黃瓜連作土壤高溫處理對根結(jié)線蟲和枯萎病的影響

張廣旭，呂亭輝?，周 娣，鄭世偉，姚夢蝶，余朝閣*，李天來*

（1 沈陽農(nóng)業(yè)大學園藝學院/設(shè)施園藝省部共建教育部重點實驗室/北方園藝設(shè)施設(shè)計與應(yīng)用技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心；2 沈陽農(nóng)業(yè)大學圖書館，沈陽 110161）

黃瓜是設(shè)施生產(chǎn)重要果菜，全國設(shè)施栽培面積千萬畝以上[1]，占設(shè)施蔬菜總面積近20%。隨著設(shè)施蔬菜生產(chǎn)專業(yè)化和規(guī)?；厔莸陌l(fā)展，必然要求設(shè)施黃瓜主產(chǎn)區(qū)在同一塊土地連續(xù)多年種植黃瓜，而黃瓜是易于發(fā)生連作障礙的蔬菜作物，因而連作障礙已成為制約設(shè)施黃瓜生產(chǎn)的重要因素[2-3]。引起連作障礙的原因有多種，但最主要的原因還是土壤中病原物積累而導致的土傳病害加重[3-4]。而在黃瓜與眾多連作相關(guān)的病害中，根結(jié)線蟲和枯萎病發(fā)生尤為普遍且嚴重[5-8]。

當前防治連作病害方法有嫁接、藥劑灌根和土壤消毒等措施，上述措施均可不同程度減輕連作障礙，但是單一使用其中一種措施均存在明顯的不足之處。如嫁接在設(shè)施黃瓜栽培中基本普及，但嫁接一定程度上影響了產(chǎn)品的品質(zhì)。藥劑灌根主要是對未發(fā)病植株起著保護作用，對已發(fā)病植株治愈效果通常并不明顯，而且極易導致農(nóng)藥殘留。土壤消毒措施主要在黃瓜定植前應(yīng)用，又可分為生物、化學和物理消毒方法。前兩種主要是應(yīng)用生物農(nóng)藥或化學農(nóng)藥進行土壤處理，通過抑菌或殺菌起著防病作用，但往往存在生物消毒效果一般、化學消毒農(nóng)藥殘留超標等問題；物理消毒主要是利用溫室7、8月份溫室休閑期高溫悶棚，該法不僅無任何農(nóng)藥殘留、還可促進土壤礦質(zhì)元素轉(zhuǎn)化，但是悶棚溫度指標尚不清楚。

本研究首先探明根結(jié)線蟲和枯萎病的發(fā)生程度及二者病原物的數(shù)量與黃瓜連作茬次之間的關(guān)系；然后對發(fā)病嚴重的連作土壤高溫處理，并用處理過的土壤栽培黃瓜，調(diào)查不同溫度處理的病害發(fā)生程度、土壤病原物數(shù)量及植株生長情況。旨在為溫室高溫消毒防治連作病害提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

‘津優(yōu)30’黃瓜連作土壤于2016年2月黃瓜拉秧后取自沈陽農(nóng)業(yè)大學園藝學院科研基地20號日光溫室。該溫室跨度8 m、長度60 m，于2006年8月至2015年期間，每年8月由溫室東端向西依次挖3個南北走向栽培槽，長7.0 m、寬0.65 m、深0.30 m，兩槽間距0.75 m，槽內(nèi)鋪料薄膜與溫室土壤隔離，從溫室外同一塊地取30 cm深表層土，通過添加肥料將其調(diào)配為含有機質(zhì)2.30%、全磷1.61 g/kg、全鉀10.6 g/kg、堿解氮102 mg/kg、速效磷41.3 mg/kg、速效鉀223 mg/kg，混拌均勻后填平栽培槽，每年9月和翌年3月，分別進行秋冬茬和春茬黃瓜栽培 (品種均為‘津優(yōu)30’)，毎槽定植2行，株距35 cm、行距50 cm。2015年9月至2016年2月(秋冬茬)，該溫室黃瓜連作的茬口有1、3、5、7、9、11、13、17、19茬，每個茬次有3個栽培槽 (即3 次重復)。

1.2 連作黃瓜根結(jié)線蟲和枯萎病調(diào)查與土壤病原物數(shù)量測定

1.2.1 根結(jié)線蟲和枯萎病田間調(diào)查 2016年2月于2015年秋冬茬黃瓜生產(chǎn)結(jié)束時，調(diào)查不同連作茬次黃瓜的根結(jié)線蟲和枯萎病發(fā)生情況。由于調(diào)查的黃瓜植株整體上根結(jié)線蟲發(fā)病重，且不同病株間嚴重度不一致；而枯萎病整體上發(fā)病較輕，各病株病害級別幾乎全部為1級。所以在調(diào)查根結(jié)線蟲時，記錄不同植株發(fā)病嚴重度級別，病害分級標準參照李洪連等方法[9]，然后計算病情指數(shù)表示發(fā)病程度；而枯萎病則直接統(tǒng)計發(fā)病植株占調(diào)查全部植株數(shù)量的百分率，用發(fā)病率表示發(fā)病程度。調(diào)查方法為栽培槽東側(cè)行由北向南調(diào)查第3、6、9、12、15株，西側(cè)行由南向北調(diào)查第3、6、9、12、15株。每處理調(diào)查10株，3次重復。

1.2.2 土壤中根結(jié)線蟲和枯萎病菌數(shù)量測定 上述黃瓜拉秧后，采集不同連作茬次的土壤，采樣方法為從距栽培槽南端約1.2、2.4、3.6、4.8、6.0 m的槽中部取土，取土范圍的長度和寬度20 cm左右、深度30 cm左右，將所取土樣混合均勻，及時分離檢測根結(jié)線蟲和鐮刀菌數(shù)量。根結(jié)線蟲分離采用淘洗過篩蔗糖密度梯度離心法[10]，然后在顯微鏡觀測幼蟲及成蟲總數(shù)；尖孢鐮刀菌分離計數(shù)采用稀釋涂布平板法[11]，培養(yǎng)3～4 d后統(tǒng)計菌落數(shù)并鑒定病菌類型。經(jīng)沈陽農(nóng)業(yè)大學線蟲研究室和本實驗室鑒定，本連作土壤中根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲 (Meloidogyne incognita)，枯萎病菌為尖孢鐮刀菌黃瓜?；?Fusarium oxysporumf.spcucumarinumOwen)。

1.3 高溫處理連作土壤對病害和病原物的影響

1.3.1 連作土壤高溫處理與黃瓜秧苗培育 取發(fā)病較重的第17茬黃瓜連作的土壤，取樣點及方法同1.2.2，每槽所取土樣充分混勻后均分5份，分別放在高壓滅菌鍋中進行45℃、50℃、55℃、60℃的溫度處理2 h (上述溫度下滅菌鍋內(nèi)氣壓仍為常壓)，以未經(jīng)溫度處理的連作土壤為對照。

1.3.2 高溫處理對土壤病原物和黃瓜病害的影響取上述經(jīng)45℃、50℃、55℃和60℃處理的和未經(jīng)高溫處理 (CK) 的土壤，測定不同處理土壤中根結(jié)線蟲 (M.incognita) 和鐮刀菌 (F.oxysporumf.spcucumarinum) 數(shù)量，測定方法參照本文1.2.2。每處理5個樣品，重復3次。

將上述經(jīng)不同溫度處理的土壤和對照土壤分別裝于直徑12 cm、高12 cm的塑料缽中，每缽裝土保持壓實后10 cm高度，以備定植黃瓜秧苗。黃瓜用沈陽農(nóng)業(yè)大大學蔬菜無土育苗營養(yǎng)基質(zhì) (專利號ZL03133591.8)于50孔穴盤中育苗，待秧苗長至一葉一心期，選取生長整齊一致的秧苗分別定植于上述裝有不同處理土壤的塑料缽中。定植后置于沈陽農(nóng)業(yè)大學園藝學院科研基地29號溫室 (育苗溫室)，晝溫25℃～32℃、夜溫18℃～20℃，空氣濕度白天80%、夜間90%的條件下培養(yǎng)25 d，然后調(diào)查根結(jié)線蟲和枯萎病發(fā)病情況，病害分級標準及病情指數(shù)計算公式參照李洪連等[9]的方法。

1.3.3 土壤高溫處理對黃瓜植株生長的影響 育苗及定植同上，定植后21 d測量各處理土壤栽培的黃瓜秧苗株高、莖粗、全株鮮重、地下及地上部分干重，并計算全株干重和病情指數(shù)。壯苗指數(shù)計算公式：壯苗指數(shù)＝ (莖粗/株高 + 根干重/地上部干重) ×全株干重。上述病害調(diào)查和生長指標測定均為每處理10株，設(shè)3次重復。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)應(yīng)用Excel進行基本統(tǒng)計，然后采用SPSS19軟件鄧肯法進行差異顯著性分析 (均為P＜0.05水平) 和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜連作對土傳病害與土壤病原物數(shù)量的影響

2.1.1 連作對黃瓜根結(jié)線蟲和枯萎病發(fā)生的影響圖1表明，黃瓜根結(jié)線蟲病情指數(shù)和枯萎病發(fā)病率均隨連作茬次的增加而升高。其中根結(jié)線蟲病情指數(shù)于黃瓜連作第1～5茬緩慢升高，但是在連作5茬以內(nèi)各茬病情指數(shù)之間差異未達到顯著水平；連作第7茬以后根結(jié)線蟲病情指數(shù)開始迅速升高，并于第17茬達到發(fā)病高峰，病情指數(shù)為60.0，然后略有下降；黃瓜連作第13～19茬期間，根結(jié)線蟲病情指數(shù)均處于較高水平，且各茬黃瓜病情指數(shù)之間均無顯著差異 (圖1A)。而枯萎病發(fā)病率于連作第3茬時無顯著變化，第5茬開始迅速升高，并于第13茬達到發(fā)病高峰，發(fā)病率為46.76%，然后發(fā)病率緩慢下降；17茬與19茬的發(fā)病率略低于13茬，但未達到顯著水平。黃瓜連作第11～19茬期間，枯萎病發(fā)病率保持在較高水平，各茬黃瓜發(fā)病率之間也沒有顯著差異 (圖1B)。上述結(jié)果說明，兩種病害均隨黃瓜連作茬次增加而加重，并于第13～17茬發(fā)病程度最重。2.1.2 黃瓜連作對土壤中病原物數(shù)量的影響 圖2表明，土壤中根結(jié)線蟲 (M.incognita) 和尖孢鐮刀菌(F.oxysporumf.spcucumarinum) 數(shù)量均隨黃瓜連作茬次的增加而增多。其中根結(jié)線蟲蟲口密度從黃瓜連作第1茬到第13茬緩慢升高，至第17茬迅速升高并達到最高水平，蟲口密度為每克干土17.6條，第19茬迅速下降，擔仍保持較高水平 (圖2A)。而尖孢鐮刀菌數(shù)量于連作第3茬時即迅速升高，并于第13茬達到最高水平，然后緩慢下降；黃瓜連作第11～19茬期間，土壤中鐮刀菌數(shù)量始終保持高水平穩(wěn)定，每克干土中病菌孢子數(shù)4.4 × 104～5.0 × 104cfu/g/，且各茬黃瓜連作土壤之間病菌孢子數(shù)無顯著差異 (圖2B)。上述結(jié)果表明，黃瓜長期連作導致土壤中根結(jié)線蟲和鐮刀菌等病原物積累。

圖1 黃瓜根結(jié)線蟲和枯萎病發(fā)生情況隨連作年限的變化Fig.1 Change of disease incidence of root knot-nematode and Fusarium wilt with continuous crop’s numbers

2.1.3 連作黃瓜發(fā)病程度與土壤中病原物數(shù)量的關(guān)系比較圖1和圖2可見，不同連作茬次黃瓜的根結(jié)線蟲和枯萎病發(fā)生程度，與其栽培土壤中相應(yīng)病原物的數(shù)量變化規(guī)律相似，將各茬黃瓜根結(jié)線蟲病情指數(shù)與相應(yīng)茬次土壤中根結(jié)線蟲的蟲口密度、枯萎病發(fā)病率與相應(yīng)茬次土壤中尖孢鐮刀菌數(shù)量進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明其相關(guān)系數(shù)分別為0.947和0.971，均達到顯著水平，說明這兩種病害隨著黃瓜連作茬次的增加而加重，主要是因為連作導致土壤中病原物積累的結(jié)果。

2.2 高溫處理連作土壤對土傳病害與病原物的影響

圖2 黃瓜連作土壤中根結(jié)線蟲和枯萎病菌數(shù)量Fig.2 Number ofM.incognitaandF.oxysporumin continuous cucumber cropping soil

圖3 不同溫度處理黃瓜連作土壤根結(jié)線蟲病情指數(shù)和枯萎病發(fā)病率Fig.3 Index of root knot-nematode and incidence of Fusarium wilt in continuous cropping soil treated with different temperatures

2.2.1 高溫處理土壤對黃瓜根結(jié)線蟲和枯萎病發(fā)生的影響 取根結(jié)線蟲和枯萎病發(fā)生均嚴重的第17茬黃瓜連作土壤，對其分別進行45℃、50℃、55℃、和60℃的溫度處理 (圖3)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，45℃溫度處理黃瓜連作土壤，處理與對照之間對黃瓜根結(jié)線蟲病情指數(shù)均為13.3，50℃至60℃的溫度處理黃瓜連作土壤2 h，各處理黃瓜根結(jié)線蟲病情指數(shù)均為0(圖3A)，說明45℃的溫度處理土壤不能抑制黃瓜根結(jié)線蟲的發(fā)生，而50℃以上的溫度處理則可以完全抑制黃瓜根結(jié)線蟲的發(fā)生；45℃至60℃的溫度范圍處理黃瓜連作土壤，各處理黃瓜枯萎病發(fā)病率均顯著低于對照，且隨著處理溫度的升高而顯著降低，其中60℃的溫度處理，黃瓜枯萎病發(fā)病率降至0%(圖3B)，說明45℃以上的溫度處理土壤，隨著處理溫度的升高對枯萎病抑制效果也越明顯，處理溫度達到60℃時，則可以完全抑制枯萎病的發(fā)生。

2.2.2 高溫處理對土壤中根結(jié)線蟲和尖孢鐮刀菌數(shù)量的影響 圖4A顯示，黃瓜連作土壤中根結(jié)線蟲的蟲口密度，在45℃至55℃的溫度范圍內(nèi)隨著處理溫度的升高而顯著降低，當溫度升至55℃以上時，根結(jié)線蟲蟲口密度降至0，說明45℃以上的溫度處理可減少土壤中根結(jié)線蟲數(shù)量，而當對土壤處理的溫度達到55℃以上時，可完全殺滅其中的根結(jié)線蟲；土壤中尖孢鐮刀菌數(shù)量在45℃至60℃的溫度范圍內(nèi)也隨著處理溫度的升高而顯著降低，當處理溫度升至60℃時，鐮刀菌數(shù)量降為0 (圖4B)，說明45℃以上的溫度處理也減少土壤枯萎病菌數(shù)量，而且處理溫度越高，殺菌效果越好，當處理溫度達到60℃以上時可完全殺滅土壤中枯萎病菌。

2.3 高溫處理連作土壤對黃瓜植株生長的影響

圖4 不同溫度處理的黃瓜連作土壤中根結(jié)線蟲和枯萎病菌數(shù)量Fig.4 Number ofM.incognitaandF.oxysporumin continuous cucumber cropping soil treated with different temperatures

表1 不同溫度處理連作土壤對黃瓜生長指標的影響Table 1 Growth parameters of cucumber in continuous cropping soil treated with different temperatures

由表1可見，用45℃、50℃和55℃處理的連作土壤定植黃瓜秧苗，植株的株高、莖粗、鮮重、干重以及壯苗指數(shù)等生長指標與對照之間均無顯著差異；用60℃的溫度處理的連作土壤定植黃瓜秧苗，植株上述生長指標均高于對照，而且除莖粗以外，株高、鮮重、干重及壯苗指數(shù)等生長指標與對照之間差異均達到顯著水平。上述結(jié)果說明，用60℃處理2 h的連作土壤定植黃瓜秧苗，不僅顯著促進秧苗生長，還具有顯著的壯苗作用。

3 討論

3.1 黃瓜連作土傳病害和病原物動態(tài)變化

在黃瓜連作土壤中，單位質(zhì)量干土中根結(jié)線蟲的蟲口密度和尖孢鐮刀菌的數(shù)量均隨著連作茬次的增加而增加，這一結(jié)果與時立波等[12]關(guān)于番茄種植年限與土壤中根結(jié)線蟲蟲口密度間關(guān)系及趙青云等[13]關(guān)于香草蘭種植年限與土壤中尖孢鐮刀菌數(shù)量之間關(guān)系的研究結(jié)果一致。同時，該兩種病原物所致病害的病情指數(shù)與其在土壤中積累的數(shù)量呈相同變化趨勢。相關(guān)性分析表明，兩種病害的病情指數(shù)與土壤中相應(yīng)病原物的數(shù)量均呈顯著正相關(guān)。說明黃瓜連作病害加重，主要是由土壤中病原物積累造成的。兩種病害及其病原物數(shù)量在黃瓜連作17茬時達較高水平，之后則有下降趨勢。這可能是因為隨著連作茬次的增加，土壤中根結(jié)線蟲和枯萎病菌的拮抗微生物也隨著此兩種病原物的積累而積累，當拮抗微生物積累到一定數(shù)量時，必然抑制根結(jié)線蟲和枯萎病菌的繁殖；另外，土壤中化感物質(zhì)也隨著連作茬次增加而積累，當積累到一定數(shù)量時也會對病原物產(chǎn)生抑制作用，上述抑制病原物的因素均可能影響連作病害的發(fā)生。關(guān)于連作病害達到最高水平后的進一步變化規(guī)律及其深層機制，還有待進一步研究。

3.2 根結(jié)線蟲與枯萎病之間的相互關(guān)系

關(guān)于植物根結(jié)線蟲與枯萎病之間的相互關(guān)系研究從上世紀八十年代以來偶有報道，多數(shù)研究認為，土壤中根結(jié)線蟲促進植物枯萎病的發(fā)生[14-15],而馬冉等研究則發(fā)現(xiàn)，預先接種南方根結(jié)線蟲能顯著減輕香蕉枯萎病的發(fā)病程度，但同時接種2種病原物或先接種枯萎病菌后再接種南方根結(jié)線蟲，則加重香蕉枯萎病的發(fā)生[16]。本研究中，兩種病害均隨著連作茬次的增加而加重，土壤中其相應(yīng)的病原物也隨連作茬次的增加而積累，這與前人研究結(jié)果一致；但在病害調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，各茬黃瓜根結(jié)線蟲明顯比枯萎病發(fā)病程度嚴重，也存在不少黃瓜植株單獨發(fā)生根結(jié)線蟲或枯萎病的情況。因此，此兩種病害發(fā)生的相互作用關(guān)系尚需深入探究。

3.3 土壤高溫處理對土傳病害與病原物的抑制作用

本研究中，45℃處理黃瓜連作土壤顯著降低土壤中尖孢鐮刀菌數(shù)量和枯萎病病情指數(shù)，而王惟萍等[17]研究發(fā)現(xiàn)45℃則可完全殺滅土壤中尖孢鐮刀菌?？赡芤驗楸狙芯刻幚頃r間僅為2 h，而后者處理時間最短就為1 d (24 h)。對黃瓜連作土壤進行50℃～60℃的處理，均顯著降低其中的根結(jié)線蟲和枯萎病菌的數(shù)量，并抑制后期兩種病害的發(fā)生程度，且隨著處理溫度的升高，殺菌和防病的效果也越明顯；55℃時可完全殺滅土壤中根結(jié)線蟲，達60℃時可同時殺滅枯萎病菌，上述處理一旦殺滅了土壤病原物，即可完全控制相應(yīng)病害的發(fā)生。以上研究結(jié)果對設(shè)施蔬菜生產(chǎn)中溫室高溫消毒技術(shù)具有重要的指導意義，設(shè)施生產(chǎn)在夏季溫室休閑期將溫室土壤翻耕，利用此時太陽光照強、氣溫高的特點對溫室進行高溫悶棚，使耕層土溫達55℃以上，必然對后期栽培具有重要的防病作用。

3.4 土壤高溫處理對黃瓜植株生長的影響

用60℃處理的連作土壤定植黃瓜，后期植株生長指標和壯苗指數(shù)也顯著優(yōu)于對照。張子龍等研究發(fā)現(xiàn)，用經(jīng)過高溫滅菌的連作土壤栽培植物，植株的株高、莖粗等生長指標均顯著高于未進行高溫處理土壤的相應(yīng)指標，根系形態(tài)也明顯改善，根長和根系活力增加[18]。導致連作障礙的原因除與病原物積累有關(guān)外，還與土壤中作物根系分泌的自毒物質(zhì)等因素有關(guān)，自毒物質(zhì)不僅刺激病菌生長和孢子萌發(fā)，還對植物生長具一定的抑制作用[19-20]。本研究中用于60℃高溫處理的連作土壤栽培黃瓜，植株生長狀況明顯改善，可能是因為經(jīng)60℃高溫處理后，抑制或鈍化了連作土壤中的自毒物質(zhì)、或者改變了土壤中養(yǎng)分狀態(tài) (如從不可吸收狀態(tài)轉(zhuǎn)化為可吸收狀態(tài))，其具體原因及機制還有待進一步探究。

4 結(jié)論

黃瓜連作導致土壤中根結(jié)線蟲和枯萎病菌數(shù)量積累，進而導致兩種病害加重。用55℃以上的高溫處理連作土壤不僅能夠減少土壤中根結(jié)線蟲和枯萎病菌的數(shù)量，而且能抑制甚至避免這兩種病害的發(fā)生，并具有促進黃瓜植株生長和壯苗作用。