)展中醫(yī)藥治療肺系疾病做出有益的科學探索。

“凡食少飲多，水停心下，甚者則悸，微者短氣?！保?］微飲即水飲之微者。水入不化，上逆于肺，阻礙氣機，或見“短氣”。“短氣”即呼吸短促，類似于微喘、氣難以續(xù)接。“夫短氣有微飲，當從小便去之，苓桂術(shù)甘湯主之，腎氣丸亦主之”，仲景提出微飲的治療原則為“當從小便去之”，治以苓桂術(shù)甘湯或者腎氣丸，使微飲隨膀胱氣化而出［1］。

氣道黏液高分泌主要是由黏蛋白基因過度表達和黏液分泌細胞增多導致［2］，可出現(xiàn)咳嗽、咳痰、喘息、胸悶等氣道阻塞癥狀［3］，其臨床表現(xiàn)類似于“短氣，有微飲”。腎氣丸為仲景以利小便法治療痰飲的代表方劑，已被證實可應(yīng)用于痰飲咳喘、慢性阻塞性肺疾病、哮喘的治療［4-6］，但其干預(yù)作用與“從小便去之”的相關(guān)性尚未被報道。本研究以腎氣丸為例，結(jié)合經(jīng)典藥對苓桂，對腎氣丸、苓桂及其聯(lián)合用藥進行研究，從腎素-血管緊張素-醛固酮（RASS）系統(tǒng)和細胞因子的角度詮釋“夫短氣，有微飲，當從小便去之，苓桂術(shù)甘湯主之，腎氣丸亦主之”的部分生物學內(nèi)涵，為豐富和發(fā)展中醫(yī)藥治療肺系疾病做出有益的科學探索。

1 材料與方法

1.1 實驗時間 本實驗時間為2017年4—8月。

1.2 實驗材料

1.2.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量（180±20）g，合格證號：SCXK（京）2016-0002，由斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供。飼于室溫（25±0.5）℃，相對濕度（55±5）%；采用12 h/12 h明暗光照，自由攝食飲水。

1.2.2 實驗藥物 腎氣丸藥液：生地24 g，山藥12 g，茯苓12 g，桂枝9 g，澤瀉9 g，制附子3 g，吳茱萸12 g，丹皮12 g。苓桂湯：茯苓12 g，桂枝9 g。腎氣丸去苓桂湯：生地24 g，山藥12 g，澤瀉9 g，制附子3 g，吳茱萸12 g，丹皮12 g。上述藥物購于中國北京同仁堂（集團）有限責任公司。各方加水適量，煎煮前先浸泡40 min，每次煎煮20 min，共煎煮2次?；旌?次藥液，置于65 ℃恒溫水浴濃縮至100 ml/劑，滅菌后于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 主要試劑與儀器 丙烯醛（成都化夏化學試劑有限公司生產(chǎn)，CAS：107-02-8，北京百諾威生物科技有限公司提供），戊巴比妥鈉（美國Sigma公司），大鼠白介素（IL）-1β ELISA試劑盒（美國Abcam公司），IL-13 ELISA試劑盒（美國Rockland公司），轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-α ELISA試劑盒（美國LifeSpan Biosciences公司），腫瘤壞死因子（TNF）-α ELISA試劑盒（美國Enzo Life Sciences公司），自制動物霧化箱（200 cm×100 cm×50 cm），霧化器（402B，江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司），小動物肺功能測定儀（北京貝蘭博科技有限公司），全波長酶標儀（Multiskan MK3，美國Thermo公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組與模型制備 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，采用隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、腎氣丸組（溫腎利水）、苓桂組（化氣利水）、腎氣丸去苓桂組（溫養(yǎng)腎氣），每組12只。模型組、腎氣丸組、苓桂組、腎氣丸去苓桂組大鼠霧化吸入3 mg/L丙烯醛，3 h/次，2次/d，持續(xù)4周，進行造模，結(jié)束后各組任取2只做病理切片，光鏡觀察，出現(xiàn)纖毛粘連，杯狀細胞增生，肺泡間隔變薄或斷裂，可確定氣道黏液高分泌模型造模成功。正常組霧化吸入等量0.9%氯化鈉溶液。

1.3.2 干預(yù)措施 干預(yù)第5周開始，腎氣丸組給予腎氣丸藥液灌胃，苓桂組給予苓桂湯灌胃，腎氣丸去苓桂組給予腎氣丸去苓桂湯灌胃，均1 ml/100 g、2次/d、持續(xù)4周；正常組和模型組給予等量蒸餾水灌胃。給藥劑量參考人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表［7］。造模期間，模型組、腎氣丸去苓桂組各死亡2只大鼠，腎氣丸組、苓桂組各死亡1只大鼠。腎氣丸組和苓桂組由于相互攻擊分別死亡1只大鼠。實驗結(jié)束時5組各剩余8只大鼠。由于實驗條件有限，正常組隨機抽取8只大鼠進行后續(xù)實驗。

1.3.3 標本采集與指標檢測 取材前24 h，各組大鼠禁食，自由飲水，置于代謝籠中收集尿液，并統(tǒng)計24 h尿量。以0.3%戊巴比妥鈉（1 ml/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，自大鼠頸部切開，暴露氣管，在氣管軟骨間環(huán)剪開一小切口，從切口插入氣管插管，在切口下方用縫合線將氣管和氣管插管結(jié)扎緊，仰臥頭低位置于小動物肺功能測定儀的密閉體積描計箱內(nèi)，氣管插管一端與動物呼吸機相連。當大鼠呼吸時，肺的擴張和收縮改變了箱內(nèi)的壓力，通過測量箱內(nèi)氣體壓力的變化間接獲取肺容量的變化。自動記錄肺功能參數(shù)，包括第0.3秒用力呼氣末容積（FEV0.3）、用力肺活量（FVC）、第0.3秒用力呼氣末容積占用力肺活量百分比（FEV0.3/FVC%）、最大呼氣流量（PEF）。然后取出氣管插管，結(jié)扎右側(cè)肺門，采用聚乙烯導管行左主支氣管插管，導管插至左主支氣管分叉處，雙線結(jié)扎固定導管，用注射器緩慢灌入2.5 ml 4 ℃無菌0.9%氯化鈉溶液，同時稍微用力按摩胸部，以便灌洗充分，間隔1 min將肺泡灌洗液（BALF）回收，反復(fù)3次，回收約2.5 ml。將上述收集的BALF于低溫（4 ℃）下1 500 r/min離心10 min（離心半徑9.5 cm），吸取上清液2 ml，于-80 ℃凍存，分裝備用待ELISA法檢測。腹主動脈取全血，3 000 r/min離心15 min（離心半徑9.5 cm），抽取上層血清于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

采用ELISA法檢測BALF中IL-1β、IL-13、TGF-α、TNF-α和血清中外周血腎素活性（PRA）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、醛固酮（ALD）。按試劑盒說明書進行操作，選取6個合格樣品進行檢測。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較若方差齊則采用LSD-t檢驗，若方差不齊則采用非參數(shù)檢驗的Tamhane's T2法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠24 h尿量比較 各組大鼠24 h尿量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；模型組、腎氣丸組、苓桂組、腎氣丸去苓桂組大鼠24 h尿量高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；腎氣丸組、苓桂組、腎氣丸去苓桂組大鼠24 h尿量高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；苓桂組大鼠24 h尿量高于腎氣丸組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表1）。

2.2 各組大鼠肺功能參數(shù)比較 各組大鼠FEV0.3、FVC、FEV0.3/FVC%、PEF比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；模型組大鼠FEV0.3、FVC、FEV0.3/FVC%、PEF低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；苓桂組大鼠FEV0.3/FVC%低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；腎氣丸組、苓桂組、腎氣丸去苓桂組大鼠FEV0.3、FVC、PEF高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；腎氣丸組、腎氣丸去苓桂組大鼠FEV0.3/FVC%高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表2）。

2.3 各組大鼠BALF中IL-1β、IL-13、TGF-α、TNF-α比較 各組大鼠BALF中IL-1β、IL-13、TGF-α、TNF-α比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；模型組、苓桂組、腎氣丸去苓桂組大鼠BALF中IL-1β、IL-13、TGF-α、TNF-α高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；腎氣丸組大鼠BALF中TNF-α高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；腎氣丸組、苓桂組、腎氣丸去苓桂組大鼠BALF中IL-1β、IL-13、TGF-α、TNF-α低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；苓桂組、腎氣丸去苓桂組大鼠BALF中IL-1β、TNF-α高于腎氣丸組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表3）。

2.4 各組大鼠血清中PRA、AngⅡ、ALD比較 各組大鼠血清中PRA比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；各組大鼠血清中AngⅡ、ALD比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。模型組大鼠血清中AngⅡ、ALD高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；苓桂組、腎氣丸去苓桂組大鼠血清中ALD高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；腎氣丸組、苓桂組、腎氣丸去苓桂組大鼠血清中AngⅡ、ALD低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；腎氣丸去苓桂組大鼠血清中ALD高于腎氣丸組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表4）。

表1 各組大鼠24 h尿量比較（n=8，±s，ml）Table 1 24-hour urine volume in different groups

表1 各組大鼠24 h尿量比較（n=8，±s，ml）Table 1 24-hour urine volume in different groups

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與腎氣丸組比較，cP＜0.05

組別 24 h尿量正常組 8.63±2.06模型組 19.88±6.03a腎氣丸組 27.69±5.31ab苓桂組 35.13±8.90abc腎氣丸去苓桂組 28.80±9.01ab F值 18.068 P值 ＜0.001

表2 各組大鼠肺功能參數(shù)比較（n=8，±s）Table 2 Levels of pulmonary function parameters in different groups

表2 各組大鼠肺功能參數(shù)比較（n=8，±s）Table 2 Levels of pulmonary function parameters in different groups

注：FEV0.3=第0.3秒用力呼氣末容積，F(xiàn)VC=用力肺活量，F(xiàn)EV0.3/FVC%=第0.3秒用力呼氣末容積占用力肺活量百分比，PEF=最大呼氣流量；與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

PEF（ml/s）正常組 5.61±0.30 6.21±0.39 94.49±2.08 26.29±1.71模型組 3.73±1.30a 4.97±0.56a 83.72±5.20a 18.67±4.70a腎氣丸組 5.46±0.60b 6.13±0.84b 89.504±4.27b 25.75±1.68b苓桂組 5.37±0.70b 6.14±0.56b 88.73±6.41a 25.68±3.64b腎氣丸去苓桂組 5.43±0.77b 5.95±0.94b 89.24±7.39b 22.81±4.34b F值 7.623 4.863 4.046 8.831 P 值 ＜0.001 0.003 0.008 ＜0.001組別 FEV0.3（ml）FVC（ml）FEV0.3/FVC%（%）

表3 各組大鼠肺泡灌洗液中IL-1β、IL-13、TGF-α、TNF-α比較（n=6，±s，pg/ml）Table 3 Levels of IL-1β，IL-13，TGF-α，and TNF-α in the BALF in different groups

表3 各組大鼠肺泡灌洗液中IL-1β、IL-13、TGF-α、TNF-α比較（n=6，±s，pg/ml）Table 3 Levels of IL-1β，IL-13，TGF-α，and TNF-α in the BALF in different groups

注：IL=白介素，TGF=轉(zhuǎn)化生長因子，TNF=腫瘤壞死因子；與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與腎氣丸組比較，cP＜0.05

組別 IL-1β IL-13 TGF-α TNF-α正常組 498.18±133.56 8.53±3.05 37.20±9.66 14.47±1.91模型組 14 798.44±3 643.03a107.27±14.55a 84.25±8.05a 37.65±8.22a腎氣丸組 2 473.66±1 550.59b 15.05±3.99b 43.55±10.30b 22.78±3.77ab苓桂組 6 460.98±1 160.85abc 20.13±5.24ab 57.30±8.25abc 26.16±3.49ab腎氣丸去苓桂組 7 062.66±2 521.23abc20.48±5.10ab 58.30±10.36abc26.61±5.06ab F值 38.825 174.349 22.404 16.956 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表4 各組大鼠血清中PRA、AngⅡ、ALD比較（n=6，±s，pg/ml）Table 4 Levels of plasma PRA，AngⅡ，and ALD in different groups

表4 各組大鼠血清中PRA、AngⅡ、ALD比較（n=6，±s，pg/ml）Table 4 Levels of plasma PRA，AngⅡ，and ALD in different groups

注：PRA=外周血腎素活性，AngⅡ=血管緊張素Ⅱ，ALD=醛固酮；與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與腎氣丸組比較，cP＜0.05

組別 PRA AngⅡ ALD正常組 39.69±5.09 3 700.02±2 109.72 16.19±5.56模型組 45.57±4.58 13 537.64±2 220.04a 91.90±10.66a腎氣丸組 39.80±6.56 3 632.11±973.25b 20.56±3.15b苓桂組 43.98±10.20 4 467.87±1 300.66b 32.18±8.70ab腎氣丸去苓桂組 37.13±5.48 4 145.29±1 522.77b 40.11±8.01abc F值 1.591 38.421 32.173 P 值 0.208 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

氣道黏液高分泌是多種肺部疾病的共同病理表現(xiàn)，現(xiàn)已成為世界范圍發(fā)病率和死亡率較高的疾病之一［8］，目前對于該病的治療多以宣肺化痰為主?！胺蚨虤庥形嫞攺男”闳ブ吖鹦g(shù)甘湯主之，腎氣丸亦主之”為仲景治痰飲的代表性原文，文中指出治療微飲“當從小便去之”，具有深厚的理論基礎(chǔ)。如《金匱要略心典》云“氣為飲抑則短，欲引其氣，必蠲其飲”。“飲、水類也，治水必自小便去之，苓桂術(shù)甘，益土氣以行水”；“腎氣丸，養(yǎng)陽氣以化陰，雖所主不同，而利小便則一也”［9］?！陡咦⒔饏T要略》謂“腎氣丸溫下以蒸上，而化機亦下被，故小便亦利也”［10］。本研究中桂枝與茯苓相配即為仲景“利小便”藥對，全方溫陽化飲，行水降逆，痰飲下行，則邪從小便去之，通過對比腎氣丸組、苓桂組、腎氣丸去苓桂組各項指標的變化，探討溫養(yǎng)腎氣、化氣利水及二法合用對氣道黏液高分泌的干預(yù)機制。

本研究結(jié)果顯示，模型組、腎氣丸組、苓桂組、腎氣丸去苓桂組大鼠24 h尿量高于正常組，腎氣丸組、苓桂組、腎氣丸去苓桂組大鼠24 h尿量高于模型組，苓桂組大鼠24 h尿量高于腎氣丸組，證實3種方劑均可促進模型大鼠排尿，其中苓桂配伍利尿效果最為顯著。模型組大鼠FEV0.3、FVC、FEV0.3/FVC%、PEF低于正常組，苓桂組大鼠FEV0.3/FVC%低于正常組，腎氣丸組、苓桂組、腎氣丸去苓桂組大鼠FEV0.3、FVC、PEF高于模型組，腎氣丸組、腎氣丸去苓桂組大鼠FEV0.3/FVC%高于模型組，表明3種方劑對大鼠肺功能指標有不同的改善作用，腎氣丸、腎氣丸去苓桂對大鼠肺功能的改善優(yōu)于苓桂配伍。

現(xiàn)代研究表明，肺部炎癥可導致腎臟受損［11］，肺功能受損可引起腎病綜合征、尿頻等泌尿系統(tǒng)疾?。?2］。多種細胞因子、炎性遞質(zhì)參與調(diào)節(jié)黏液分泌，其中IL-1β、IL-13、TGF-α、TNF-α均是重要的氣道黏液高分泌相關(guān)細胞因子，且其之間存在協(xié)同效應(yīng)［13］。IL-1β能夠促進炎性反應(yīng)，可作用于環(huán)磷酸腺苷（cAMP）/激酶A（PKA）通路來上調(diào)黏蛋白5AC（MUC5AC）表達，增加黏液分泌［14］。IL-13可通過激活Janus激酶（JAK）/信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活蛋白6（STAT6）通路誘導STAT6的磷酸化，而磷酸化STAT6（p-STAT6）參與杯狀細胞化生，導致黏液分泌過多［15］。TGF-α可誘導c-Jun氨基末端激酶（JNK）-腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（TRAF2）活化，進一步上調(diào)MUC5AC的表達［16］。TNF-α可以通過介導TNF-α/核因子（NF）-κB通路調(diào)節(jié)MUC5AC表達，使氣道黏液分泌增加［17］。本研究結(jié)果顯示，模型組、苓桂組、腎氣丸去苓桂組大鼠BALF中IL-1β、IL-13、TGF-α、TNF-α高于正常組，腎氣丸組大鼠BALF中TNF-α高于正常組，腎氣丸組、苓桂組、腎氣丸去苓桂組大鼠BALF中IL-1β、IL-13、TGF-α、TNF-α低于模型組，苓桂組、腎氣丸去苓桂組大鼠BALF中IL-1β、TNF-α高于腎氣丸組，提示腎氣丸可以通過降低BALF中IL-1β、IL-13、TGF-α、TNF-α抑制氣道黏液分泌，可能通過調(diào)節(jié)細胞因子改善大鼠排尿。

氣道黏液高分泌可導致肺通氣功能的改變，引起缺氧和二氧化碳潴留。長期缺氧可引起血管收縮，循環(huán)血量減少，使腎上腺皮質(zhì)功能改變，分泌腎素，刺激RASS系統(tǒng)，使血清AngⅡ、ALD升高［18-19］。AngⅡ作為前炎性遞質(zhì)的調(diào)節(jié)者，可通過化學趨化作用使炎性細胞向組織募集；或者識別和直接激活浸潤的免疫活性細胞，參與炎性反應(yīng)，最終導致血管滲透性增加而激發(fā)炎癥過程［20-21］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中AngⅡ、ALD高于正常組，苓桂組、腎氣丸去苓桂組大鼠血清中ALD高于正常組，腎氣丸組、苓桂組、腎氣丸去苓桂組大鼠血清中AngⅡ、ALD低于模型組，腎氣丸去苓桂組大鼠血清中ALD高于腎氣丸組，提示腎氣丸可以明顯降低血清中AngⅡ、ALD，其通過抑制AngⅡ、ALD的生成而抑制RASS系統(tǒng)被激活，減少水液重吸收，增加排尿。腎氣丸抑制RASS系統(tǒng)被激活可能為“從小便去之”的作用環(huán)節(jié)之一。雖苓桂組大鼠血清中AngⅡ、ALD高于腎氣丸組，但無統(tǒng)計學差異，提示茯苓、桂枝配伍可能通過抑制RASS系統(tǒng)被激活而改善模型大鼠排尿。

綜上所述，腎氣丸在調(diào)控氣道黏液高分泌大鼠BALF中IL-1β、TGF-α方面優(yōu)于苓桂、腎氣丸去苓桂；溫養(yǎng)腎氣、化氣利水皆對氣道黏液高分泌大鼠具有一定的干預(yù)作用，二者合用則效果更佳，即所謂溫養(yǎng)腎氣和化氣利水之藥合用則舊飲易去而新飲不留。腎氣丸“從小便去之”改善氣道黏液高分泌模型大鼠癥狀可能與其改善肺功能、抑制RASS系統(tǒng)被激活、調(diào)節(jié)黏液高分泌相關(guān)細胞因子有關(guān)。本研究為“夫短氣有微飲，當從小便去之，苓桂術(shù)甘湯主之，腎氣丸亦主之”提供了實驗室依據(jù)，但其中的生物學機制尚有待進一步探討；“從小便去之”為氣道黏液高分泌的有效治療法則，為臨床治療氣道黏液高分泌提供了新的思路，具有進一步深入研究的意義。

作者貢獻：許宗穎、鐘相根負責文章的構(gòu)思與設(shè)計，進行可行性分析，撰寫并修訂論文；許宗穎、石少華、于瀚進行研究的實施與數(shù)據(jù)收集；鐘相根對文章整體負責，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。