白木香葉高效液相色譜分析方法的建立及其方法學(xué)考察Δ

陳建華，梁林源

(茂名市人民醫(yī)院藥劑科，廣東 茂名 525000)

白木香葉為瑞香科植物白木香[Aquilariasinensis(Lour.)Gilg]的非藥用部位，含有黃酮、揮發(fā)油、苷類及酚類等有效成分[1-4]，每年可采摘2次，產(chǎn)量大。楊曉娟等[5]利用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測定白木香葉中有效成分的含量，發(fā)現(xiàn)白木香葉富含芒果苷，提示今后應(yīng)深入開展對藥用植物非藥用部位的綜合開發(fā)和利用。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白木香葉的醇提取物具有降血糖、平喘及抗炎等作用，其效果與白木香藥材相當(dāng)，甚至略優(yōu)[6-11]。上述研究結(jié)果均表明了白木香葉的巨大開發(fā)利用價值，因此，建立白木香葉的指紋圖譜及質(zhì)量評價體系尤為重要。本研究旨在建立白木香葉HPLC分析方法并對其進行方法學(xué)考察，為白木香葉的指紋圖譜研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

HWS 24型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)；ME 204型萬分之一電子天平、MS 105型十萬分之一電子天平(METTLER TOLEOD公司)；安捷倫1200 RRLC型高效液相色譜儀[安捷倫科技(中國)有限公司]；Waters 2695/2988型高效液相色譜儀[沃特世科技(上海)有限公司]；Thermo U 3000型高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技公司)；KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

芒果苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111607-201704)；白木香葉(廣東君元藥業(yè)有限公司，批號：20180703)；乙腈、甲醇(色譜純，德國Merck公司)；磷酸、甲酸(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液：取白木香葉粉末0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇50 ml，稱定質(zhì)量，超聲(功率250 W，頻率40 kHz)提取40 min，放冷，用提取溶劑補足減失的質(zhì)量，搖勻，0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 對照品溶液：取芒果苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含芒果苷0.2 mg的溶液，即得。

2.2 色譜條件考察

2.2.1 色譜條件：色譜柱為Shiseido CAP Cell MGⅢ C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫(洗脫程序見表1)；流速為1.0 ml/min；檢測波長為280 nm；柱溫為30 ℃；進樣體積10 μl。

表1 白木香葉指紋圖譜分析的梯度洗脫程序Tab 1 The elution gradient of fingerprint analysis of aquilaria sinensis leaves

2.2.2 檢測波長考察：對供試品溶液進行全波長掃描，從其3D圖中選擇最佳檢測波長。在其他色譜條件不變的情況下，記錄供試品溶液不同波長下的色譜圖，見圖1。結(jié)果表明，在280 nm處，白木香葉中色譜峰信息量大，且各峰響應(yīng)值分布更均勻，最終選擇280 nm作為白木香葉指紋圖譜分析的波長。

A.供試品3D吸收圖；B.波長為280 nm；C.波長為300 nm；D.波長為330 nmA. 3D absorption diagram of the test sample; B. wavelength of 280 nm; C. wavelength of 300 nm; D. wavelength of 330 nm圖1 白木香葉供試品3D吸收圖及不同波長下的色譜圖Fig 1 3D absorption diagram of aquilaria sinensis leaves and chromatograms at different wavelengths

2.2.3 流動相系統(tǒng)考察：依次考察下列流動相系統(tǒng)分析供試品的效果。(1)甲醇(A)-水(B)；(2)乙腈(A)-水(B)；(3)甲醇(A)-0.1%磷酸水溶液(B)；(4)甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B)；(5)乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)；(6)乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)。流動相洗脫梯度：0～20～25～35 min，乙腈含量變化8%～40%～8%～8%。其他色譜條件不變的情況下，比較不同洗脫系統(tǒng)對白木香葉的分離效果，以譜圖的出峰數(shù)目多、峰分布均勻、峰分離效果好和基線平穩(wěn)為選擇標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明，采用流動相(5)乙腈-0.1%磷酸水溶液得到的供試品溶液的峰信息較多，基線較平穩(wěn)，分離度、峰形較好，故最終確定流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液，見圖2。

2.2.4 流動相梯度洗脫程序優(yōu)化：在其他色譜條件不變的情況下，考察不同梯度洗脫程序?qū)Π啄鞠闳~分離效果的差異(見表2)，以樣品譜圖出峰數(shù)目多、峰分布均勻，且主成分峰基本分開為選擇標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示，各梯度的出峰數(shù)目基本一致，但梯度6的基線平穩(wěn)，峰分布均勻，且主成分峰分開效果最佳，

圖2 白木香葉指紋圖譜分析-流動相系統(tǒng)考察色譜圖Fig 2 Fingerprint analysis of aquilaria sinensis leaves-investigation of the chromatogram of the mobile phase system

A.梯度1；B.梯度2；C.梯度3；D.梯度4；E.梯度5；F.梯度6A.gradient 1；B.gradient 2；C.gradient 3；D.gradient 4；E.gradient 5；F.gradient 6圖3 白木香葉指紋圖譜分析-流動相梯度優(yōu)化色譜圖Fig 3 Fingerprint analysis of aquilaria sinensis leaves-the optimized chromatogram of mobile phase gradient

表2 梯度洗脫程序考察Tab 2 Gradient elution procedures was investigated

故選擇梯度6，見圖3。

2.2.5 供試品溶液進樣體積的考察：在其他色譜條件不變的情況下，考察供試品溶液進樣體積分別為5、10、15及20 μl時對白木香葉分離效果的影響，以樣品色譜圖中峰的響應(yīng)度高且分離度好作為選擇標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示，不同進樣體積的色譜圖無明顯差異，隨著進樣體積的增加，各峰之間的分離效果逐漸降低，最終選擇進樣體積為10 μl，見圖4。

2.2.6 流速的考察：在其他色譜條件不變的情況下，考察供試品溶液洗脫流速分別為0.8、0.9、1.0、1.1及1.2 ml/min時對白木香葉分離效果的影響，以樣品譜圖出峰時間適中，主成分峰分離度高、分布均勻作為選擇標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示，當(dāng)流動相的流速為1.0 ml/min時，供試品的譜圖出峰時間適中，峰分離度較高、分布均勻，為最佳流速，見圖5。

2.2.7 色譜柱柱溫的考察：在其他色譜條件不變的情況下，考察柱溫分別為25、30及35 ℃時對白木香葉分離效果的影響，以期通過柱溫優(yōu)化進一步提高峰分離度。結(jié)果顯示，柱溫為20～30 ℃時，各主要色譜峰的分離度差異不大；結(jié)合實驗實際環(huán)境，最終選擇30 ℃作為最終的色譜柱溫，見圖6。

圖4 白木香葉指紋圖譜分析-進樣體積考察色譜圖Fig 4 Fingerprint analysis of aquilaria sinensis leaves-the chromatogram of different injection volume

圖5 白木香葉指紋圖譜分析-流速考察色譜圖Fig 5 Fingerprint analysis of aquilaria sinensis leaves-the chromatogram of different flow rate

圖6 白木香葉指紋圖譜分析-不同柱溫比較的色譜圖Fig 6 Fingerprint analysis of aquilaria sinensis leaves-the chromatogram of different column temperatures

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察：取白木香葉樣品，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，取等量洗脫溶劑作為空白供試品溶液。按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，空白供試品溶液在色譜條件下基本無吸收，對供試品的色譜分析無干擾，表明建立的方法專屬性好，見圖7。

2.3.2 儀器精密度考察：取白木香葉樣品，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液1份，連續(xù)進樣6次，按“2.2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2012版)進行全譜相似度分析。結(jié)果顯示，6張譜圖相似度均>0.996，主成分峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD均<3%，表明儀器精密度符合要求，見表3、圖8。

2.3.3 重復(fù)性考察：取同一批次白木香葉樣品(批號：20180703)，精密稱定6份，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液6份，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，6張譜圖相似度均>0.993，主成分峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD均<3%，表明方法的重復(fù)性符合要求，見表4、圖9。

圖7 白木香葉指紋圖譜分析-方法專屬性考察色譜圖Fig 7 Fingerprint analysis of aquilaria sinensis leaves-the chromatogram of specificity study

圖8 白木香葉指紋圖譜分析-儀器精密度考察色譜圖Fig 8 Fingerprint analysis of aquilaria sinensis leaves-the chromatogram of the investigation of instrument precision

表3 儀器精密度考察色譜圖的相似度Tab 3 Similarity of chromatograms investigated by instrument precision

2.3.4 穩(wěn)定性考察：取白木香葉樣品，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液1份，按“2.2.1”項下色譜條件，分別于放置0、2、4、8、12及24 h時進樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，6張譜圖相似度均>0.998，主成分峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD均<3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定，見表5、圖10。

表4 重復(fù)性考察色譜圖的相似度Tab 4 Similarity of chromatograms investigated by repeatability

2.3.5 方法耐用性考察：(1)不同色譜柱考察。取白木香葉樣品，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液1份，分別采用Phenomenex C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)、YMC-Triart C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)、Agilent Zorbax SB-Aq C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)和Shiseido CAP Cell MGⅢ C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，4張譜圖相似度均>0.992，表明本方法基本適用于不同的色譜柱，見表6、圖11。但考察結(jié)果提示，不同色譜柱的分離效果仍存在一定差異，Shiseido CAP Cell MGⅢ C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)的分析效果最好，建議指紋圖譜分析樣品時使用Shiseido CAP Cell MGⅢ C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)色譜柱。(2)不同儀器考察。取白木香葉樣品，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液1份，分別采用Waters 2695/2998型、Agilent RRLC 1200型和Thermo U3000型液相色譜儀，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，3張譜圖相似度均>0.995，表明本方法基本適用于不同的液相色譜儀分析，見表7、圖12。但考察結(jié)果提示，不同的儀器所得圖譜仍存在一定的差異，建議指紋圖譜分析樣品時固定使用同一臺液相色譜儀，減小儀器差異造成的樣品質(zhì)量評價誤差。

圖9 白木香葉指紋圖譜分析-方法重復(fù)性考察色譜圖Fig 9 Fingerprint analysis of aquilaria sinensis leaves-the chromatogram of the investigation of method repeatability

表5 穩(wěn)定性考察圖譜的相似度Tab 5 Similarity of chromatograms investigated by test stability

表6 不同色譜柱考察圖譜的相似度Tab 6 Similarity of chromatograms investigated by different columns

圖10 白木香葉指紋圖譜分析-供試品穩(wěn)定性考察色譜圖Fig 10 Fingerprint analysis of aquilaria sinensis leaves-the chromatogram of the investigation of test stability

方法學(xué)考察結(jié)果表明，本研究所建立的白木香葉HPLC分析方法能滿足方法學(xué)考察要求，且操作簡便，可應(yīng)用于白木香葉的HPLC指紋圖譜分析。

圖11 白木香葉指紋圖譜分析-不同色譜柱考察色譜圖Fig 11 Fingerprint analysis of aquilaria sinensis leaves-the chromatogram of the investigation of different columns

圖12 白木香葉指紋圖譜分析-不同儀器考察色譜圖Fig 12 Fingerprint analysis of aquilaria sinensis leaves-the chromatogram of investigation of different instruments

表7 不同儀器考察圖譜的相似度Tab 7 Similarity of chromatograms investigated by different instruments

3 討論

目前對白木香葉的研究主要集中在其化學(xué)成分上，對其有效成分的指紋圖譜研究很少。楊錦玲等[12]通過對國產(chǎn)沉香建立指紋圖譜研究，為其科學(xué)鑒定和質(zhì)量控制提供了依據(jù)。因此，建立白木香葉的指紋圖譜研究對其開發(fā)應(yīng)用具有指導(dǎo)意義。

本研究主要通過HPLC法建立白木香葉指紋圖譜分析方法并進行方法學(xué)考察，為白木香葉指紋圖譜研究提供依據(jù)，進一步為其鑒定及質(zhì)量控制提供標(biāo)準(zhǔn)。參照相關(guān)研究建立的沉香高效液相特征圖譜分析方法[13-15]，本研究分別對檢測波長、流動相系統(tǒng)、流動相梯度洗脫程序、供試品溶液進樣體積、流速及色譜柱柱溫進行考察，以確定最終的色譜條件；分別從專屬性、儀器精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及方法耐用性考察建立的分析方法，以確保白木香葉HPLC分析方法能夠滿足方法學(xué)考察需求。