應用多種遺傳標記甄別全同胞和半同胞關(guān)系1例

廖勇，吳峰，侯東林，吳艷玲，陶歡，李成濤，萬華靖

（1.四川基因格司法鑒定所，四川 成都 610041；2.司法鑒定科學研究院 上海市法醫(yī)學重點實驗室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海 200063）

同胞關(guān)系鑒定是法醫(yī)物證學親緣關(guān)系鑒定中的難點，特別是在全同胞鑒定案例中，在當事人隱瞞等原因造成存在半同胞關(guān)系而鑒定人不知情的情況下，會干擾甚至造成錯誤鑒定意見，讓鑒定機構(gòu)和鑒定人承擔較高風險。

目前，同胞關(guān)系鑒定使用的遺傳標記包括常染色體短串聯(lián)重復（short tandem repeat，STR）序列基因座、性染色體STR基因座和線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）高變區(qū)（hypervariable region，HVR）序列，判別方法主要包括基于常染色體STR基因座分型結(jié)果的狀態(tài)一致性評分法（identity by state，IBS）[1]、ITO法、判別函數(shù)法[2-3]及家系重建[4]等。2014年，我國司法部司法鑒定管理局針對全同胞關(guān)系鑒定頒布了《生物學全同胞關(guān)系鑒定實施規(guī)范》（以下簡稱《規(guī)范》）[1]，按照《規(guī)范》，全同胞鑒定采用的標準遺傳標記是常染色體STR基因座（必要時補充性染色體STR基因座、mtDNA高變區(qū)序列分析），判別方法為IBS評分法，該方法簡單、直觀、準確率較高并容易掌握，但該《規(guī)范》使用的適用范圍是甄別全同胞與無關(guān)個體關(guān)系。在實際檢案中，由于當事人隱瞞、不知情等原因造成誤將半同胞關(guān)系當作全同胞關(guān)系來鑒定，會造成較高鑒定風險。

筆者在實際工作中受理了一起存疑全同胞鑒定案例，綜合應用了多種遺傳標記（常染色體STR基因座、性染色體STR基因座以及mtDNA HVR序列）、多種判斷標準（基于常染色體STR的IBS法、ITO法、判別函數(shù)法及家系重建），最終獲得了可靠的鑒定意見，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 對象

據(jù)委托方自訴，張氏四兄妹是同父同母全同胞兄妹，父母去世，現(xiàn)需要上戶口，特委托四川基因格司法鑒定所對張氏四兄妹之間是否存在全同胞關(guān)系進行檢驗和鑒定。

張氏四兄妹：張1（男）、張2（男）、張3（女）、張4（女），四人指尖血血痕（載體為濾紙片）。

1.2 方法

按照《法庭科學DNA實驗室檢驗規(guī)范》[5]提取上述檢材的DNA，常染色體STR基因座分型采用EX20試劑盒（無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司），X染色體STR（X-STR）基因座分型采用X19試劑盒（無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司），Y染色體STR（Y-STR）基因座分型采用Data Y24試劑盒（無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司）。對上述PCR產(chǎn)物，用Applied BiosystemsTM3730xl基因分析儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行毛細管電泳和基因型分析。IBS評分及同胞關(guān)系判定依據(jù)《規(guī)范》[1]進行，19個必檢基因座同胞關(guān)系判定標準：（1）IBS≥22，傾向性認為全同胞；（2）22＞IBS＞13，無法給出傾向性意見；（3）IBS≤13，傾向性認為無關(guān)個體。

全同胞指數(shù)（full sibling index，F(xiàn)SI）、半同胞指數(shù)（half sibling index，HSI）及同胞關(guān)系判定參照文獻[2-3]采用ITO法計算，15個基因座同胞關(guān)系判定標準：（1）FSI和 HSI均＜1為無關(guān)個體；（2）FSI∶HSI≥1為全同胞關(guān)系；（3）FSI∶HSI＜1為半同胞關(guān)系。

判別函數(shù)法計算及同胞關(guān)系判定參照文獻[3]進行，將15個基因座上等位基因全不同的基因座數(shù)、全相同的基因座數(shù)，代入全同胞-半同胞鑒別函數(shù)公式，得到全同胞D值（DFS4）、半同胞D值（DHS4），按以下標準進行判定：（1）DFS4＞DHS4為全同胞關(guān)系；（2）DFS4＜DHS4為半同胞關(guān)系。

mtDNA提取及HVR-Ⅰ、HVR-Ⅱ序列分析按照《法庭科學DNA實驗室檢驗規(guī)范》[5]進行，PCR引物設(shè)計和擴增體系參照文獻[6]，PCR產(chǎn)物測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

2 結(jié) 果

2.1 常染色體STR基因座分型結(jié)果分析

張氏四兄妹血痕的D3S1358等19個常染色體STR基因分型結(jié)果見表1。

表1 張氏四兄妹常染色體STR基因座分型結(jié)果

依據(jù)以上常染色體STR分型結(jié)果，參照《規(guī)范》[1]，對張氏四兄妹樣本兩兩之間進行IBS評分，獲得累積IBS值（表2）：張2、張3、張4之間傾向性認為是全同胞關(guān)系，張1與張2、張3、張4之間全同胞關(guān)系無法給出傾向性意見。

表2 張氏四兄妹IBS評分

為進一步驗證和明確張氏四兄妹之間的同胞關(guān)系，同樣依據(jù)常染色體STR分型結(jié)果，得到張氏四兄妹之間在D3S1358等15個基因座上的FSI、HSI值及FSI∶HSI值。結(jié)果（表3）提示：張2、張3、張4兩兩之間存在全同胞關(guān)系，這與IBS結(jié)果相一致；張1與張2、張3、張4之間可能存在半同胞關(guān)系，但是需要進一步佐證。

為了驗證張1與張2、張3、張4之間半同胞關(guān)系，采用判別函數(shù)法得到張氏四兄妹之間在D3S1358等15個基因座上DFS4、DHS4：張2、張3、張4兩兩之間存在全同胞關(guān)系，這一結(jié)果再次得到支持；張1分別與張2、張3、張4之間存在半同胞關(guān)系，這一結(jié)果和ITO法相一致（表4）。

表3 張氏四兄妹FSI∶HSI比值

表4 張氏四兄妹DFS4、DHS4值

表5 張氏四兄妹X染色體STR基因座分型結(jié)果

2.2 性染色體STR基因座分型結(jié)果及mtDNA HVR測序分析

為支持張1與張2、張3、張4之間半同胞關(guān)系，并進一步分析是同母異父還是同父異母關(guān)系，對張氏四兄妹樣本進行X-STR和Y-STR基因分型以及mtDNA HVR-Ⅰ和HVR-Ⅱ測序分析。

X-STR基因分型結(jié)果（表5）顯示：張3、張4在每個基因座上均能找到一個相同的分型（來自相同生父），結(jié)合張2基因型（來自相同生母），可推斷出全同胞張2、張3、張4的生父母基因型（表6），并且張1基因型均能從推斷的生母基因型中找到來源（表6），由此提示張氏四兄妹來自同一生母。

表6 張2、張3、張4生父母X染色體STR基因型推斷及與張1比對

mtDNA HVR-Ⅰ和HVR-Ⅱ測序結(jié)果顯示，張1、張2、張3、張4 mtDNA與標準序列（Anderson序列）相比，在HV-Ⅰ（16024～16415nt）、HV-Ⅱ（73～340nt）堿基片段發(fā)生變異的序列一致（16129SG-A，16183SAC，16189ST-C，16193IC，16217ST-C，16234SC-T，263SA-G，306ICCC，315IC）。mtDNA屬于母系遺傳標記，可用來進行母系親緣認定，根據(jù)遺傳學原理和遺傳規(guī)律，同一母系個體的mtDNA來自相同的母系祖先，結(jié)合X-STR分型結(jié)果，支持張1、張2、張3、張4來自同一生母。

Y-STR基因分型結(jié)果顯示，張1與張2在DYS3891、DYS389Ⅱ、DYS439、DYS456、DYS458、DYS437、DYS635、DYS448、DYS527a/b、DYS447、DYS19、DYS392、DYS522、DYS393、DYS390、DYS385a/b共18個Y染色體STR基因座上分型不一致。Y染色體為男性所特有，Y染色體STR是父系遺傳標記之一，可用來進行父系親緣認定，根據(jù)遺傳規(guī)律，同一父系的男性Y染色體來自相同的父系祖先，因此排除張1與張2來自同一生父。

至此，多種遺傳標記（常染色體STR、性染色體STR、線粒體DNA）檢測結(jié)果相互驗證和補充，綜合分析后，支持以下鑒定意見：（1）支持張2、張3、張4兩兩之間存在全同胞關(guān)系；（2）支持張1分別與張2、張3、張4之間為同母異父半同胞關(guān)系。

根據(jù)此鑒定意見，通過常染色體STR結(jié)果推斷張2、張3、張4父母基因型，并與張1比對驗證。結(jié)果顯示，推斷的張2、張3、張4父母基因型均符合遺傳規(guī)律（單個基因座不超過4個基因型）；從推斷的父母基因型中，在D3S1358等16個基因座，張1基因型能找到來源，但在D13S317、D8S1179、D5S818基因座只能找到一個等位基因來源，不符合同父同母遺傳規(guī)律，支持張1與張2、張3、張4半同胞關(guān)系。

3 討 論

同胞關(guān)系鑒定是親權(quán)關(guān)系鑒定中檢案量僅次于親子鑒定的項目，但由于技術(shù)手段的有限性及實際工作的復雜性，一直是司法鑒定中的難點和研究熱點。

《規(guī)范》中的IBS法是通過計算兩個個體間常染色體STR共有等位基因數(shù)來判斷全同胞關(guān)系，與ITO、判別函數(shù)法相比，無需使用等位基因頻率數(shù)據(jù)，計算簡單、直觀、有效，準確率在99%以上[7]，已廣泛用于全同胞關(guān)系鑒定[8]，但在使用時要注意兩點：（1）適用范圍。適用于在雙親皆無情形下甄別生物學全同胞與無關(guān)個體關(guān)系，若兩名被鑒定人之間存在其他親緣關(guān)系（如半同胞、堂表親等），則本《規(guī)范》不適用。（2）系統(tǒng)效能。檢測19、29、39個STR基因座時，系統(tǒng)效能分別約為75%、85%、95%；增加STR基因座雖然能提高系統(tǒng)效能，但是要求增加的STR基因座個體識別率（discrimination power，DP）值要大于0.9。筆者在實際鑒定工作中（包括本案例）遇到多起由于當事人隱瞞等原因，誤將半同胞作為全同胞鑒定的案例，在客觀上違背了《規(guī)范》使用前提。根據(jù)筆者經(jīng)驗，在增加STR基因座檢測時，若選擇的試劑盒基因座大部分DP值小于0.9則可能會造成誤判，同時由于目前市面上很少有DP值均大于0.9的商品化試劑盒可用，因此，本案例使用必檢的19個基因座（準確率依然大于99%），雖然系統(tǒng)效能相對較低，出現(xiàn)對張1與張2、張3、張4是否存在全同胞關(guān)系無法給出傾向性意見情況，但錯判率極低[9]。因此，在使用《規(guī)范》時鑒定人要注意甄別和核實委托方實際情況，注意適用范圍及系統(tǒng)效能，并建議同時使用其他方法和增加遺傳標記加以相互驗證和甄別，以免不當使用試劑盒和方法干擾鑒定意見、甚至錯誤鑒定。

ITO法是計算個體間某種血緣關(guān)系的經(jīng)典方法，與IBS法相比，可用于全同胞、半同胞、無關(guān)個體關(guān)系鑒定，適用范圍更廣，但是需要等位基因頻率數(shù)據(jù)、計算較為復雜，鑒定人較難掌握。陸惠玲等[3]利用日常鑒定累積的1050個樣本，通過15個常染色體STR基因分型結(jié)果在ITO法基礎(chǔ)上建立了一套價值較高的鑒定全同胞、半同胞的方法，指出FSI∶HSI≥1與FSI∶HSI＜1可分別作為全同胞與半同胞的判別標準，交互準確率為87.5%；同時在此基礎(chǔ)上建立了全同胞-半同胞等4組判別函數(shù)，進一步簡化了計算，只需根據(jù)分型結(jié)果統(tǒng)計等位基因匹配情況，帶入相應公式求出D值，比較D值高低即可作出判斷，準確率在84.4%～97.7%。本案中，IBS法無法對張1與張2、張3、張4間全同胞關(guān)系給出傾向性意見，使用ITO及判別函數(shù)法計算后，提示張1與張2、張3、張4間存在半同胞關(guān)系，初步甄別出本案中隱藏的半同胞關(guān)系，但是由于準確率較低，還需其他遺傳標記支持。

由于父系及母系遺傳特點，性染色體STR以及mtDNA高變區(qū)序列多態(tài)性檢測在同胞鑒定中可作為重要的支持和補充證據(jù)。X-STR可作為同父女性間鑒定的遺傳標記，若參與鑒定的個體足夠多，還可用于家系重建并為同母關(guān)系鑒定提供依據(jù)[7]；無論性別，mtDNA高變區(qū)序列多態(tài)性可作為同母關(guān)系鑒定的重要參考遺傳標記；Y-STR是同父男性間鑒定的可靠遺傳標記。本案中，由于參與鑒定人較多，結(jié)合性別，綜合使用了X和Y染色體STR及mtDNA檢測，結(jié)合常染色體STR分型結(jié)果，支持張2、張3、張4之間存在全同胞關(guān)系，支持張1與張2、張3、張4存在同母異父半同胞關(guān)系。

基于常染色體STR分型結(jié)果的家系重建，在隔代親緣鑒定中具有重要的參考價值[4]。本案例由于參與鑒定的全同胞個體較多，根據(jù)常染色體STR分型結(jié)果可推斷出父母基因型，根據(jù)孟德爾遺傳規(guī)律，在每一個父母基因座可推斷出≤4種基因型，其他存疑的全同胞或半同胞個體可在推斷出的每一個基因座找到兩個均相同或至少一個相同基因型，比對結(jié)果可支持最終的鑒定意見。

隨著社會發(fā)展，親權(quán)鑒定工作不斷增多，案情的復雜性和風險性隨之增高，在疑難、復雜、存疑的鑒定案例中要注意甄別和核實，而多種遺傳標記的綜合應用是鑒定機構(gòu)和鑒定人降低鑒定風險、獲得可靠鑒定意見的有效手段[7]。法醫(yī)物證學鑒定機構(gòu)和鑒定人要在實際工作中不斷積累經(jīng)驗，正確運用各種遺傳標記和計算方法以相互驗證、支持，以得到可靠的鑒定意見，提高鑒定意見準確性和鑒定工作質(zhì)量。