SIRT6在喉鱗狀細胞癌組織中的表達及其臨床意義*

張竹萍 楊景樸 趙胤 程金章 李松 趙暢 王宗貴

喉癌是當(dāng)今社會常見的惡性腫瘤之一，占頭頸腫瘤的30%～50%[1]。在我國東北地區(qū)由于吸煙、酗酒等不良生活習(xí)慣，喉癌的發(fā)病率較高。目前喉癌的主要治療手段為手術(shù)治療結(jié)合放療及化療的綜合治療。但對于中晚期喉癌療效仍不滿意，并且嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。因此，尋求更加有效的診斷和治療方法是醫(yī)療科研工作的重要研究方向。有研究[2，3]顯示,沉默信息調(diào)節(jié)因子 6（Sirtuin6,SIRT6）蛋白可能通過DNA修復(fù)、調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、控制代謝等作用機制抑制腫瘤細胞的發(fā)生與發(fā)展,是目前備受關(guān)注的潛在抗癌蛋白之一。然而關(guān)于SIRT6蛋白是否參與喉癌的臨床進展,以及SIRT6蛋白表達與喉癌各臨床參數(shù)的關(guān)聯(lián)性的研究尚未見報道。本研究采用免疫組化方法檢測喉癌中SIRT6的表達水平,并分析SIRT6蛋白表達與主要臨床參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系，為進一步研究SIRT6對喉癌的具體作用機制和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

資料與方法

1 臨床資料

收集選取2009年1月～2012年1月就診于吉林大學(xué)第二醫(yī)院并接受手術(shù)的喉癌手術(shù)標(biāo)本50例，病理證實均為喉鱗狀細胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）。手術(shù)前均未行放療、化療及腫瘤其他相關(guān)治療。其中男40例，女10例；年齡44～79歲，平均59.8歲；發(fā)生部位：聲門型32例，聲門上型18例；2002年AJCC喉癌分期Ⅰ～Ⅱ期26例，Ⅲ～Ⅳ期24例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例；病理學(xué)分級：高分化22例，中分化22例，低分化6例。另取同期行手術(shù)治療的聲帶息肉病變標(biāo)本16例作為對照。其中男9例，女7例；年齡45～60歲，平均55.8歲。

2 免疫組化法

所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，脫蠟，抗原修復(fù)等步驟，IHC采用SP法。兔抗人SIRT6多克隆抗體(ab118487，美國Abcam公司)按1∶100稀釋，二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（31460，美國invitrogen公司）按1∶2000稀釋，DAB 染色試劑盒（P0203，碧云天）按照說明書進行操作。每批實驗均設(shè)有陰性及陽性對照。

3 SIRT6表達量的評估

SIRT6根據(jù)染色強度,結(jié)果判讀參照Remmele and Stegner[4]的評分方法如下:腫瘤細胞根據(jù)視野中著色的細胞數(shù)百分比分為0～4分，根據(jù)染色深度分為0～3分。此外，計算組織化學(xué)評分（histochemistry score,H-score）是由陽性腫瘤細胞所占整個腫瘤細胞的百分比評分乘以染色強度評分計算,分值范圍為0～12。每張切片隨機選取5個高倍鏡視野，取平均值。評分0～3為低表達;評分3～12為高表達。

4 治療方法及隨訪

50例均采用以手術(shù)為主的綜合治療。患者從手術(shù)之日起開始隨訪，隨訪截止日期2017年4月。隨訪方式采用門診隨訪或電話隨訪。無進展生存率為從患者手術(shù)開始到隨訪截止無疾病進展患者占全部患者的比例。

5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS l8．0進行統(tǒng)計學(xué)分析。本研究中定量資料采用方差分析,計數(shù)資料采用卡方檢驗。生存率計算采用Kaplan-Meier法，差異用log-rank法進行檢驗。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 SIRT6在喉癌組織中的表達

免疫組化結(jié)果顯示，SIRT6蛋白主要表達于細胞胞質(zhì)中，也有部分可在胞核中表達，其特點為棕黃色顆粒。喉癌組SIRT6的相對表達量為3.33±1.148，對照組為5.37±1.043，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-6.326，P＜0.001)，見圖 1。

圖1 免疫組化法檢測SIRT6在喉癌組織與聲帶息肉組織中的表達

2 喉癌組織中SIRT6的表達與臨床特征的關(guān)系

SIRT6蛋白在不同的分化程度、臨床分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉癌組織中呈差異表達。不同分化程度的喉癌組織中SIRT6表達有統(tǒng)計學(xué)差異，SIRT6在高分化喉癌組織中表達率較高，中、低分化喉癌組織中表達率低（χ2=20.576，P＜0.001）。根據(jù)臨床分期比較，晚期喉癌SIRT6的表達率低于早期喉癌組織, 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=13.675，P＜0.05)。SIRT6表達率與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.216，P=0.642）。而在不同性別、年齡、發(fā)生部位則差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 SIRT6表達與患者的臨床病理參數(shù)相關(guān)性

3 SIRT6表達水平與喉癌患者預(yù)后的關(guān)系

到隨訪截止日，本次研究僅1例患者(SIRT6低表達患者)失訪，總隨訪率為98.00%。30例SIRT6高表達患者，無進展生存率為66.70%，19例SIRT6低表達患者，無進展生存率為42.10%，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.983，P=0.046)，見圖 2。

圖2 SIRT6的表達與喉癌患者無進展生存率的關(guān)系

討論

沉默配型信息調(diào)節(jié)蛋白（silent mating type information regulation 2 homolog,sirtuin）是一類屬于Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶的高度保守的蛋白家族[5，6]。哺乳動物中存在7種同源蛋白，即SIRT1～SIRT7。Mostoslavsky等[7]通過建立SIRT家族基因敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)只有SIRT6基因敲除的小鼠表現(xiàn)出典型的早衰癥狀，因而SIRT6在抗衰老領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注。隨后的機制研究揭示SIRT6對于維持基因組和端粒的穩(wěn)定、調(diào)控炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)糖和脂類代謝方面都發(fā)揮重要作用，從而影響機體的壽命調(diào)控[8]。由于腫瘤也具有基因組不穩(wěn)定、不可控細胞增殖和通過無氧呼吸提供能量 (Warburg效應(yīng))等共性，而SITR6參與維持基因組穩(wěn)定、調(diào)節(jié)糖代謝的調(diào)控，說明SIRT6可能不僅是個重要的壽命調(diào)控蛋白，還可能對腫瘤具有調(diào)控作用。

相關(guān)研究顯示，SIRT6基因表達的變化參與了人類多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。SIRT6作為潛在的抑癌基因，在前列腺癌，乳腺癌，非小細胞肺癌中表達下調(diào)[9-11]。Vanmeter等[12]證明SIRT6過表達可通過其單ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶活性殺傷纖維肉瘤細胞系和人宮頸癌細胞系，但對正常細胞無影響。Lin等[3]亦驗證在人結(jié)腸癌中，SIRT6蛋白表達水平顯著降低，同時降低的還有泛素特異肽10；該研究認為USP10可通過抑制SIRT6泛素化以保護其不被蛋白酶體降解；USP10通過SIRT6拮抗c-Myc的轉(zhuǎn)錄活性以抑制腫瘤生成。但是Ming等[13]認為在上皮中，SIRT6扮演癌基因的角色,發(fā)現(xiàn)紫外線暴露可增加SIRT6表達，SIRT6可通過抑制腺苷酸活化蛋白激酶途徑促進環(huán)氧化酶2（Cox-2）的表達，進而促進細胞增殖和細胞在皮膚表皮層的存活；小鼠皮膚特異性敲除SIRT6可抑制成瘤。

本實驗通過免疫組化法檢測了SIRT6蛋白在喉癌組織中的表達,結(jié)果顯示SIRT6在喉癌組織中的表達水平顯著低于聲帶息肉等正常組織，表明SIRT6在喉癌中扮演抑癌基因的角色，參與了喉癌的發(fā)生發(fā)展。進一步對SIRT6蛋白表達與臨床參數(shù)的相關(guān)性分析顯示，SIRT6的表達與喉癌的分化程度、臨床分期相關(guān)。低分化喉癌組織中陽性表達率也低，臨床分期Ⅲ/Ⅳ期的晚期喉癌組織中SIRT6的陽性表達率低于早期喉癌。推測SIRT6參與了喉癌的發(fā)生發(fā)展過程,隨著喉癌的發(fā)展，SIRT6的表達水平呈現(xiàn)出了遞減的趨勢,驗證了SIRT6表達的缺失可能促進了腫瘤的發(fā)展。但分析發(fā)現(xiàn)SIRT6的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否無統(tǒng)計學(xué)差異，表明SIRT6與喉癌的侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系不大。Lai Cc等[14]研究SIRT7在頭頸部鱗狀細胞癌中的表達情況，結(jié)果顯示，SIRT1,SIRT2，SIRT3，SIRT5，SIRT6 和 SIRT7 在頭頸部鱗狀細胞癌組織中表達水平低于癌旁正常組織，與本研究的結(jié)果一致。

基于此,本研究結(jié)果表明LSCC組織中SIRT6蛋白表達水平可能與LSCC臨床病理特征相關(guān)，SIRT6的表達與喉癌患者預(yù)后的關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，SIRT6高表達患者的無進展生存率顯著高于SIRT6低表達患者的無進展生存率，提示SIRT6的表達可能與喉癌預(yù)后有關(guān)。SIRT6有望作為一種新的潛在的腫瘤生物標(biāo)記物，拓展我們對腫瘤本質(zhì)的認識，并為相關(guān)疾病治療提供新思路。但考慮到受納入病例數(shù)量的限制，已有的研究結(jié)果僅揭示了冰山一角，許多問題尚不清楚。尚需積累大樣本高質(zhì)量研究進一步證實。