甜瓜種子傳帶真菌初步研究

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院， 北京 100193)

甜瓜(CucumismeloL.)屬于葫蘆科、甜瓜屬，別名香瓜、甘瓜、哈密瓜，為一年生匍匐性或攀緣性草本植物[1]。甜瓜果實(shí)香甜可口，果肉含有豐富的水分、維生素和碳水化合物，可消暑清熱、生津止渴；含有蛋白質(zhì)、脂肪和無機(jī)鹽等，能補(bǔ)充人體所需的能量和多種營養(yǎng)素；含有將不溶性蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為可溶性蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化酶，可有助于營養(yǎng)吸收；瓜蒂中的葫蘆素B具有保護(hù)肝臟，減輕肝損傷，繼而阻止肝細(xì)胞脂肪變性以及抑制纖維增生的功能；瓜籽中的蛋白質(zhì)、纖維和粗油含量分別為25.2%、15.4%和37.8%[2]；瓜籽中有較高的賴氨酸，含硫氨基酸次之，還有大量的礦物質(zhì)，特別是鎂、鉀和磷[3]。目前甜瓜在熱帶和溫帶地區(qū)廣泛種植，其主要種植國為中國、美國、西班牙、土耳其和伊朗等。我國主要分布在新疆、甘肅、內(nèi)蒙古等西北地區(qū)，20世紀(jì)80年代開始在華北、華中、華南及臺(tái)灣地區(qū)種植[4]。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)統(tǒng)計(jì)，中國甜瓜的種植面積約為42.78萬hm2，總產(chǎn)量達(dá)1 440萬t(http://faostat3.fao.org/download/Q/QC/E)。近年來，保護(hù)地甜瓜連年種植，使其生長環(huán)境中病原菌大量積累，加上保護(hù)地內(nèi)高溫、高濕的生長環(huán)境，導(dǎo)致甜瓜病害發(fā)生日趨嚴(yán)重，制約了甜瓜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[4-5]。國外的一項(xiàng)研究表明，甜瓜等葫蘆科作物種子共攜帶有8種真菌，分別是青霉菌、鏈格孢菌、鐮刀菌、絲核菌(Rhizoctoniaspp.)、根霉(Rhizopusspp.)、炭疽菌(Colletotrichumspp.)、殼球孢菌(Macrophominaphaseolina)和黑曲霉(Aspergillusniger)[6]。而陳祥付等[7]報(bào)道，從5個(gè)甜瓜品種的種子上檢測(cè)到鐮刀菌、根霉和鏈格孢菌。本研究對(duì)來自10個(gè)省市的32個(gè)甜瓜品種的種子傳帶真菌情況進(jìn)行檢測(cè)，旨在初步明確其傳帶的主要真菌種類，從而為生產(chǎn)中甜瓜品種的選擇及進(jìn)行合適的種子處理提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試甜瓜品種

供試甜瓜品種共32個(gè)，其中金玉滿堂、京蜜11號(hào)、蜜脆香園、京蜜10號(hào)、京蜜15號(hào)、京蜜8號(hào)、伊麗莎白、久久紅、京蜜9號(hào)、YLJ一特金、京蜜7號(hào)、金碧輝煌、一特白、一特金2號(hào)、久青蜜、京玉2號(hào)等來自北京市；綠源來自河北??；青甜17號(hào)、綠香甜、和甜九號(hào)、春甜十三、綠麻瓜、黃金道、刀摟子、香香甜瓜等來自黑龍江?。痪G寶石669來自遼寧??；吉祥紅玉來自吉林??；綠蘿來自陜西省；玉金香來自甘肅省；盛開花來自河南?。痪眉t瑞來自安徽??；東方蜜一號(hào)來自上海市。

1.2 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基[8]：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。培養(yǎng)基在121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min后備用。

1.3 供試試劑

無菌水，1%次氯酸鈉溶液。

1.4 種子攜帶真菌檢測(cè)

參考Mathur等[9]的方法并稍加改進(jìn)。具體操作步驟如下：

1) 每個(gè)甜瓜品種隨機(jī)選取400粒種子。

2) 從400粒種子中隨機(jī)選取40粒種子，將選取的種子均勻擺放在直徑為9 cm的PDA平板上，每皿10粒，每個(gè)處理4次重復(fù)；然后置于25～28 ℃的培養(yǎng)箱中12 h黑暗/12 h光照條件下培養(yǎng)5 d后進(jìn)行檢查，記錄干種子帶菌種類并計(jì)算分離頻率。

3) 將剩余的360粒甜瓜種子分別置于100 mL燒杯中，用30 mL無菌水充分洗滌后，吸取1 mL洗滌懸浮液放入1.5 mL離心管中，4 000 r·min-1離心15 min后棄上清液，再向離心管中加入500μL無菌水，充分振蕩懸浮后吸取100μL均勻涂布于直徑為9 cm的PDA平板上，每個(gè)處理4次重復(fù)。在相同的操作條件下空白對(duì)照為無菌水。然后置于25～28 ℃培養(yǎng)箱中12 h黑暗/12 h光照條件下培養(yǎng)5 d后進(jìn)行檢查，記錄某類真菌菌落個(gè)數(shù)和菌落總數(shù)并計(jì)算分離比例。

4) 從 3) 無菌水洗滌后的甜瓜種子中每個(gè)品種隨機(jī)選取40粒，晾干后將種子均勻放置在直徑為9 cm的PDA平板上，10粒/皿，每個(gè)處理4次重復(fù)。然后置于25～28 ℃的培養(yǎng)箱中12 h黑暗/12 h光照條件下培養(yǎng)5 d后進(jìn)行檢查，記錄水洗后種子帶菌種類并計(jì)算分離頻率。

5) 從 3) 無菌水洗滌后的甜瓜種子中每個(gè)品種隨機(jī)選取100粒，在1% NaClO溶液中浸泡5 min后再用無菌水充分洗滌3遍，晾干后將種子均勻放置在直徑為9 cm的PDA平板上，10粒/皿，每個(gè)處理4次重復(fù)。然后置于25～28 ℃培養(yǎng)箱中12 h黑暗/12 h光照條件下培養(yǎng)5 d后進(jìn)行檢查，記錄1% NaClO處理后種子帶菌種類并計(jì)算分離頻率。

6) 將剩余的甜瓜種子隨機(jī)選取40粒，使用鈍頭鑷子等對(duì)種子進(jìn)行種皮和種仁的分離。將處理后的完整種皮均勻放置在直徑為9 cm的PDA平板上，每皿10粒，每個(gè)處理4次重復(fù)。然后置于25～28 ℃的培養(yǎng)箱中12 h黑暗/12 h光照條件下培養(yǎng)5 d后進(jìn)行檢查，記錄種皮帶菌種類并計(jì)算分離頻率。

7) 將6) 中剝離的完整種仁均勻放置在直徑為9 cm的PDA平板上，每皿10粒，每個(gè)處理4次重復(fù)。然后置于25～28 ℃的培養(yǎng)箱中12 h黑暗/12 h光照條件下培養(yǎng)5 d后進(jìn)行檢查，記錄種仁帶菌種類并計(jì)算分離頻率。

1.5 種子攜帶真菌初步鑒定

將分離得到的真菌分別進(jìn)行純化、保存。根據(jù)真菌培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征，參考工具書進(jìn)行初步鑒定[10-13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜瓜干種子帶菌檢測(cè)結(jié)果

32個(gè)甜瓜品種的干種子帶菌情況差異較大(詳見表1)。綠源、京蜜11號(hào)、青甜17號(hào)、京蜜10號(hào)、綠香甜、和甜九號(hào)、春甜十三、盛開花、金碧輝煌、久久紅和久紅瑞等11個(gè)品種的干種子均未檢測(cè)到真菌；金玉滿堂和綠麻瓜等2個(gè)品種干種子帶菌率高達(dá)100%；吉祥紅玉、綠麻瓜、刀摟子和玉金香等4個(gè)品種干種子只檢測(cè)到青霉菌；金玉滿堂和黃金道等2個(gè)品種干種子檢測(cè)到青霉菌和曲霉菌；久青蜜、京蜜8號(hào)和京蜜7號(hào)等3個(gè)品種干種子檢測(cè)到鐮刀菌；蜜脆香園、京蜜15號(hào)、YLJ一特金和京蜜9號(hào)等4個(gè)品種干種子檢測(cè)到鏈格孢菌；綠寶石669、香香甜瓜、一特白、京玉2號(hào)和一特金2號(hào)等5個(gè)品種干種子檢測(cè)到鐮刀菌和鏈格孢菌。

表1 甜瓜干種子傳帶的真菌種類和分離頻率

甜瓜品種 帶菌率/%真菌種類和分離頻率/%青霉菌曲霉菌鐮刀菌鏈格孢菌其它金玉滿堂100.010.090.0———綠寶石66940.025.0—12.56.356.3綠蘿17.542.9———71.4蜜脆香園10.0———100.0—京蜜15號(hào)10.0———50.050.0吉祥紅玉47.5100.0————久青蜜25.040.0—40.0—40.0綠麻瓜100.0100.0————黃金道70.092.925.0———刀摟子12.5100.0————香香甜瓜17.571.4—28.642.6100.0京蜜8號(hào)10.0——100.0——YLJ一特金90.05.6——11.183.3京蜜7號(hào)10.0——100.0——東方蜜一號(hào)50.0————100.0伊麗莎白60.025.016.7——58.3京蜜9號(hào)20.0———37.587.5一特白57.513.073.956.517.4—京玉2號(hào)62.556.012.044.044.024.0一特金2號(hào)80.025.0—12.562.5—玉金香40.0100.0————

注：“—”表示未檢測(cè)到該種真菌。下同。

表2 水洗后甜瓜種子傳帶的真菌種類和分離頻率

甜瓜品種 帶菌率/%真菌種類和分離頻率/%青霉菌曲霉菌鐮刀菌鏈格孢菌其它金玉滿堂100.090.0———10.0綠蘿10.066.7—100.0100.0—京蜜15號(hào)75.0————100.0綠香甜16.7——40.0—60.0吉祥紅玉20.083.3———50.0久青蜜15.0100.0————綠麻瓜50.0100.0100.0———黃金道33.360.050.0———刀摟子20.0100.0————YLJ一特金26.787.5——62.5—京蜜7號(hào)25.020.060.020.020.0—東方蜜一號(hào)30.025.0—25.050.0100.0伊麗莎白17.571.4100.028.642.971.4京蜜9號(hào)7.5——66.733.3—一特白35.050.0———75.0京玉2號(hào)12.5100.0———100.0一特金2號(hào)20.0——62.550.0100.0玉金香95.0——40.010.581.6

2.2 甜瓜種子洗滌懸浮液帶菌檢測(cè)結(jié)果

綠香甜、和甜九號(hào)、春甜十三、盛開花、YLJ一特金和伊麗莎白等6個(gè)品種的種子洗滌懸浮液中均檢測(cè)到真菌。綠香甜、和甜九號(hào)、春甜十三和盛開花等4個(gè)品種種子洗滌懸浮液為青霉菌、曲霉菌以及鏈格孢菌，其中春甜十三的鏈格孢菌分離比例高達(dá)66.7%，和甜九號(hào)和盛開花的曲霉菌分離比例分別為13.3%和25.0%，和甜九號(hào)的青霉菌分離比例為86.7%；伊麗莎白種子洗滌懸浮液檢測(cè)到青霉菌、曲霉菌和鐮刀菌，其中鐮刀菌的分離比例為25.0%；YLJ一特金種子洗滌懸浮液檢測(cè)到青霉菌。其余甜瓜品種種子洗滌懸浮液均未檢測(cè)到真菌。

2.3 水洗后甜瓜種子帶菌檢測(cè)結(jié)果

32個(gè)甜瓜品種的種子經(jīng)過水洗后帶菌檢測(cè)結(jié)果為：綠源、京蜜11號(hào)、綠寶石669、青甜17號(hào)、蜜脆香園、京蜜10號(hào)、和甜九號(hào)、春甜十三、香香甜瓜、盛開花、京蜜8號(hào)、金碧輝煌、久久紅和久紅瑞等14個(gè)甜瓜品種的種子水洗后均未檢測(cè)到真菌；金玉滿堂種子帶菌率高達(dá)100%；久青蜜和刀摟子種子水洗后只檢測(cè)到青霉菌；綠麻瓜和黃金道種子水洗后檢測(cè)到青霉菌和曲霉菌；綠香甜種子水洗后檢測(cè)到鐮刀菌；YLJ一特金種子水洗后檢測(cè)到鏈格孢菌；綠蘿、京蜜7號(hào)、東方蜜一號(hào)、伊麗莎白、京蜜9號(hào)、一特金2號(hào)和玉金香等7個(gè)品種的種子水洗后檢測(cè)到鐮刀菌和鏈格孢菌(表2)。

2.4 種子帶菌檢測(cè)結(jié)果

32個(gè)甜瓜品種的種子經(jīng)過1%NaClO處理后的帶菌檢測(cè)結(jié)果為：綠源、金玉滿堂、青甜17號(hào)、綠蘿、蜜脆香園、京蜜10號(hào)、京蜜15號(hào)、和甜九號(hào)、春甜十三、吉祥紅玉、久青蜜、綠麻瓜、刀摟子、香香甜瓜、盛開花、京蜜7號(hào)、東方蜜一號(hào)、伊麗莎白、金碧輝煌、京蜜9號(hào)、一特白、京玉2號(hào)、一特金2號(hào)、玉金香和久紅瑞等25個(gè)甜瓜品種的種子均未檢測(cè)到真菌；黃金道種子只檢測(cè)到青霉菌；京蜜11號(hào)、綠寶石669、綠香甜、京蜜8號(hào)、久久紅和YLJ一特金等6個(gè)品種的種子檢測(cè)到鐮刀菌或鏈格孢菌(表3)。

表4 1%NaClO處理后甜瓜種皮傳帶的真菌種類和分離頻率

甜瓜品種 帶菌率/%真菌種類和分離頻率/%青霉菌鐮刀菌鏈格孢菌其它綠源10.0100.0———金玉滿堂22.544.4——77.8京蜜11號(hào)32.553.869.2——綠寶石66920.0—75.037.5—綠蘿10.0100.0———京蜜10號(hào)10.0———100.0綠香甜10.0100.0——100.0綠麻瓜62.5100.0———盛開花10.0———100.0東方蜜一號(hào)10.0—100.0——伊麗莎白45.0———100.0京蜜9號(hào)20.050.0——50.0久紅瑞62.5———100.0

表5 甜瓜種仁傳帶的真菌種類和分離頻率

甜瓜品種 帶菌率/%真菌種類和分離頻率/%青霉菌曲霉菌鐮刀菌鏈格孢菌其它綠源10.0100.0————金玉滿堂15.0—83.3——66.7京蜜11號(hào)25.020.0—50.0—30.0綠寶石66910.025.0—100.0——綠蘿12.560.0———80.0蜜脆香園10.0————100.0綠香甜40.037.5———100.0和甜九號(hào)20.0100.0————綠麻瓜90.0100.0————黃金道10.0100.025.0———刀摟子12.5——100.0—100.0京蜜7號(hào)30.0———50.050.0伊麗莎白100.0————100.0久紅瑞90.0————100.0

表3 1% NaClO處理后甜瓜種子傳帶的真菌種類和分離頻率

甜瓜品種 帶菌率/%真菌種類和分離頻率/%青霉菌鐮刀菌鏈格孢菌其它京蜜11號(hào)30.0—75.0—50.0綠寶石66920.0——12.587.5綠香甜10.0—100.0——黃金道10.0100.0———京蜜8號(hào)10.0——100.0—YLJ一特金20.050.0—50.0—久久紅10.0——100.0—

2.5 種皮帶菌檢測(cè)結(jié)果

32個(gè)甜瓜品種的種子經(jīng)過1% NaClO處理后種皮帶菌檢測(cè)結(jié)果為：青甜17號(hào)、蜜脆香園、京蜜15號(hào)、和甜九號(hào)、春甜十三、吉祥紅玉、久青蜜、黃金道、刀摟子、香香甜瓜、京蜜8號(hào)、YLJ一特金、京蜜7號(hào)、金碧輝煌、一特白、久久紅、京玉2號(hào)、一特金2號(hào)和玉金香等19個(gè)甜瓜品種的種皮均未檢測(cè)到真菌；綠源、金玉滿堂、京蜜11號(hào)、綠蘿、綠香甜、綠麻瓜和京蜜9號(hào)等7個(gè)品種的種皮檢測(cè)到青霉菌；京蜜11號(hào)、綠寶石669和東方蜜一號(hào)等3個(gè)品種的種皮檢測(cè)到鐮刀菌，綠寶石669還檢測(cè)到鏈格孢菌(表4)。

2.6 種仁帶菌檢測(cè)結(jié)果

32個(gè)甜瓜品種的種子種仁帶菌檢測(cè)結(jié)果為：青甜17號(hào)、京蜜10號(hào)、京蜜15號(hào)、春甜十三、吉祥紅玉、久青蜜、香香甜瓜、盛開花、京蜜8號(hào)、YLJ一特金、東方蜜一號(hào)、金碧輝煌、京蜜9號(hào)、一特白、久久紅、京玉2號(hào)、一特金2號(hào)和玉金香等18個(gè)甜瓜品種的種仁未檢測(cè)到真菌；綠源、京蜜11號(hào)、綠寶石669、綠蘿、綠香甜、和甜九號(hào)、綠麻瓜和黃金道等8個(gè)品種種仁檢測(cè)到青霉菌；金玉滿堂和黃金道等2個(gè)品種種仁檢測(cè)到曲霉菌；京蜜11號(hào)、綠寶石669、刀摟子等3個(gè)品種種仁檢測(cè)到鐮刀菌；京蜜7號(hào)檢測(cè)到鏈格孢菌(表5)。

3 結(jié)論與討論

來自北京、河北、黑龍江、遼寧、吉林、陜西、甘肅、河南、安徽和上海等地的32個(gè)甜瓜品種的種子帶菌情況檢測(cè)結(jié)果為：干種子、種子洗滌懸浮液、水洗后種子、1% NaClO處理后種仁等均可檢測(cè)到青霉菌、曲霉菌、鐮刀菌和鏈格孢菌，但是不同品種之間的帶菌情況差異較大。21個(gè)甜瓜品種的干種子上檢測(cè)到真菌，其中金玉滿堂和綠麻瓜的帶菌率高達(dá)100%，綠寶石669、香香甜瓜、一特白、京玉2號(hào)和一特金2號(hào)的干種子檢測(cè)到鐮刀菌和鏈格孢菌；只有6個(gè)甜瓜品種的種子洗滌懸浮液中檢測(cè)到真菌；水洗后，14個(gè)甜瓜品種的種子上未檢測(cè)到真菌，但金玉滿堂種子帶菌率仍高達(dá)100%；經(jīng)1% NaClO處理后只有7個(gè)甜瓜品種的種子上檢測(cè)到真菌；經(jīng)1% NaClO處理后，19個(gè)甜瓜品種的種皮上未檢測(cè)到真菌，且所有甜瓜品種的種皮均未檢測(cè)到曲霉菌；18個(gè)甜瓜品種的種仁未檢測(cè)到真菌，京蜜11號(hào)、綠寶石669、刀摟子和京蜜7號(hào)的種仁中檢測(cè)到鐮刀菌或鏈格孢菌。本研究也從多個(gè)甜瓜品種上分離得到鐮刀菌和鏈格孢菌，這與陳祥付等[7]的研究結(jié)果相似。

已有報(bào)道表明，尖孢鐮刀菌甜瓜專化型(Fusariumoxysporumf. sp.melonis)引起甜瓜枯萎病[14]；再育鐮刀菌(F.proliferatum)和木賊鐮刀菌(F.equiseti)可引起甜瓜根莖腐[15]；腐皮鐮刀菌(F.solani)可引起甜瓜根腐病[16]。鐮刀菌可以在土壤中存活多年[17]，種子也可以傳帶鐮刀菌[7]。此外，交鏈格孢(Alternariaalternata)引起甜瓜黑斑病[18]，瓜鏈格孢(A.cucumerina)引起甜瓜葉枯病[19]，西葫蘆生鏈格孢(A.peponicola)引起甜瓜大斑病[20]。其中甜瓜黑斑病菌(A.alternata)和甜瓜葉枯病菌(A.cucumerina)以菌絲體或者分生孢子的形式在病殘?bào)w上越冬，或者分生孢子附著在種子表面越冬[21-22]；甜瓜大斑病菌(A.peponicola)以菌絲體和分生孢子分別在病葉組織內(nèi)外越冬，成為翌年初侵染源，種子是否帶菌尚待研究[23]。本研究從甜瓜種子上分離得到的鐮刀菌和鏈格孢菌種類還有待鑒定，且其對(duì)甜瓜是否有致病性、對(duì)甜瓜種子萌發(fā)是否有影響還需要進(jìn)一步研究。