多重PCR技術檢測食用魚類產(chǎn)品中β-溶血性嗜水氣單胞菌毒性基因研究

余文杰

摘要? ? 氣溶素和溶血素是β-溶血性嗜水氣單胞菌的重要毒力因子。為建立檢測食用魚類產(chǎn)品中β-溶血性嗜水氣單胞菌氣溶素基因（aerA）和溶血素基因（ahh1）的技術，本文采用多重PCR技術檢測28個來源于食用魚類產(chǎn)品的β-溶血性嗜水氣單胞菌樣本（包括鯉魚片、水、鯽魚片、鱒魚片、鰱魚片、鮭魚片和帶魚片），并用標準菌株嗜水氣單胞菌ATCC7965和分離于死蟒蛇的帶有β-溶血性毒素基因的嗜水氣單胞菌作為對照。結果表明，所有菌株樣本（100%）被證實攜帶嗜水氣單胞菌16S rRNA基因（356個堿基對），所有嗜水氣單胞菌樣本（100%）被證實攜帶ahh1毒性基因（130個堿基對），26個嗜水氣單胞菌樣本（93%）被證實攜帶aerA基因（309個堿基對）。本研究證實β-溶血性嗜水氣單胞菌菌株廣泛存在于供人類食用的魚類產(chǎn)品中，對消費者產(chǎn)生了一定的健康風險。

關鍵詞? ? 食用魚類產(chǎn)品;嗜水氣單胞菌;多重PCR;氣溶素;溶血素

中圖分類號? ? TS254.5? ? ? ? 文獻標識碼? ? A? ? ? ? 文章編號? ?1007-5739（2019）11-0217-02

Abstract? ? Aerolysin and haemolysin are viewed as important virulence factors related to the entero-toxigenicity of β-haemolytic Aeromonas hydrophila. In order to establish a method for detection of genes coding aerolysin（aerA）and haemolysin（ahh1）in β-haemolytic A. hydrophila strains isolated from edible fish products，a multiplex PCR was applied to detect the β-haemolytic A. hydrophila strains isolated from 28 samples of edible fish products（including carp cutlets，water，crucian cutlets，trout cutlets，silver carp cutlets，trout cutlets and hailtail cutlets），and the study used a reference A. hydrophila strain（ATCC 7965）and an A. hydrophila strain isolated from a dead anaconda，as positive controls with strong? β-haemolytic activity. The results showed that the chromosome gene 16S rRNA（356 bp）was confirmed in all A. hydrophila strains（100%），the gene ahh1（130 bp）was confirmed in all A. hydrophila strains（100%），and the gene aerA（309 bp）was confirmed in 26 A. hydrophila strains（93%）. The presence of β-haemolytic A. hydrophila strains in edible fish products cuases a risk to the consumer′s health.

Key words? ? edible fish product;Aeromonsa. hydrophila;multiplex PCR;aerolysin;haemolysin

嗜水氣單胞菌普遍存在于水環(huán)境中，被視為一種機會主義病原體，可以引發(fā)人類腸胃炎、傷口感染、敗血癥以及魚類的出血性敗血癥。眾所周知，嗜水氣單胞菌在魚類和魚類產(chǎn)品中流行，因而日常食用的魚類產(chǎn)品非常容易受到污染，成為傳播病原菌的載體。研究表明，食用魚類產(chǎn)品的氣單胞菌感染比例可以達到37.3%～93.0%[1]。氣單胞菌屬的分離鑒定表明，食用魚類產(chǎn)品中嗜水氣單胞菌是主要的微生物污染源。

嗜水氣單胞菌毒性因子包括溶血素、氣溶素、蛋白酶、脂酶、DNA酶，這些物質(zhì)都是引發(fā)人類和魚類疾病的主要發(fā)病因子[2]。嗜水氣單胞菌不僅可以在最佳生長溫度下形成毒性因子，而且在冰箱條件下也可以形成毒性因子。嗜水氣單胞菌引發(fā)的胃腸炎是最常見的人類疾病。從溶血性腸胃炎患者身上經(jīng)常可以分離出嗜水氣單胞菌，其原因主要是患者食用了受病原體污染的食物或水。

嗜水氣單胞菌溶血素屬于一大類造孔細菌溶細胞素當中的一種，會導致胞質(zhì)內(nèi)容物泄漏，從而破壞細胞膜，最終引發(fā)細胞死亡。嗜水氣單胞菌目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在2種主要的溶血性毒素，包括溶血素和氣溶素[3]。氣溶素是一種細胞外的可溶性親水蛋白，表現(xiàn)出溶血特性和細胞溶解特性，可以綁定到真核細胞的特定糖蛋白受體表面，從而形成毛孔。有研究顯示， β-溶血性嗜水氣單胞菌可以引起廣泛存在于兔回腸循環(huán)的積液[4]。同時有研究表明，2種β-溶血性嗜水氣單胞菌的毒素蛋白都是由具有強毒性的基因負責翻譯生產(chǎn)。aerA基因翻譯生產(chǎn)的溶血素蛋白廣泛存在于產(chǎn)毒素的菌株中。從食物和水分離得到的氣單胞菌屬菌株通常包含有毒素基因?；诖?，本文研究了基因編碼的氣溶素和溶血素是否存在于人類食用魚類產(chǎn)品中，并且證實是否屬于β-溶血性嗜水氣單胞菌，以期為其控制做出比較好的研究基礎。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 供試菌株

本試驗是通過從食用魚類產(chǎn)品中分離得到β-溶血性嗜水氣單胞菌，采用API20NE生化特性對其進行鑒定，樣本包括鯉魚片（n=132）、水（n=6）、鯽魚片（n=20）、鱒魚片（n=11）、鰱魚片（n=20）、鮭魚片（n=20）和帶魚片（n=20）。對照菌株是嗜水氣單胞菌ATCC7965，購買自中國菌種保存實驗室。同時采用分離于死蟒蛇的含有β-溶血性毒素基因的嗜水氣單胞菌作對照。本實驗室分離純化和保存所有的菌株。

1.2? ? 供試培養(yǎng)基與試劑

培養(yǎng)基和化學品是從上海一基實業(yè)有限公司購買獲取，PCR試劑盒是從深圳市長征生物科技有限公司購買獲取。引物的制備是根據(jù)前人描述的方法開展。引物是由大連寶生物工程公司進行合成，具體見表1。

1.3? ? 試驗菌株DNA提取

細菌DNA制備過程是根據(jù)制造商的產(chǎn)品說明書（北京普洛麥格生物技術有限公司）來開展。

1.4? ? PCR反應條件

多重PCR反應包括3對引物。PCR反應混合物（25 μL）中包含：12.5 μL Taq酶和1.0 μL ahh1引物，1.0 μL aerA引物，0.2 μL 16S rRNA引物和1 μL提取DNA，余量為雙蒸水。

使用PCR儀器（ABI-2720，美國貝登儀器公司）進行擴增，PCR擴增條件：95 ℃初始變性5 min，95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，50個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。

1.5? ? 電泳檢測

將擴增的DNA片段放置在2%瓊脂糖凝膠進行水平電泳，使用1xTAE緩沖溶液（0.04 MTris，0.02 mol/L醋酸，0.002 mol/L Na2EDTA）、100 V、45 min，使用8 μL PCR產(chǎn)物。

凝膠使用溴化乙錠1 μL/mL進行染色30 min，紫外線光照下觀察。

基因標準品是采用100個堿基對的DNA梯度標記物（上海啟發(fā)試驗試劑有限公司），從而對其分子量進行識別。

2? ? 結果與分析

食用魚類產(chǎn)品中β-溶血性嗜水氣單胞菌的發(fā)病情況如表2所示。經(jīng)過多重PCR證實，28個β-溶血性嗜水氣單胞菌樣本都攜帶有染色體基因16S rRNA。所有嗜水氣單胞菌樣本（100%）都攜帶有ahh1基因。26個（93%）的嗜水氣單胞菌樣本攜帶有aerA基因。aerA基因不存在于1個（25%）鯉魚片和1個（17%）帶魚片中（表3）。16S rRNA基因PCR擴增產(chǎn)物（356個堿基對）、ahh1基因擴增產(chǎn)物（130個堿基對）、aerA基因擴增產(chǎn)物（309個堿基對）以及多種食用魚類產(chǎn)品中β-溶血性嗜水氣單胞菌的檢測結果見圖1。

3? ? 結論與討論

近幾年，PCR是用于檢測食品微生物病原體的首選方法，主要原因是其具有速度快、高敏感性和特異性等特點[5]。此外，使用特定的毒力基因引物可以將致病性菌株和非致病性菌株區(qū)分開。在本研究中，使用特定的引物來證實嗜水氣單胞菌氣溶素和溶血素基因的存在，并證實這些是主要毒力因子。研究人員普遍認為，氣單胞菌屬感染的發(fā)病機制是多因素和多毒力因子綜合作用的結果[6]。一個毒力因子或其中幾個的組合可以在不同氣單胞菌屬中存在并產(chǎn)生相應的毒性。正是如此，還需要更多的研究來區(qū)分存在于不同氣單胞菌屬的幾個毒力因子，有助于更好地理解氣單胞菌屬感染的發(fā)病和流行病學機理。因此，在過去的幾年中，前人的研究主要集中在溶血素作為氣單胞菌屬的主要毒力因子。許多研究人員證實溶血性因子是其致病機理，最深入研究的是溶血素和氣溶素。

氣溶素是溶血性毒素，aerA基因負責編碼并起著關鍵作用，從而引起魚類感染。氣溶素是嗜水氣單胞菌致病的主要毒力因子，會導致紅細胞溶解，進而致魚表皮和內(nèi)臟出血。研究發(fā)現(xiàn)，氣溶素存在于所有出血性敗血病魚體分離得到的嗜水氣單胞菌以及從60%的健康魚嗜水氣單胞菌菌株分離得到[6]。

根據(jù)前人研究，一個氣單胞菌屬菌株可以同時攜帶編碼幾個毒力因子的基因[7]。本文研究發(fā)現(xiàn)，ahh1基因存在于食用魚類產(chǎn)品的41%溫和氣單胞菌和55%嗜水氣單胞菌中。aerA和ahh1基因被發(fā)現(xiàn)在68%嗜水氣單胞菌中存在。此外，即使只有aerA基因，β-溶血性嗜水氣單胞菌也表現(xiàn)出細胞毒性特性。不同的是，溶血性溫和氣單胞菌和非溶血性嗜水氣單胞菌沒有攜帶aerA基因。而分離來自于淡水魚類產(chǎn)品53%的嗜水氣單胞菌被發(fā)現(xiàn)含有aerA基因。分離來自海洋魚類分離得到的89%嗜水氣單胞菌發(fā)現(xiàn)存在氣溶素基因aerA和溶血素基因hlyA。同樣的研究結果也證實，新鮮的鮭魚、鱒魚魚片和切片以及真空包裝的熏制鱒魚和鮭魚片中分離得到的嗜水氣單胞菌都含有aerA基因，而92%的樣本含有hlyA基因[8]。前人研究表明，冷凍魚分離得到的β-溶血性嗜水氣單胞菌株都含有氣溶素基因[9]。相反的結果是，壽司、水生生物沙拉、魚肉醬和蝦分離得到嗜水氣單胞菌沒有發(fā)現(xiàn)溶血素基因和氣溶素基因[8]。本研究中，β-溶血性嗜水氣單胞菌檢測結果都含有ahh1基因，而93%的樣本含有aerA基因，其中1株從鯉魚片和1株從帶魚片分離得到的菌株均沒有攜帶aerA基因。

前人研究表明，嗜水氣單胞菌污染的魚和魚產(chǎn)品都可以引發(fā)人體的腹瀉[10]。大多數(shù)情況下，此類疾病與水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)品或冷藏食品直接食用息息相關。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，氣單胞菌屬菌株與其他菌株相比較，同時攜帶有ahh1和aerA基因的菌株具有更高的細胞毒性滴度[11]，從而證實β-溶血性嗜水氣單胞菌氣溶素是一種重要的毒力因子。嗜水氣單胞菌的致病性是多因素造成的，可能取決于各種毒性因子的協(xié)同效應。在前人研究中，發(fā)現(xiàn)所有分離來自魚的嗜水氣單胞菌菌株含有aerA（100%）和分離來自腹瀉患者的菌株含有hlyA（83%）基因。溶血素也是人類氣單胞菌屬感染的發(fā)病機理重要組成成分。前人研究表明，從腹瀉病人的糞便中分離出6個嗜水氣單胞菌菌株都含有β-溶血性ahh1基因，1/2的菌株同時含有氣溶素編碼基因[12]。

考慮到免疫活性差和免疫力低下的人群越來越多，有可能受到氣單胞菌屬感染潛在風險，而且廣泛的氣單胞菌屬存在于環(huán)境中，長期監(jiān)測潛在致病性氣單胞菌屬有助于公眾健康。本研究表明，毒性嗜水氣單胞菌的PCR鑒定方法相比傳統(tǒng)的微生物鑒定方法，非常有用，具有敏感、快速的特點。本研究結果證實，嗜水氣單胞菌菌株存在毒力基因編碼毒力因子。這些菌株是危險的，有可能導致食物中毒。食用魚類產(chǎn)品的安全性受到眾多因素的影響，包括魚的來源、魚的特性和加工方法。新鮮的魚經(jīng)過適當?shù)募訜徇M行食用是低風險的，然而如果食用生魚，不夠熟或僅進行簡單處理會增加食用風險。食用魚類產(chǎn)品含有嗜水氣單胞菌對人類是危險的，特別是對敏感的人群，例如兒童、老年人和免疫功能不全的人。

本研究證實人類食用的魚類產(chǎn)品存在β-溶血性嗜水氣單胞菌。此外，研究發(fā)現(xiàn)，所有這些菌株攜帶ahh1基因，多數(shù)β-溶血性嗜水氣單胞菌攜帶aerA基因，從而證實β-溶血性嗜水氣單胞菌溶血素基因和氣溶素基因普遍存在于魚類和魚類產(chǎn)品中，對消費者的健康造成潛在風險。因此，有必要通過多重PCR檢測技術進行快速有效的β-溶血性嗜水氣單胞菌的分離鑒定，預防其對人體產(chǎn)生危害。

4? ? 參考文獻

[1] JANDA J，ABBOTT S L.The genus Aeromonas：taxonomy，pathogenicity and infection[J].Clin Microbiol Rev，2010，23（1）：35-73.

[2] SUNEE K，SUWAT D，RUNGRAWAN C，et al.Didtribution of Aeromonas hydrophila Serogroups in different clinical samples and the development of polyclonal antibodies for rapid identification of the genus Aeromonas by direct agglutination[J].Microbiol Immunol，2002，46（12）：875-879.

[3] GRIM C J，KOZLOVA E V，SHA J，et al.Characterization of Aeromonas hydrophila wound pathotypes by comparative genomic and functional analyses of virulence genes[J].Microbiology，2013，4（2）：64-73.

[4] ANSARY A，HANEEF R M，TORRES J L，et al.Plasmids and antibiotic resistance in Aeromonas hydrophila isolated in Malaysia from healthy and diseased fish[J].J Fish Dis，1992，15（2）：191-196.

[5] GONZ？魣LEZ-SERRANO C J，SANTOS J A，GARC？魱A-L？魷PEZ M L，et al.Virulence markers in Aeromonas hydrophila and Aeromonas veronii biovar sobria isolates from freshwater fish and from a diarrhoea case[J].J Appl Microbiol，2002，93（3）：414-419.

[6] SUBASHKUMAR R，THAYUMANAVAN T，VIVEKANANDHAN G，et al.Occurrence of Aeromonas hydrophila in acute gasteroenteritis among children[J].Indian J Med Res，2006，123（1）：61-66.

[7] 儲衛(wèi)華，陸承平.PCR擴增特異性16SrDNA和溶血素基因檢測致病性嗜水氣單胞菌[J].水產(chǎn)學報，2005，29（1）：79-82.

[8] 王遠微，湯承，于學輝，等.三重PCR檢測魚類致病性嗜水氣單胞菌[J].微生物學報，2008，48（7）：947-951.

[9] CHEN Q，YAN Q，WANG K，et al.The portal of entry for pathogenic Vibrio alginolyticus into Pseudosciaene crocea and characteristic of the bacterial adhesion to the mucus[J].Dis Aqu Organ，2008，80：181-188.

[10] 郭松林，關瑞章，柳佩娟.雙重PCR法快速檢測歐鰻鱺嗜水氣單胞菌[J].集美大學學報（自然科學版），2007，12（4）：294-300.

[11] SHEMESH M，TAM A，STEINBERG D.Differential gene expression profiling of Streptococcus mutans cultured under biofilm and planktonic conditions[J].Microbiology，2007，153：1307-1317.

[12] 毛寧，王志明，鄭鶯，等.嗜水氣單胞菌與其拮抗菌R-15的生長曲線研究[J].福建師范大學學報（自然科學版），2008，24（1）：82-85.

基金項目? ?福建省科技廳科學研究項目（JK2012012）。

作者簡介? ?余文杰（1977-），男，福建漳州人，碩士，講師，從事生物科學的教學及科研工作。

收稿日期? ?2019-02-22