UPLC-MS/MS同時測定土壤中19種植物激素方法的建立和驗證

盧玉秋，宋阿琳，唐治玉，李艷玲，董煒靈,3，王恩召，唐治喜，范分良*

（1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/農(nóng)業(yè)部植物營養(yǎng)與肥料重點實驗室，北京 100081；2 中國計量科學(xué)研究院，北京100029；3 中南大學(xué)，長沙 410083）

植物激素是植物體內(nèi)可自身合成的微量有機物，在非常低的濃度條件下就能參與并調(diào)控植物的生長、發(fā)育過程[1]。除植物外，微生物也能產(chǎn)生植物激素，如固氮螺菌[2]、土壤桿菌[3]、草生歐文氏桿菌[4]能夠分泌細胞分裂素，赤霉菌[5]、巴西固氮螺菌[6]能分泌赤霉素，豆包菌[7]、固氮螺菌[2]、根瘤菌[8]、土壤桿菌[9]能夠分泌生長素，這些微生物分泌的植物激素釋放到土壤中，共同參與調(diào)控植物的生長發(fā)育。由于土壤基質(zhì)成分復(fù)雜且土壤中植物激素含量極低，這在很大程度上增加了檢測的困難，前人關(guān)于土壤中植物激素的提取和檢測，大部分關(guān)注的只是一種或兩種植物激素，土壤中多種植物激素的快速提取及同時檢測鮮有報道，因此，土壤中植物激素的定性定量研究目前仍然是植物激素研究領(lǐng)域的難點之一。

植物中的激素最早使用生物鑒定法進行測定，它通過植物激素作用于植物組織或者器官后可產(chǎn)生生理生化變化，然后通過該變化的大小即可推算出植物激素的含量[10]，如Went建立的燕麥鞘彎曲測定法測定生長素[11]、Thimann和Bonner建立的燕麥葉鞘切斷伸長法測定生長素[12]等，生物測定法簡單，但靈敏度和選擇性較差[13]；隨后發(fā)展了免疫檢測法[14]，包括放射免疫分析和酶聯(lián)免疫法，免疫檢測法專一性強、選擇性和靈敏度高[15]，不過抗體容易發(fā)生交叉反應(yīng)，且制備抗體時間長[16]；之后發(fā)展了色譜法[17-18]，該方法具有高分離特性，能夠?qū)崿F(xiàn)多種植物激素的同時測定，但對樣品的前處理要求高，且對復(fù)雜基質(zhì)樣品定性定量存在誤差[19]；如今，色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[20-23]已經(jīng)逐漸發(fā)展成為植物激素檢測的主要方法[23]，它結(jié)合了色譜具有對復(fù)雜樣品的高分離能力和質(zhì)譜擁有的高靈敏度、高選擇性特點，大大提高了植物組織中激素檢測的靈敏度[24]，以及定性和定量的準確度[25]。相比之下，關(guān)于土壤中植物激素檢測報道則少得多[26-28]，目前檢測的方法主要集中在電化學(xué)法[29-30]、比色法[31]、免疫檢測法[27,32]和色譜法[33-35]。這些方法較色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)相比，操作步驟復(fù)雜，靈敏度更低，而且對復(fù)雜樣品基質(zhì)的定性定量常常不如人意[19]。少量采用色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的研究，大多采用過夜浸提，但關(guān)注的植物激素種類單一，以往的研究沒有成功的進行過土壤樣品依次提取從而同時測定多種植物激素的方法，因此，有必要探索同時檢測土壤中多種植物激素的方法，系統(tǒng)深入探明土壤植物激素的種類和含量。

本研究以中國科學(xué)院植物研究所試驗地玉米根際土壤為研究對象，以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)為研究手段，旨在建立和驗證一種能同時測定土壤中生長素類、細胞分裂素類、赤霉素類、脫落酸類、水楊酸類、茉莉酸類、獨腳金內(nèi)酯、油菜素內(nèi)酯8大類植物激素的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 Agilent1290超高效液相色譜儀、ABQtrap5500質(zhì)譜儀，質(zhì)譜儀配置有電噴霧電離接口及Analyst數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；超聲波清洗儀；賽默飛RC10-22T真空離心濃縮機；Sigma3k15離心機；Mettler Toledo電子天平 (0.001 g)；0.22 μm尼龍針頭濾器。

1.1.2 試劑 甲酸為分析純，異丙醇、二氯甲烷、乙腈、甲醇為色譜純 (購自北京萬誠博達科貿(mào)有限公司)；實驗室用水產(chǎn)自Milli-Qplus超純水機；脫落酸(ABA)、赤霉素 (GA3)、茉莉酸 (JA)、吲哚-3-乙酸(IAA)、反式玉米素 (tZ)、玉米素核苷 (tZR)、異戊烯基腺嘌呤 (IPR)、吲哚-3-丁酸 (IBA)、N6-異戊烯基腺嘌呤 (IP)、獨腳金內(nèi)酯 (SL)、玉米素 (cZ)、二氫玉米素核苷 (DZR)、吲哚-3-丙酸 (IPA)、吲哚-3-乙酸甲酯(MeIAA)、水楊酸 (SA)、二氫玉米素 (DZ)、吲哚-3-羧酸 (ICA)、茉莉酸甲酯 (MeJA)、油菜素內(nèi)酯 (BL)(購自 OlChemImLtd，Olomouc，Czech Republic)。

1.2 植物激素提取

供試土壤為中國科學(xué)院植物研究所試驗地玉米根際土壤，其化學(xué)性質(zhì)如下：有機質(zhì)11.55 g/kg，全氮0.68 g/kg，全磷0.57 g/kg，硝態(tài)氮16.71 mg/kg，銨態(tài)氮6.99 mg/kg，速效磷42.78 mg/kg，有效鉀65.64 mg/kg，pH為7.61。

提取步驟如下：1) 準確稱取0.5 g (精確到0.001 g) 保存于-20℃冰箱的根際土壤樣品于50 mL離心管；2) 加入5 mL異丙醇∶水∶甲酸(80∶19∶1，V/V/V)；3) 在渦旋儀上渦旋30 s；4) 用超聲波清洗儀于常溫、100 W條件下超聲30 min；5) 加入1 mL二氯甲烷，繼續(xù)用超聲波清洗儀于常溫、100 W條件下超聲30 min；6) 于9000 rpm、4℃的條件下離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管；7) 在常溫條件下用真空離心濃縮機對上清液進行離心濃縮；8) 用300 μL甲醇進行復(fù)溶；9) 復(fù)溶液過0.22 μm尼龍針頭濾器，得到植物激素待測液；10) 采用UPLC-MS/MS法測定植物激素。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：Waters ACQUITYUPLC ? HSS T3色譜柱 (2.1 mm × 150 mm，1.8 μm)；分別以 0.30 mmol/L甲酸銨水溶液 (含0.01%甲酸) 作為流動相A和0.30 mmol/L甲酸銨乙腈 (含0.01%甲酸) 作為流動相B；進樣量5 μL，流速0.30 mL/min，柱溫30℃，梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

質(zhì)譜條件：離子源采用電噴霧離子源；掃描方式分別進行正/負離子模式掃描；檢測方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測 (MRM)；氣簾氣壓 (CUR) 20 Psi；碰撞氣壓 (CAD) medium；噴霧電壓 (IS) 5500 V/-4500 V；離子源溫度550℃；霧化氣壓 (GS1) 20 Psi；輔助氣壓 (GS2) 0 Psi；流速 0.30 mL/min。

1.4 定性與定量分析

對玉米根際土壤植物激素提取液進行濃縮、復(fù)溶、過濾后，采用UPLC-MS/MS法進行檢測，以各植物激素標準品的定性離子對 (m/z) 及對應(yīng)的的保留時間(RT)作為依據(jù)進行定性分析，以各植物激素標準品的定量離子對 (m/z) 所對應(yīng)峰面積進行定量，并采用外標法計算回收率。測試設(shè)置5個重復(fù)，實驗數(shù)據(jù)用Excel2010及Origin8.5軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件

本試驗選擇Waters ACQUITYUPLC ? HSS T3反相色譜柱來分離各植物激素，分別以0.30 mmol/L甲酸銨水溶液 (含0.01%甲酸) 作為流動相A和0.30 mmol/L甲酸銨乙腈 (含0.01%甲酸) 作為流動相B，最后采用上述1.3所述的梯度洗脫程序，實現(xiàn)了19種植物激素的完全分離。圖1為19種植物激素標準溶液正、負離子掃描模式總離子流圖(TIC)，其中(a)、(b) 分別為正離子、負離子掃描模式TIC圖。

圖1 19種植物激素標準溶液正離子 (a)、負離子 (b) 模式總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram (TIC) of 19 phytohormones standard solutions with positive and negative ions scan mode

2.2 質(zhì)譜條件

首先，配制濃度為300 ng/mL的單一標準溶液，采用流動注射的方式，以流速為7 μL/min將單一標準溶液注入離子源，在質(zhì)荷比m/z 100～500范圍內(nèi)進行掃描，在電噴霧離子源 (ESI)下分別進行正離子模式 (+) 和負離子模式 (-) 全掃描，以確定各標準物質(zhì)的分子離子峰和最佳的電離方式。結(jié)果表明，在電噴霧正離子掃描模式下，JA、IAA、tZ、tZR、IPR、IBA、IP、SL、cZ、DZR、IPA、MeIAA、DZ、ICA、MeJA、BL全掃描的分子離子[M + H]+較理想；在電噴霧負離子掃描模式下，ABA、GA3、SA全掃描的分子離子[M - H]-較理想。然后再進行子離子峰 (Product MS2) 掃描，不斷的調(diào)節(jié)碰撞能量(CE)，以確定各標準物質(zhì)合適的子離子峰，最后進行多反應(yīng)離子監(jiān)測掃描 (MRM)，分別對19種植物激素的去簇電壓 (DP)、碰撞能量 (CE)、入口電壓(EP)、碰撞室出口電壓 (CXP) 進行優(yōu)化，使信號達到最佳的響應(yīng)值。19種植物激素標準物質(zhì)優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2.3 方法的標準曲線、濃度范圍、線性方程及檢出限

首先取配制好濃度為500 ng/mL的混合標準溶液，依次稀釋配制成系列濃度為0.2、0.5、1、5、10、20、50、100 ng/mL的混合標準溶液，采用UPLC-MS/MS進行檢測，以植物激素濃度為x軸，所對應(yīng)的峰面積為y軸，繪制標準曲線，并進行線性回歸，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù) (r)，以信噪比(S/N) 為3確定化合物的檢出限 (LOD)。結(jié)果表明，tZ、SL、cZ、MeIAA、DZ在0.2～100 ng/mL的濃度范圍內(nèi)線性良好，tZR、IPR、IBA、DZR在0.5～100 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，ABA、GA3、IAA、IP、IPA在1～100 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，SA、ICA、BL在5～100 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，JA、MeJA在10～100 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，r均大于0.99，LOD介于0.02～1.06 ng/g之間(表3)。

表2 19種植物激素優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Optimized mass spectrometric parameters of 19 phytohormones

續(xù)表2 Table 2 continued

2.4 方法的回收率和精密度

為了考察實驗方法的重現(xiàn)性以及準確度，分別向玉米根際土壤樣品中添加低、中、高3種不同濃度的混合標準溶液，每個添加水平設(shè)置5個平行實驗，并按照優(yōu)化后的實驗方法進行處理，最后通過計算方法的相對標準偏差(RSD)和加標回收率來衡量其精密度和準確度 (表4)，表中未加標濃度為土壤基質(zhì)樣品中含有的植物激素。在3種不同濃度的添加水平下，玉米根際土壤中19種植物激素的回收率介于70.2%～117%之間，精密度介于0.2%～7.3%之間。

表3 19種植物激素的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢測限Table 3 Linearity, correlation coefficient and detection limits of 19 phytohormones

表4 19種植物激素在土壤中的回收率和相對標準偏差 (n= 5)Table 4 Recovery rate and relative standard deviation of 19 phytohormones in soil

續(xù)表4 Table 4 continued

2.5 實際土壤樣品測定

利用優(yōu)化后的實驗方法對玉米根際土壤植物激素進行測定，對同一份土樣設(shè)置5個重復(fù)，測定結(jié)果表明：玉米根際土壤樣品中檢測出IAA、MeIAA、ICA、SL、SA 5種植物激素，含量分別為1.85 ±0.05、0.55 ± 0.00、5.79 ± 0.15、0.69 ± 0.00、3.94 ±0.50 ng/g。

3 討論與結(jié)論

目前，關(guān)于植物激素的前處理方法，大多采用有機溶劑過夜浸提，重復(fù)浸提2～3次，并用固相微萃取小柱進行純化，最后上機檢測，這些方法前處理耗時長，采用固相微萃取小柱純化雖然能夠凈化樣品中的部分雜質(zhì)，但是這種基于除雜的凈化方法往往還會產(chǎn)生較大的基質(zhì)效應(yīng)[36]，而且采用固相萃取小柱純化不僅需要找到合適的清洗液以及洗脫液，此外活化、平衡、清洗、洗脫過程也很繁瑣，損失也大，難以保證多種植物激素的回收率。本文的方法前處理不需要過夜浸提，而且加入二氯甲烷，離心濃縮復(fù)溶后不需要通過固相萃取柱即可直接進樣分析檢測，可以達到理想的分離效果，大大縮短了樣品的前處理時間。

土壤中植物激素的檢測方法從化學(xué)法[29-30]、酶聯(lián)免疫法[28,32]、色譜法[33-35]到色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[37]，測試的靈敏度逐漸變高、專一性逐漸增強、準確度逐漸提高。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是近幾年發(fā)展起來的測定植物激素的新方法[38]，它結(jié)合了色譜的高分離性能及質(zhì)譜的高靈敏度特性，大大提高了檢測的靈敏度[24]，可實現(xiàn)多種植物激素的同時檢測。與氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用相比，UPLC-MS/MS可避免樣品分析中繁瑣的衍生化過程[39]。與氣相色譜及液相色譜法相比，UPLC-MS/MS能減少或消除色譜當(dāng)前由于工作原理的不同可能存在的定性錯誤，提高植物激素定性及定量的可靠性[40]。與免疫法相比，UPLC-MS/MS可避免分析過程中抗體產(chǎn)生的交叉反應(yīng)對結(jié)果產(chǎn)生的影響及放射性物質(zhì)對實驗人員身體造成的危害[16]。與化學(xué)法相比，UPLC-MS/MS靈敏度更高，選擇性更強，能夠檢測出土壤中存在且濃度更低的植物激素。綜上，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法能為土壤中多種植物激素的同時檢測提供一種更為簡便、快速、準確的方法。

本研究建立了土壤中多種植物激素的提取及其超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定法，并測定了土壤中8大類植物激素，最后檢測出IAA、ICA、MeIAA、SA、SL 5種植物激素，含量在0.55～5.79 ng/g之間，本方法前處理不需要過夜提取，大大縮短了樣品的前處理時間，方法的檢測限介于0.02～1.06 ng/g之間，回收率為70.2%～117%，精密度介于0.2%～7.3%之間，該操作簡單、靈敏度高、選擇性好，適用于土壤中多種植物激素的同時檢測。