廢棄藥渣中青霉素鈉降解菌的篩選

張永芳,周玉興,張東旭，張 劍

(山西大同大學生命科學院,山西大同037009)

無論生物合成法還是生物化學合成法制成抗生素都會產(chǎn)生大量的廢棄藥渣。廢棄藥渣的主要成分是微生物菌絲體、其他營養(yǎng)物質(zhì)以及殘留的抗生素，所遺留的抗生素占抗生素藥渣的3%～5%[1]。將抗生素藥渣直接晾干后作為牲畜食物，不僅減少浪費，而且對飼養(yǎng)業(yè)的發(fā)展起到了良好的影響。由于抗生素藥渣中含有的大量的有機物質(zhì)和少量無機物，所以廢棄藥渣也被用來作為土壤肥料，并且得到了良好的效果[2-3]。但是，由于廢棄藥渣中含有少量的抗生素，將藥渣作為肥料施在土壤中，相當于直接將抗生素排入土壤中。藥渣作為牲畜飼料，也不能被動物腸道酶完全分解，通過糞便和尿液排入土地中，進而進入地表水，地下水[4-7]。大量報道指出地下水中抗生素嚴重超標[8]。所以，抗生素藥渣作為再次資源利用時，首先要去除其殘留的抗生素。目前處理殘留抗生素的主要方法是物理、化學手段，所用方法周期長、成本高、效率低。盡管有利用降解菌降解抗生素藥渣方面的研究但只是停留在實驗室中，而是否適合自然環(huán)境中廢棄藥渣的治理，尚需解決。馬玉龍等[9]人，提取出了降解泰勒菌素的菌株。劉力嘉等[10]對其降解能力進行了分析。說明土壤中的確有分解抗生素的微生物。微生物分解抗生素的方法由于快速、徹底、方便、環(huán)保。成為分解抗生素方法中的首選，也是我國制藥工業(yè)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的要求，更是發(fā)展循環(huán)經(jīng)濟，搞好末端治理建設(shè)、建成環(huán)境友好企業(yè)的重要保障。

青霉素是從青霉菌培養(yǎng)液中提制的分子中含有β-內(nèi)酰胺環(huán)的化學物質(zhì)，能抑制革蘭氏陽性細菌的細胞壁中肽聚糖的合成，故而抑制細菌細胞的指數(shù)期的生長。由于β-內(nèi)酰胺類作用于細菌的肽聚糖，而不作用于動物細胞，故青霉素類抗生素不影響動物細胞生長發(fā)育。但是在自然界中，青霉素鈉不易被分解，造成了嚴重的土壤污染和水體污染。所以，藥渣中殘留的青霉素鈉需要利用微生物進行降解。少數(shù)研究者從各種實驗材料中提取出了青霉素鈉降解菌。如岳喜慶等[11]人從自制面肥中提取到一株青霉素鈉降解菌，屬于霍氏腸桿菌。韓磊等[12]從某制藥廠污水處理站的活性污泥中篩選出2 株處理青霉素廢水高效降解菌K1 和K2，并進行單菌株與混合菌株對青霉素降解特性實驗，結(jié)果表明，混合菌株降解效果比單菌株降解效果好。目前關(guān)于長期堆放藥渣的過程中土壤中是否會產(chǎn)生青霉素降解菌的研究幾乎沒有。本實驗擬利用大同市威奇達藥廠提供的青霉素鈉廢棄藥渣為材料，經(jīng)過在土壤中長期堆放，通過篩選、馴化等手段建立降解該藥廠各種抗生素的降解菌資源庫，從中篩選出快速降解青霉素鈉，并以青霉素鈉為唯一碳源的的復合菌株，以找到用微生物方法原位治理藥渣殘留抗生素的方法與技術(shù)，為抗生素藥渣資源再利用奠定科學理論基礎(chǔ)，為其它抗生素廢棄藥渣廢水綜合治理提供技術(shù)支撐，開辟制藥企業(yè)廢棄物合理利用的新途徑。

1 實驗材料

1.1 藥渣

大同市威奇達藥廠提供的青霉素鈉廢棄藥渣。

1.2 土壤

大同大學校園內(nèi)取土。

1.3 緩沖液

pH=7.0，磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液。

1.4 培養(yǎng)基

馴化培養(yǎng)基（按周期有4種不同的馴化培養(yǎng)基）見表1。

LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，用蒸餾水定容至1 L。

1.5 儀器

Apr-80大容量離心機（廣州滬瑞明儀器有限公司），UV-1200紫外、可見分光光度計（北京尼雅科技有限公司），HPX-9272MBE 數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱（上海聯(lián)德科教儀器設(shè)備有限公司），SH2-82水浴恒溫振蕩器（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），SPX-1508-Z 生化培養(yǎng)箱（江蘇天由有限公司），SW-CJ-2F 潔凈工作臺（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），HZQ-F160 全溫震蕩培養(yǎng)箱（江蘇太倉市實驗儀器廠），LS-75LJ 立式壓力蒸汽滅菌器（江陰濱州實驗儀器廠）。

表1 馴化培養(yǎng)基的配制

2 實驗方法

2.1 藥渣堆放

取青霉素鈉藥渣置于土壤之上堆放，并且每隔1周在土壤周圍施一次50 mg/L青霉素鈉溶液保持土壤濕潤。持續(xù)堆放30 d。

2.2 取土壤浸出液

稱取土壤樣品10 g，90 mL的pH=7.0的磷酸緩沖液，在水浴恒溫振蕩器震蕩24 h，打散土壤樣品，然后過濾，取土壤浸出液。土壤浸出液中含有待篩選的青霉素鈉降解菌。

2.3 廢棄藥渣中青霉素鈉降解菌的篩選與馴化

2.3.1 接種

以10%的接種量將土壤浸出液中的菌樣接入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，即取10 mL 土壤浸出液接入90 mL培養(yǎng)基中，在37 ℃、120 r/min 的立式全溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。

2.3.2 菌種馴化

菌種馴化共有4 個周期（見表2），每個周期120 h。取10 mL篩選出的菌種移入90 mL第1周期的馴化培養(yǎng)基中，在37 ℃、120 r/min 的立式全溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)120 h。然后，取10 mL培養(yǎng)液移入90 mL第2周期的馴化培養(yǎng)基中。第3、4周期同上。馴化培養(yǎng)基逐漸增加青霉素鈉含量并相應(yīng)減少葡萄糖和蛋白胨的含量，從而篩選出能在高濃度青霉素鈉環(huán)境中生長并且以青霉素鈉為主要營養(yǎng)物質(zhì)的菌種。

表2 青霉素鈉降解菌的馴化

2.3.3 菌種篩選

配制LB固體平面培養(yǎng)基并同時加入1 000 mg/L青霉素鈉，倒平板，待凝固后，將第4 馴化周期得到的培養(yǎng)液D1和D2分別用稀釋涂平板法涂到培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。

2.3.4 菌種分離與純化

混合菌種在LB 固體平面培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h。之后，對篩選出的菌種進行平板劃線分離。直至培養(yǎng)出單個菌落。并且每隔一段時間觀察菌落的形態(tài)。

2.4 培養(yǎng)時間與青霉素鈉濃度的關(guān)系

將篩選出的青霉素鈉降解菌接種到含1 000 mg/L青霉素鈉的LB 液體培養(yǎng)基中，按照時間的推移，每隔1 d 檢測一次青霉素鈉的濃度，并繪制其降解曲線。

2.5 培養(yǎng)溫度與青霉素鈉濃度的關(guān)系

將篩選出來的青霉素鈉降解菌接種到含1 000 mg/L青霉素鈉的LB 液體培養(yǎng)基中，分別放置到27、30、34、37、40、45 ℃的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)72 h。之后測定培養(yǎng)基中青霉素鈉的濃度，以分析培養(yǎng)溫度對青霉素鈉降解菌降解能力的影響。

3 結(jié)論

3.1 劃線分離得到的菌落的形態(tài)特征

劃線分離最終得到2 種菌落。在LB 固體平面培養(yǎng)基上，第1 種菌落為直徑1 ～4 mm 的圓形菌落，表面濕潤，光滑，中間隆起，乳白色，邊緣整齊。第2種菌落為直徑1 ～2 mm的圓形菌落，表面濕潤，光滑，中間隆起，淡黃色?？梢猿醪脚卸▋煞N菌株都是細菌。將第一種菌種命名為Q1，第二種菌種命名為Q2。

3.2 菌種馴化各周期剩余青霉素鈉含量

每個馴化周期（120 h）過后檢測培養(yǎng)基中青霉素鈉的濃度。

檢測方法：通過前人研究得知青霉素鈉磷酸鹽溶液在228 nm 下有最大吸收波長。在228 nm 波長下, 以磷酸緩沖液為空白對照，分別測0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15 mg/ mL 濃度的青霉素鈉磷酸鹽溶液的吸光值，以青霉素鈉濃度為橫軸，以吸光度值為縱軸，得到回歸方程，y=43.693x+0.057 4。如圖1所示。取15 mL的培養(yǎng)基離心得到上層透亮液體。將上層透亮液體與pH=7.0的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液以1∶1 的比例混合，得到青霉素鈉磷酸鹽溶液，并且稀釋10倍，在228 nm波長下測其吸光度值，根據(jù)方程計算青霉素鈉的濃度。

圖1 青霉素鈉濃度與吸光度的關(guān)系

馴化過程中青霉素鈉降解菌的降解效果如表3所示。

表3 馴化過程中所得到的菌株對青霉素鈉的降解效果

由表3知：第1 ～3周期的培養(yǎng)基中含有葡萄糖和蛋白胨作為青霉素鈉降解菌的主要的碳源和氮源，第4周期的培養(yǎng)基中不加葡萄糖只加少量蛋白胨，并且青霉素的含量越來越高。從表中得知青霉素鈉的降解率從第1 馴化周期的45%（取2 個處理組的平均值）到第4 馴化周期增加至67%，說明青霉素鈉降解菌的降解效率隨著菌種馴化的進行不斷變高。并且，以D1組的講解效果最佳。另外，在第4周期中并未添加碳源，只添加了少量蛋白胨作為氮源，并添加了較高含量的青霉素鈉。結(jié)果可知第4周期青霉素降解量較高，說明青霉素鈉降解菌可以青霉素鈉作為唯一的碳源進行生長和繁殖。

3.3 培養(yǎng)時間對青霉素鈉濃度的影響

將篩選得到的能在較高濃度青霉素鈉下生存并且降解青霉素鈉的菌種在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，每隔24 h測定青霉素鈉濃度。見圖2。

圖2 青霉素鈉濃度與培養(yǎng)時間的關(guān)系

由圖2 實驗數(shù)據(jù)可知在37 ℃，120 r/min 的條件下培養(yǎng)，青霉素鈉的濃度隨著時間的增加逐漸降低，不同時間段內(nèi)下降速度不同，1 ～4 d 內(nèi)青霉素濃度下降快，4～6 d青霉素鈉濃度下降較快，6～8 d內(nèi)青霉素濃度下降緩慢。第8 d時青霉素降解率達到70.94%。分析原因：1 ～4 d 青霉素鈉濃度下降快，可能是因為青霉素鈉降解菌在高濃度青霉素鈉中需要一定量的青霉素鈉作為底物誘導青霉素降解酶的產(chǎn)生；4 ～6 d 青霉素濃度下降較快，可能是因為青霉素鈉降解菌產(chǎn)生的酶量增加降解的青霉素鈉含量也增加；6 ～8 d 青霉素鈉濃度下降緩慢，有可能是因為青霉素鈉降解酶含量達到最高值青霉素鈉降解量達到最大。所以，以4～6 d內(nèi)降解能力最為穩(wěn)定，易檢測；第8 d青霉素鈉降解率最高。

3.4 培養(yǎng)溫度對青霉素鈉濃度的影響

將篩選得到的菌種以10%的接種量接種到含1 000 mg/L青霉素鈉的LB培養(yǎng)基中，分組，分別放置在不同溫度的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中，72 h后分別檢測各組培養(yǎng)基中的青霉素鈉濃度，結(jié)果如圖3所示。

圖3 青霉素鈉濃度與培養(yǎng)溫度的關(guān)系

由實驗數(shù)據(jù)可知，培養(yǎng)溫度不同青霉素鈉的濃度也不相同，青霉素鈉濃度并不是隨溫度的增高而降低。培養(yǎng)溫低于37 ℃時，增高溫度，青霉素鈉的降解量隨溫度的增高而增加，37 ℃時降解量最大，之后青霉素鈉的降解量隨溫度的增加而降低。分析原因是影響降解效率的因素是青霉素鈉降解菌產(chǎn)生的青霉素降解酶催化活性受溫度的影響。酶的催化活性在低溫時受抑制。溫度過高會破壞酶分子的結(jié)構(gòu)，從而影響酶的活性。37 ℃時青霉素鈉降解菌的降解效率最高。所以，37 ℃為最有利于青霉素鈉降解菌生長的溫度。

4 討論

青霉素由青霉菌產(chǎn)生。產(chǎn)生的藥渣成分主要是青霉菌的菌絲體，也有極少部分青霉素。利用青霉素鈉作為二次利用資源時，首先要除去其中殘留的青霉素鈉。

本實驗通過長期堆放青霉素鈉藥渣，最終得到了2株降解青霉素鈉的優(yōu)良菌株。通過4個馴化周期提高了青霉素鈉降解菌的降解性能,表現(xiàn)為對青霉素的降解效率越來越高，對青霉素的耐受能力也逐漸增強。并且最終得到了可以以青霉素鈉作為唯一碳源進行生長繁殖的青霉素鈉降解菌。經(jīng)過實驗得到混合菌株的最合適培養(yǎng)溫度是37 ℃。將混合菌株在37 ℃，120 r/min的條件下培養(yǎng)4 ～6 d內(nèi)降解能力最穩(wěn)定，培養(yǎng)至8 d 時降解率可達到70.94%。

馬玉龍等[9]從土壤中提取出了泰樂菌素降解菌，該菌株以10%的接種量，在30 ～35 ℃，PH 為7 的條件下，處理泰樂菌素藥渣120 h 后，無法檢測出泰樂菌素的存在。本實驗青霉素鈉最高降解率僅達到70.94%。分析原因，可能是由于抗生素的種類不同導致的，也可能是由于實驗條件不同導致的。岳喜慶等[11]從自制面肥中提取到一株青霉素鈉降解菌株，該菌株在37 ℃培養(yǎng)9 h 后，可將含有0.01 mg/mL 的青霉素鈉的培養(yǎng)基中的青霉素鈉完全降解。本實驗中提取的青霉素鈉降解菌降解率最高達到70.94%。分析原因，可能是由于菌種提取的原料不同導致的。自制面肥中存在的微生物種類原始與土壤中存在的原始微生物種類并不相同。所以，兩個實驗提取出的菌種并不相同。本實驗從長期堆放青霉素鈉藥渣的土壤中篩選出了優(yōu)質(zhì)的青霉素鈉降解菌株，這為青霉素鈉降解菌提供了一個新的提取源，為青霉素鈉的資源化利用提供了實驗依據(jù)。