蚓糞減輕蘋果砧木平邑甜茶幼苗連作障礙的土壤生物學(xué)機(jī)制

潘鳳兵，王海燕，王曉芳，陳學(xué)森，沈 向，尹承苗，毛志泉

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院/作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018）

蘋果連作障礙又叫蘋果再植病 (apple replant disease，ARD)，是蘋果重茬栽培時(shí)發(fā)生的綜合病癥[1-2]。生產(chǎn)上克服連作障礙的方法主要有合理的輪作、間作和套種、土壤消毒、添加有機(jī)物料、抗性育種和生物防治等方法[3-5]。但傳統(tǒng)的單一防治方式均有一定的局限性，不能及時(shí)有效地改善連作狀況。因此，尋找緩解和克服蘋果連作障礙簡(jiǎn)單有效的防控技術(shù)，對(duì)蘋果產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有十分重要的意義。

大量研究表明，添加土壤改良劑可以緩解連作障礙的發(fā)生，其中有機(jī)物料和蚓糞有效降低了連作障礙的危害[6-9]。袁玉娟等[10]研究表明，使用不同生物有機(jī)肥可顯著降低黃瓜土傳枯萎病的發(fā)病率，降低病原真菌對(duì)根系的侵染，提高黃瓜生物量。田給林等[11]發(fā)現(xiàn)，蚯蚓糞與牛糞和無機(jī)肥料相比具有顯著的生物活性。在草莓連作土壤滅菌后施用具有生物活性的蚯蚓糞，可以促進(jìn)根系生長，緩解土壤滅菌對(duì)草莓植株生長發(fā)育的影響。趙鳳艷等[12]認(rèn)為通過蚓糞處理番茄連作土壤可提高土壤養(yǎng)分含量，顯著降低優(yōu)勢(shì)真菌相對(duì)豐度，從而緩解番茄連作障礙。蚓糞作為一種植物有機(jī)營養(yǎng)物料，幾乎具備了植物生長所需的全部有益因素，施入蚓糞后在提高土壤有機(jī)質(zhì)、全碳和全氮的基礎(chǔ)上，對(duì)真菌也有一定的抑制作用。也有研究發(fā)現(xiàn)，施用蚯蚓糞后，土壤中的微生物總量和微生物量氮均有所提高，同時(shí)也促進(jìn)了土壤酶活性的提高[13]。目前國內(nèi)外關(guān)于蚓糞防治連作障礙的研究主要集中在蔬菜等領(lǐng)域。大量研究結(jié)果表明，蚓糞可有效降低蔬菜連作所造成的危害，而蚓糞對(duì)蘋果連作障礙的影響及作用機(jī)理尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)以蘋果栽培中的常用砧木平邑甜茶為試材，探討蚓糞對(duì)蘋果連作障礙的防控效果及其作用機(jī)理，以期為有效防治蘋果連作障礙提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試蘋果連作土壤取自山東省泰安市滿莊鎮(zhèn)25年生的紅富士老果園，砧木為八棱海棠 (Malus robustaRehd.)。土壤類型為棕壤，土壤pH值為6.2、有機(jī)質(zhì)含量為9.35 g/kg、速效磷含量為15.9 mg/kg、速效鉀含量為152 mg/kg、銨態(tài)氮含量為13.1 mg/kg、硝態(tài)氮含量為7.68 mg/kg。

供試材料為平邑甜茶 (Malus hupeheusisRehd.) 實(shí)生苗。供試蚓糞為大平1號(hào)蚯蚓 (Eisenia foetida) 糞便，有機(jī)質(zhì)含量為261.1 g/kg、速效磷含量為1348 mg/kg、速效鉀含量為3732 mg/kg、銨態(tài)氮含量為1208 mg/kg、硝態(tài)氮含量為840.8 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2016年12月至2017年12月在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院國家蘋果中心實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行。試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理：連作土對(duì)照 (CK)、連作土滅菌 (TM)、連作土施蚓糞 (YF)、連作土施滅菌蚓糞(MYF)。連作土及蚓糞滅菌均采用高壓蒸汽滅菌法，蚓糞與滅菌蚓糞的施用量為土壤總體積的20%[11,14]。

幼苗移栽前分別處理連作土壤并裝盆 (試驗(yàn)用盆采用上部內(nèi)徑25 cm，盆底內(nèi)徑17 cm，高18 cm的花盆)，每個(gè)處理20盆，每盆裝供試土壤6.5 kg。幼苗長到3片真葉時(shí)，選取三棵長勢(shì)一致的幼苗移栽到裝有不同處理供試土壤的盆中，待緩苗結(jié)束后保留2棵長勢(shì)基本一致的植株。平邑甜茶幼苗移栽后，所有處理均采用統(tǒng)一肥水管理，于9月底取樣測(cè)定平邑甜茶幼苗生物量、根系相關(guān)指標(biāo)、土壤微生物環(huán)境及土壤酶活性等指標(biāo)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)

生物量的測(cè)定：使用卷尺、游標(biāo)卡尺測(cè)定平邑甜茶幼苗的株高、徑粗。用自來水將幼苗地上部和根系沖洗干凈，擦干植株表面水分后使用萬分之一天平測(cè)定植株鮮重，然后將植株裝入牛皮信封殺青烘干后進(jìn)行干重的測(cè)定。

根系形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定：參照肖宏等[15]的方法，采用國產(chǎn)NUS700根系掃描儀測(cè)定平邑甜茶幼苗根系的總長度、表面積、根體積和根尖數(shù)。

根系呼吸速率的測(cè)定：采用氧電極自動(dòng)測(cè)定系統(tǒng) (Qxytherm System，Hansatech公司) 測(cè)定樣品呼吸速率[16-17]。

根抗氧化酶的測(cè)定：超氧化物歧化酶 (SOD) 活性的測(cè)定采用氮藍(lán)四唑 (NBT) 光還原法[18]；過氧化物酶 (POD) 的活性按Omran等[19]的方法測(cè)定；過氧化氫酶 (CAT) 活性按照Singh等[20]的方法測(cè)定。

土壤微生物的測(cè)定：土壤細(xì)菌、真菌、放線菌的測(cè)定均采用稀釋平板計(jì)數(shù)法，測(cè)定前計(jì)算水分系數(shù)。細(xì)菌采用土壤浸出液牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基37℃條件下培養(yǎng)，真菌采用PDA選擇性培養(yǎng)基28℃條件下培養(yǎng)，放線菌采用改良高氏培養(yǎng)基28℃條件下培養(yǎng)[21]。

土壤酶活性的測(cè)定：土壤中性磷酸酶活性測(cè)定采用磷酸苯二鈉比色法；土壤脲酶活性測(cè)定采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法；土壤蔗糖酶活性測(cè)定采用3,5-二硝基水楊酸比色法；土壤過氧化氫酶活性測(cè)定采用高錳酸鉀滴定法[22]。

實(shí)時(shí)熒光定量 (real-time quantitative PCR detecting system，qPCR)：參照尹承苗等[23]的方法，提取土壤總DNA并純化；參照王艷芳等[24]的方法設(shè)計(jì)尖孢鐮刀菌PCR引物，正向引物序列：GTGAACATACCACTTGTTGCCTC，反向引物序列：GAGTCCCAACACCAAGCTGTG；采用CFX96TMThermal Cycler(Bio-Rad) 對(duì)不同處理土壤中尖孢鐮孢菌的基因拷貝數(shù)進(jìn)行定量分析[25]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010進(jìn)行處理，采用SPSS 19.0進(jìn)行方差分析，用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理下植株生長狀況

2.1.1 地上部 由表1可以看出，與CK(連作土對(duì)照)相比，各處理的生物量都明顯提高。連作土壤施蚓糞處理和連作土施滅菌蚓糞處理的效果僅次于連作土 滅菌處理，且顯著高于CK。其中，連作 土壤施蚓糞處理和連作土施滅菌蚓糞處理的植株干重分別比CK提高了351.1%和348.2%。

2.1.2 根系 連作土施蚓糞和連作土施滅菌蚓糞均顯著促進(jìn)了平邑甜茶幼苗根系的生長 (表2)。其中，連作土施蚓糞處理的總根長、表面積、根體積和根尖數(shù)分別比CK提高74.5%、27.9%、84.0%和130.5%，連作土施滅菌蚓糞處理分別提高62.3%、19.0%、70.4%和119.0%。

由圖1可知，蚓糞的添加促進(jìn)了平邑甜茶幼苗根系抗氧化酶活性的提高。與CK相比，連作土施蚓糞處理的SOD、POD和CAT活性提高了33.4%、392.4%和241.4%。蚓糞同時(shí)促進(jìn)了平邑甜茶根系呼吸速率的提高，連作土施蚓糞和連作土施滅菌蚓糞的根系呼吸速率分別比CK提高了44.9%和60.0%。

2.2 不同處理下連作土壤的生物學(xué)特性

2.2.1 可培養(yǎng)微生物 蚓糞提高了連作土壤中細(xì)菌、放線菌數(shù)量，同時(shí)降低了真菌數(shù)量。與CK相比，連作土施蚓糞處理的細(xì)菌、放線菌數(shù)量分別增加了107.8%和97.7%，而真菌數(shù)量減少了17.1% (圖2)。2.2.2 尖孢鐮刀菌 由圖3可以看出，與CK連作土對(duì)照相比，不同處理均使尖孢鐮刀菌數(shù)量顯著降低，以連作土滅菌處理的效果最好，連作土施蚓糞和連作土施滅菌蚓糞的施入使尖孢鐮刀菌的基因拷貝數(shù)分別降低了51.0%和57.6%。

表1 不同處理對(duì)平邑甜茶株高、地徑和干重的影響Table 1 Effects of different treatments on the plant height, diameter and dry weight ofM.hupehensisRehd.seedlings

表2 不同處理對(duì)平邑甜茶根系形態(tài)的影響Table 2 Effects of different treatments on the root morphology ofM.hupehensisRehd.seedlings

圖1 不同處理對(duì)平邑甜茶根系呼吸速率和抗氧化酶活性的影響Fig.1 Effects of different treatments on root respiration rate and antioxidant enzyme activities ofM.hupehensisRehd.seedlings

2.2.3 酶活性 連作土施蚓糞和連作土施滅菌蚓糞處理的土壤酶活性顯著高于連作對(duì)照，其中連作土施蚓糞處理的土壤磷酸酶、脲酶、蔗糖酶和過氧化氫酶活性分別比CK提高了97.9%、540.9%、213.1%和109.4%。連作土壤添加蚓糞可以明顯提高土壤酶尤其是脲酶的活性 (圖4)。

3 討論

3.1 蚓糞對(duì)蘋果連作障礙土壤性質(zhì)的影響及其機(jī)理

有害真菌數(shù)量的增加是造成蘋果連作障礙的主要原因[26]。蚯蚓糞可以提高土壤中微生物的生物量，隨著蚯蚓糞添加量的提高，土壤中細(xì)菌和放線菌的種類和數(shù)量增加明顯，而真菌不是微生物增加的主要因素[27]。番茄連作土壤中施用蚓糞后，土壤放線菌數(shù)量有效增加，真菌數(shù)量降低，土壤中放線菌真菌比值提高[28]。在本試驗(yàn)中，也證實(shí)蘋果連作土壤添加蚯蚓糞后，細(xì)菌和放線菌數(shù)量顯著提高，真菌數(shù)量顯著下降。蚯蚓糞的添加促使連作土壤微生物由真菌主導(dǎo)型向細(xì)菌主導(dǎo)型轉(zhuǎn)變，有害真菌數(shù)量得以降低，從而達(dá)到減輕蘋果連作障礙的目的[29-30]。

圖2 不同處理土壤微生物數(shù)量Fig.2 Population of soil microorganisms under different treatments

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量分析的尖孢鐮刀菌基因拷貝數(shù)Fig.3 Gene copies ofFusarium oxysporumanalyzed by real-time quantitative analysis

Gil-Sotre等認(rèn)為，包括蔗糖轉(zhuǎn)化酶、脲酶、過氧化氫酶、酸性和中性磷酸酶等在內(nèi)的土壤酶對(duì)土壤中微生物的活動(dòng)非常敏感[31]，土壤酶活性可作為衡量土壤生物學(xué)活性和土壤肥力的指標(biāo)之一[22,32]。在本研究中，施入蚓糞可顯著提高連作土壤中土壤酶尤其是脲酶的活性，且施入蚓糞的效果要優(yōu)于滅菌蚓糞；研究結(jié)果與張池等[33]和田給林等[11]的研究結(jié)果一致。土壤酶活性的提高可以影響連作土壤中養(yǎng)分的釋放，提高土壤微生物活性和土壤肥力狀況，從而促進(jìn)果樹生長，減輕連作障礙造成的危害[34]。

3.2 蚓糞對(duì)蘋果連作障礙土壤平邑甜茶幼苗的影響及其機(jī)理

蘋果連作障礙普遍存在于我國各個(gè)蘋果優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)，發(fā)生連作障礙的果樹癥狀表現(xiàn)為：植株矮小、生長緩慢、葉片變小、根系分生能力差、植株發(fā)育緩慢等[1-5]。生物量是表征植物生長狀況的一項(xiàng)基本參數(shù)，生物量的大小對(duì)植物生長發(fā)育的影響至關(guān)重要[24]。有研究表明，蚓糞可刺激番茄幼苗和根系的生長，從而顯著促進(jìn)番茄植株生長，提高番茄產(chǎn)量[35-36]。尹恩等[37]的研究發(fā)現(xiàn)，生姜連作土壤加入蚓糞，可顯著提高生姜的株高、莖粗、葉片數(shù)和分枝等生長指標(biāo)。本試驗(yàn)中，施入蚓糞與滅菌蚓糞處理的平邑甜茶生物量顯著高于連作對(duì)照，與上述研究結(jié)果一致，這說明蚓糞可以促進(jìn)平邑甜茶幼苗的生長，緩解連作障礙產(chǎn)生的危害。蚓糞與滅菌蚓糞處理植株生物量沒有達(dá)到顯著差異，說明蚓糞中的微生物并不是促進(jìn)植株生長的主要原因。

圖4 不同處理的土壤酶活性Fig.4 Soil enzyme activities under different treatments

研究證明，連作條件下，果樹幼苗總根長和平均根直徑均有所下降，這些根系指標(biāo)的下降導(dǎo)致根系對(duì)養(yǎng)分吸收能力的降低，最終使得地下部干物質(zhì)積累量的減少，進(jìn)而導(dǎo)致連作障礙的發(fā)生[29]。王樹風(fēng)等[38]的研究表明，逆境條件下，植物根系生長受到抑制，從而影響根系在逆境中的分布范圍，影響植物對(duì)水分和營養(yǎng)元素的吸收，進(jìn)而影響植物生長。本試驗(yàn)中，施入蚓糞和滅菌蚓糞后平邑甜茶幼苗的總根長、根表面積、根體積和根尖數(shù)等根系指標(biāo)顯著提高，明顯高于連作對(duì)照，僅次于本試驗(yàn)的高標(biāo)對(duì)照滅菌土處理。Tomati等[39]研究發(fā)現(xiàn)，蚓糞中含有生物活性物質(zhì)和生長素、赤霉素、細(xì)胞分裂素等植物生長調(diào)節(jié)劑，這些物質(zhì)可以刺激植物根系活力，促進(jìn)植物生長發(fā)育。健康的根系可促進(jìn)平邑甜茶幼苗的生長發(fā)育，對(duì)緩解蘋果連作障礙具有重要意義。健康的根系也可以促進(jìn)根系的呼吸作用，根系呼吸作為植株地下部代謝的重要過程，不僅為植物生命活動(dòng)提供原料和能量，更是衡量根系功能、指示根系物質(zhì)與能量變化的敏感指標(biāo)，因此根系呼吸作用對(duì)植物養(yǎng)分的吸收、根系更新、植株生長具有重要意義[40]。根系呼吸所產(chǎn)生的大部分能量用于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，呼吸作用的降低使?fàn)I養(yǎng)離子吸收受到抑制，從而減緩植物生長[41]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，添加蚓糞和滅菌蚓糞可顯著提高平邑甜茶幼苗根系的呼吸速率，從而提高根系活力，促進(jìn)根系對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，促進(jìn)植株生長，提高抗逆性，這對(duì)緩解蘋果連作障礙有非常積極的作用。

正常條件下，植物細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，而當(dāng)植物遭遇到較強(qiáng)逆境時(shí)，活性氧大量產(chǎn)生，使植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)與活性氧之間的動(dòng)態(tài)平衡被打破，細(xì)胞不能及時(shí)清除多余的活性氧而對(duì)植物造成傷害[42]。連作土壤中，由于微生物環(huán)境惡化、酚酸等化感物質(zhì)積累和土傳病害加重等原因，使植物根系內(nèi)的活性氧大量積累，進(jìn)而傷害植株根系，影響根系對(duì)營養(yǎng)元素和水分的吸收和利用，導(dǎo)致連作障礙的發(fā)生[43]。超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化物酶 (POD)、過氧化氫酶(CAT) 是植物體內(nèi)清除多余活性氧的重要的抗氧化酶，較高的SOD、POD和CAT活性可以有效抑制活性氧的過量積累[44]。本研究中，蚓糞或滅菌蚓糞的添加，使平邑甜茶幼苗根系的抗氧化酶活性顯著提高，從而降低植物體內(nèi)活性氧的數(shù)量，降低活性氧的過量積累對(duì)植株造成的損傷，促進(jìn)植株根系生長，提高抗逆性，降低蘋果連作障礙的危害[37]。

4 結(jié)論

在連作土壤中施入蚓糞或滅菌蚓糞可顯著改善連作土壤微生物環(huán)境，提高土壤酶活性，促進(jìn)植株根系健康生長，提高平邑甜茶幼苗的生物量，從而減輕蘋果連作障礙帶來的危害。蚓糞與滅菌蚓糞處理未達(dá)到顯著差異，說明蚓糞中的微生物并不是其減輕蘋果連作障礙的主要原因。蘋果連作障礙的減輕可能是蚓糞中的有機(jī)營養(yǎng)、微生物和蚯蚓產(chǎn)生的抗菌肽共同作用的結(jié)果，但關(guān)于其機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。