不同免疫學(xué)檢驗(yàn)方法對(duì)混合精斑的檢測(cè)及應(yīng)用

董敏安，李美麗，蔡銘升

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510000；2.湛江市公安局，廣東 湛江 524000）

法醫(yī)學(xué)鑒定中，精斑是性犯罪的重要證據(jù)之一，其作用不可替代[1]。實(shí)際工作中，檢材常常存在精斑混合血斑、多人精斑混合、精子量過(guò)少等情況，常規(guī)的差異裂解法不能解決上述問(wèn)題[2]。本研究通過(guò)前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen，PSA）膠體金免疫試紙條法、免疫磁珠法以及激光捕獲顯微切割技術(shù)分別對(duì)混合精斑進(jìn)行處理和檢驗(yàn)，以單一精斑作為對(duì)照，并將上述方法聯(lián)用于實(shí)際案件，以期為混合精斑的分離確證及研究更好的檢驗(yàn)方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本

本研究精液樣本來(lái)自3名健康男性志愿者。在3名志愿者的精液樣本中各吸取1 mL分別滴于棉質(zhì)內(nèi)褲的不同位置，制成3份純精斑樣品。再?gòu)?名志愿者的精液樣本中各吸取0.5mL加入同一個(gè)離心管中，置于渦旋振蕩器上充分混合后，滴在上述棉質(zhì)內(nèi)褲的空白區(qū)域上，制成3名志愿者的混合精斑樣品。樣品陰干后置于25℃室內(nèi)環(huán)境保存?zhèn)溆?。同時(shí)檢測(cè)3名志愿者的血樣作為分型參照。

1.2 PSA膠體金免疫試紙條法

分別剪取1cm×1cm純精斑和混合精斑樣品置于不同離心管中，各加入900μL TNE緩沖液，置于渦旋振蕩器上振蕩10min，將PSA膠體金免疫試紙條插入離心管內(nèi)（液面不超過(guò)試劑條上的標(biāo)志線），5 min內(nèi)觀察結(jié)果。剪取內(nèi)褲空白區(qū)域，重復(fù)以上步驟作為陰性對(duì)照。

1.3 免疫磁珠法

1.3.1 模擬差異裂解法第一步制備精子沉淀物

分別剪取1cm×1cm純精斑和混合精斑樣品置于不同離心管中，各加入 900 μL TNE緩沖液、100 μL 10%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate，SDS）溶液、20 μL 10 mg/mL蛋白酶K，混勻后置于56℃恒溫干浴儀中消化3 h，模擬差異裂解法第一步去除女性上皮細(xì)胞的過(guò)程。振蕩10 s，去除載體，轉(zhuǎn)移全部消化液至另一個(gè)離心管中，以16000×g離心5min，去掉上清液，加入900 μL TNE緩沖液，以16 000×g離心5 min，去掉上清液，加入700 μL去離子水，振蕩10 s后以16000×g離心5min，重復(fù)水洗2次，即得精子沉淀物。

1.3.2 常規(guī)差異裂解法第二步提取精子DNA

將精子沉淀物置于離心管中，加入160 μL 5%Chelex-100螯合樹脂、20 μL 10 mg/mL的蛋白酶K、8μL 1mol/L二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT），混勻后置于56℃恒溫干浴儀中孵育3h，振蕩10s，置于98℃恒溫干浴儀中孵育10min，振蕩10s后以16000×g離心5min，取100μL上清液，使用QIAquick PCR Purification Kit（德國(guó)Qiagen公司），按照說(shuō)明書操作提取得到上述樣品的DNA作為對(duì)照樣品，于-20℃保存。

1.3.3 免疫磁珠法替代第二步提取精子DNA

用ML-超微量磁珠法DNA提取試劑盒（長(zhǎng)春市博坤生物科技有限公司）在KingFisherTM自動(dòng)純化系統(tǒng)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）上進(jìn)行提取。在上述精子沉淀物中分別加入250 μL試劑盒配套胍鹽裂解液、20μL 10mg/mL蛋白酶K、8μL 1mol/L DTT，振蕩10s，56℃下孵育3h，按ML-超微量磁珠法DNA提取試劑盒操作說(shuō)明書，分別將含裂解液的混合溶液平均移至試劑盒配套試劑條（封裝有試劑的塑料條，A、B、C孔為加樣孔，D、E、F孔為漂洗孔，G孔為磁珠孔，H孔為洗脫孔）的A、B、C孔上，在H孔中加入30 μL去離子水，置于KingFisherTM自動(dòng)純化系統(tǒng)上，裝好磁套，按操作規(guī)程完成自動(dòng)提取純化，最終得到約25μL的DNA產(chǎn)物。

取1 μL上述DNA提取產(chǎn)物，使用PowerPlex?Y23系統(tǒng)（美國(guó)Promega公司）進(jìn)行擴(kuò)增，采用10 μL擴(kuò)增體系，以DNA標(biāo)準(zhǔn)品2800M作為陽(yáng)性對(duì)照，在3100-Avant基因分析儀（美國(guó)AB公司）上進(jìn)行電泳。

1.4 激光捕獲顯微切割技術(shù)

分別剪取1cm×1cm純精斑和混合精斑樣品置于不同離心管中，浸泡于900μL去離子水中，37℃下振蕩孵育30min，去除載體，以16000×g離心3min，去掉上清液，留約50μL液體，振蕩混勻，涂于聚萘二甲酸乙二醇酯（polyethylene naphthalate，PEN）覆膜玻片上，載玻片在室溫下自然干燥后，用激光捕獲顯微切割系統(tǒng)（德國(guó)Zeiss公司）進(jìn)行捕獲。

在鏡下對(duì)樣本中單個(gè)精子進(jìn)行切割，并彈射到加了0.75 μL含有0.1 mg/mL蛋白酶K和5 mmol/L DTT的裂解液的AG480F AmpliGrid微量反應(yīng)玻片（美國(guó)Beckman Coulter公司）的反應(yīng)位點(diǎn)上，用封閉油封閉。每個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)收集1個(gè)精子細(xì)胞，每個(gè)精斑樣品分別捕獲96個(gè)精子細(xì)胞，56℃裂解2h，99℃變性10min。AG480F AmpliGrid微量反應(yīng)玻片在使用前置于紫外交聯(lián)儀（國(guó)產(chǎn)）內(nèi)，紫外交聯(lián)2min，以防止DNA污染。

使用PowerPlex?Y23系統(tǒng)（美國(guó)Promega公司）對(duì)上述DNA提取產(chǎn)物進(jìn)行低體積擴(kuò)增，采用0.75 μL+0.75μL擴(kuò)增體系，以DNA標(biāo)準(zhǔn)品2800M作為陽(yáng)性對(duì)照，選取覆膜玻片上無(wú)細(xì)胞區(qū)域作為陰性對(duì)照，在3100-Avant基因分析儀（美國(guó)AB公司）上進(jìn)行電泳。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用GeneMapperIDv3.2軟件（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）對(duì)獲得的STR數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。以等位基因峰值大于200相對(duì)熒光單位（relative fluorescence unit，RFU）為基因座可判型標(biāo)準(zhǔn)，本研究以檢出不少于13個(gè)等位基因?yàn)橛行Х中?。?jì)算分型成功率、非特異擴(kuò)增率、等位基因丟失率。分型成功率=有效分型次數(shù)/重復(fù)次數(shù)；非特異擴(kuò)增率=出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增的基因座/（23×重復(fù)次數(shù)）；等位基因丟失率=等位基因丟失條帶總數(shù)/（3人檢測(cè)血樣得出的Y-STR條帶數(shù)相加×重復(fù)次數(shù)/3）。

對(duì)于沒(méi)有獲得完整分型的數(shù)據(jù)，把多次捕獲后獲得的分型進(jìn)行綜合分析處理，將結(jié)果相互印證、疊加（對(duì)結(jié)果進(jìn)行分類，把類似的結(jié)果歸一，用已檢出位點(diǎn)填補(bǔ)未檢出位點(diǎn)的數(shù)據(jù)，再跟另外一個(gè)類似結(jié)果的樣本作比對(duì)）。

2 結(jié) 果

2.1 PSA膠體金免疫試紙條法檢測(cè)情況

所取3份純精斑和1份混合精斑樣品經(jīng)PSA膠體金免疫試紙條法檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)各樣本在測(cè)試區(qū)和控制區(qū)內(nèi)均出現(xiàn)一條紫紅色條帶，提示4份檢材均含有人精液PSA，陰性對(duì)照未見(jiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。

2.2 常規(guī)差異裂解法檢測(cè)情況

所取3份純精斑和1份混合精斑樣品檢出的STR分型結(jié)果中，RFU值較低，非特異擴(kuò)增較多，部分基因座未能獲得STR分型，甚至未檢出結(jié)果。

2.3 以免疫磁珠法替代常規(guī)差異裂解法檢測(cè)情況

經(jīng)KingFisherTM自動(dòng)純化系統(tǒng)完成自動(dòng)提取純化的4份樣品的STR分型結(jié)果中：3份單一精斑樣品均得到完整STR分型結(jié)果，RFU值在3000～6000，雜合子及單熒光色各峰值間高低均衡無(wú)雜帶；1份混合精斑樣品經(jīng)免疫磁珠法提取后擴(kuò)增，得到混合Y-STR分型?；旌暇遈-STR分型見(jiàn)圖1。

圖1 混合精斑樣品的Y-STR分型圖譜

2.4 激光捕獲顯微切割技術(shù)檢測(cè)情況

3份純精斑樣品分別捕獲96個(gè)精子細(xì)胞，共288個(gè)樣本，經(jīng)擴(kuò)增分別獲得40、38、28共106種分型，除了直接獲得的完整分型外，把多次捕獲后獲得的分型綜合分析處理，獲得的3名志愿者的分型與經(jīng)免疫磁珠法提取的Y-STR分型結(jié)果一致。分型成功率為84.00%，總體分型情況見(jiàn)表1。非特異擴(kuò)增率為1.47%，等位基因丟失率為25.40%。

利用激光捕獲顯微切割技術(shù)捕獲混合精斑上的單一精子細(xì)胞，低體積擴(kuò)增后得到單一Y-STR分型。

表1 單一精斑的Y-STR分型結(jié)果

2.5 案例應(yīng)用

2.5.1 簡(jiǎn)要案情

某地發(fā)生一起殺人案，中心現(xiàn)場(chǎng)周圍遺留大量物證。由于死者為女性，按照常規(guī)提取女性死者的陰道擦拭物，內(nèi)褲、身體上的可疑斑跡，并在現(xiàn)場(chǎng)尋找相關(guān)的物證，以證明死者死前是否有性行為，為案件的偵查提供方向。

2.5.2 檢驗(yàn)方法

按上述PSA膠體金免疫試紙條法對(duì)現(xiàn)場(chǎng)檢材進(jìn)行篩選，選出陽(yáng)性結(jié)果的有效檢材，并選取陰性結(jié)果的檢材作為對(duì)照。

把上述陽(yáng)性及陰性結(jié)果的檢材按1.3中所述方法處理后，進(jìn)行后續(xù)的擴(kuò)增和電泳。

把死者陰道擦拭物應(yīng)用差異裂解法第一步消化女性上皮細(xì)胞后用激光捕獲顯微切割技術(shù)對(duì)單精子進(jìn)行捕獲，進(jìn)行低體積擴(kuò)增和電泳。

2.5.3 結(jié)果

經(jīng)PSA膠體金免疫試紙條法檢測(cè)，女性死者的陰道擦拭物、內(nèi)褲以及現(xiàn)場(chǎng)樹葉上提取的可疑斑跡在測(cè)試區(qū)和控制區(qū)內(nèi)均出現(xiàn)一條紫紅色線條，提示為陽(yáng)性結(jié)果，身體上的可疑斑跡以及其他相關(guān)物證僅在控制區(qū)內(nèi)出現(xiàn)一條紫紅色線條，提示為陰性結(jié)果。

檢材經(jīng)超微量免疫磁珠法配合差異裂解法處理后擴(kuò)增，現(xiàn)場(chǎng)樹葉上提取的可疑斑跡中檢出單一Y-STR分型，死者陰道擦拭物及內(nèi)褲均檢出混合Y-STR分型，不排除包含現(xiàn)場(chǎng)樹葉上可疑斑跡中檢出的Y-STR分型。

利用激光捕獲顯微切割技術(shù)分離混合精斑，經(jīng)3130xl基因分析儀（美國(guó)AB公司）電泳后，經(jīng)綜合分析處理，獲得兩名男性的Y-STR分型，其中一名男性的Y-STR分型與現(xiàn)場(chǎng)樹葉上提取的可疑斑跡檢出的單一Y-STR分型相同。

2.5.4 案件偵查情況

獲得兩名嫌疑人的Y-STR分型后，對(duì)現(xiàn)場(chǎng)周邊村落的不同家族各提取一名男性血樣進(jìn)行排查，樹葉上可疑斑跡檢出的Y-STR分型與某村中一王姓家系的Y-STR分型成功匹配，對(duì)精斑檢材提取產(chǎn)物加做常染色體STR檢測(cè)后，繼續(xù)對(duì)該家族內(nèi)適齡男性取血樣進(jìn)行排查，最終認(rèn)定了嫌疑人王某。在證據(jù)面前，王某供認(rèn)了其強(qiáng)奸殺人的犯罪事實(shí)，案件得以快速破獲。Y-STR檢測(cè)技術(shù)在該案件中起到了重要作用。后經(jīng)繼續(xù)偵查查明，混合精斑內(nèi)另外一名男性的YSTR分型與女性死者丈夫的Y-STR分型一致。

3 討 論

在案件的實(shí)際應(yīng)用中，由于某些類型的案件檢材量非常大，如何快速選定有效檢材是DNA檢驗(yàn)工作中的重點(diǎn)，關(guān)系到能否以最快的速度獲取嫌疑人的信息從而破獲案件。在性犯罪中，含有精斑的檢材是檢驗(yàn)的重點(diǎn)，應(yīng)用PSA膠體金免疫試紙條法可從大量繁雜的檢材中批量進(jìn)行篩選，從而獲得有效的精斑檢材，大大節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間[3]。差異裂解法是當(dāng)前檢測(cè)精斑的方法中比較簡(jiǎn)便和高效率的方法，但是由于檢材中可能存在抑制后期擴(kuò)增和電泳的物質(zhì)，常常使分型圖譜不理想，應(yīng)用免疫磁珠法替代差異裂解法第二步的回收步驟，可有效去除檢材中的雜質(zhì)，提高精子DNA的提取效率，獲得高純度的DNA，有利于擴(kuò)增和電泳[4]。針對(duì)精斑檢材中可能存在的混合精斑，傳統(tǒng)方法無(wú)法快捷地分離出單一的STR分型，應(yīng)用激光捕獲顯微切割技術(shù)對(duì)混合精斑中的單一精子進(jìn)行捕獲[5]，經(jīng)低體積擴(kuò)增并對(duì)結(jié)果進(jìn)行綜合分析處理后，可獲得完整的單一STR分型。值得一提的是，經(jīng)過(guò)去除女性上皮細(xì)胞后再進(jìn)行激光捕獲顯微切割，可有效減少上皮細(xì)胞對(duì)捕獲精子所帶來(lái)的影響，但同時(shí)在消化清洗的過(guò)程中，精子細(xì)胞也會(huì)出現(xiàn)丟失，因此，將激光捕獲顯微切割技術(shù)應(yīng)用在精子量本來(lái)就少的檢材中時(shí)要慎重[6]。

在本次案例應(yīng)用中，應(yīng)用PSA膠體金免疫試紙條法對(duì)案件檢材進(jìn)行快速篩選，得到有效的精斑檢材后，用差異裂解法對(duì)精斑進(jìn)行消化，用免疫磁珠法替代消化第二步，電泳發(fā)現(xiàn)有混合分型，再用激光捕獲顯微切割技術(shù)對(duì)此類檢材進(jìn)行進(jìn)一步處理，最終獲得單一Y-STR分型。需要注意的是，Y-STR呈父系遺傳，因此同一父系內(nèi)的所有男性個(gè)體均具有同樣的Y-STR，因此并不能根據(jù)Y-STR分型結(jié)果進(jìn)行個(gè)體識(shí)別，其主要作用在于家系排查，可結(jié)合常染色體STR檢測(cè)技術(shù)，依靠統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，對(duì)個(gè)體進(jìn)行精準(zhǔn)識(shí)別。