豬丁型冠狀病毒誘導的細胞線粒體凋亡

焦少勇，林翠，杜柳陽，劉俊麗，顧金燕，周繼勇

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豬丁型冠狀病毒誘導的細胞線粒體凋亡

焦少勇1，林翠2，杜柳陽1，劉俊麗1，顧金燕1，周繼勇2

1 南京農(nóng)業(yè)大學 免疫研究所，江蘇 南京 210095 2 浙江大學 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物病毒學重點實驗室，浙江 杭州 310058

豬丁型冠狀病毒 (Porcine deltacoronavirus，PDCoV) 是一種新型的豬腸道致病性冠狀病毒，可引起豬群劇烈腹瀉及嘔吐，但致病機制尚不清楚。本研究檢測了PDCoV感染誘導的細胞凋亡。Caspase酶活性檢測顯示，在PDCoV感染的細胞中，caspase 3、caspase 8和caspase 9的活性隨病毒感染量的增多而顯著提高，類似的現(xiàn)象未能在紫外滅活病毒感染的細胞中觀察到，表明PDCoV感染可同時激活內(nèi)源性與外源性細胞凋亡通路，并暗示細胞凋亡的誘導依賴于病毒復制。為深入探究PDCoV誘導的內(nèi)源性細胞凋亡，分別檢測胞漿和線粒體中細胞色素C與凋亡誘導因子。結(jié)果顯示，與正常細胞相比，PDCoV感染細胞從線粒體釋放到胞漿的細胞色素C顯著增多，且其釋放量隨著感染時間的延長而增多，而凋亡誘導因子始終定位于線粒體，提示PDCoV感染通過促使線粒體膜間隙的細胞色素C進入胞漿而啟動caspase依賴的線粒體凋亡通路。本研究初步揭示了PDCoV誘導細胞凋亡的機制。

豬丁型冠狀病毒，線粒體凋亡，細胞色素C

豬丁型冠狀病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV) 是近年來發(fā)現(xiàn)的新型冠狀病毒，屬于套氏病毒目冠狀病毒科丁型冠狀病毒屬，是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組全長約為25.4 kb[1]。PDCoV于2012年首次在中國香港被報道[2]，并于2014年初在美國的腹瀉豬群中首次被檢測到[3]，現(xiàn)已在美國、加拿大及亞洲多個國家流行[4-6]。PDCoV可感染各年齡段豬群，主要引起仔豬水樣腹瀉、嘔吐及脫水[7]。組織病理學研究發(fā)現(xiàn)，PDCoV可感染豬小腸絨毛上皮細胞，引起細胞空泡化、絨毛萎縮及細胞壞死脫落[8]。在體外，PDCoV可感染豬腎細胞(LLC porcine kidney，LLC-PK) 和豬睪丸細胞(Swine testicular，ST)，并使感染細胞產(chǎn)生明顯病變[9]，這些都提示PDCoV感染與細胞凋亡密切相關。

細胞凋亡是在生理或病理條件下，細胞受內(nèi)外信號刺激后發(fā)生的受基因調(diào)控的自殺行為，又被稱為“程序性細胞死亡”。在抵抗微生物感染、維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中也起著至關重要的作用[10-11]。病毒感染過程與細胞凋亡發(fā)生密切相關，一方面細胞通過凋亡過程可以清除病毒，抵抗病毒感染；另一方面病毒在與宿主細胞博弈過程中會進化出一些拮抗或劫持策略，以利于病毒的復制與傳播。目前已發(fā)現(xiàn)許多病毒在感染后期可誘導細胞凋亡，豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV) 被證實其感染晚期可通過激活線粒體凋亡誘導因子(Apoptosis-inducing factor，AIF)誘導不依賴caspase的細胞凋亡[12]，從而利于病毒擴散。近期有研究表明，PDCoV感染也能激活線粒體凋亡通路[13]，但對于PDCoV誘導凋亡的具體機制仍需深入探究。本研究通過檢測PDCoV感染細胞中各項內(nèi)外源凋亡指標，確定了病毒激活凋亡的具體途徑，為深入探究PDCoV調(diào)節(jié)細胞凋亡的機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞和病毒

ST細胞和PDCoV-CH-HA3-2017 (MK040455)毒株由本實驗室保存。ST細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，0.05%胰酶消化后按1︰3比例傳代。PDCoV病毒擴繁后使用Optiprep密度梯度離心法進行純化。病毒滅活系采用紫外線(Ultraviolet，UV) 照射1 h，用間接免疫熒光試驗(Immunofluorescence assay，IFA) 來檢測PDCoV的滅活效果。本實驗中病毒感染復數(shù)均為MOI=1。

1.2 生物材料和主要試劑

DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司；TPCK胰蛋白酶購自Invitrogen公司；Optiprep密度梯度介質(zhì)購自Sigma-Aldrich公司；BCA蛋白定量試劑盒購自GenStar公司；細胞線粒體分離試劑盒和RIPA細胞裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司；線粒體熒光染料JC-1購自杭州聯(lián)科生物技術有限公司；caspase 8檢測試劑盒購自Clontech Laboratories公司；caspase 3、caspase 9及AIF的抗體均購自Cell Signaling Technology公司；細胞色素C、線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶20 (Tomm 20)的抗體購自Abcam公司；兔抗β-actin抗體購自杭州華安生物技術有限公司；HRP標記羊抗兔IgG和HRP標記羊抗鼠IgG購自KPL公司；PDCoV N蛋白的鼠多抗和PDCoV S蛋白的兔多抗由本實驗室制備并保存。

1.3 病毒蛋白多抗的制備

PCR擴增PDCoV-CH-HA3-2017毒株的N基因，構(gòu)建pET-28A-N原核表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細胞，挑斑活化重組表達菌，以1︰100接種含卡那抗性的液體培養(yǎng)基，待培養(yǎng)至值約為0.4–0.6時，加入1 mmol/L IPTG誘導劑，16 ℃、80 r/min振蕩培養(yǎng)14 h，誘導表達N蛋白。收集菌體，經(jīng)超聲破碎后取上清液，使用Ni-NTA親和純化柱進行融合蛋白的純化。取蛋白與佐劑等比例混合充分乳化后免疫小鼠3次，最后取小鼠血清即為PDCoV N蛋白鼠多抗，進行ELISA、IFA、SDS-WB方法檢測抗體的反應性，并用于后續(xù)試驗。

PDCoV S蛋白兔多抗制備過程與PDCoV N蛋白鼠多抗制備過程類似。截取PDCoV S1中段第766–1173位堿基編碼的親水區(qū)域命名為S1ep，將合成的S1ep基因序列插入pET-28A載體，構(gòu)建pET-28A-S1ep重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細胞后，以0.5 mmol/L IPTG為誘導劑，16 ℃、100 r/min誘導過夜，Ni-NTA純化S1ep融合蛋白，與佐劑混合乳化后免疫新西蘭大白兔3次，最后心臟取血并收集血清得到后續(xù)試驗所用的PDCoV S蛋白兔多抗。

1.4 Optiprep不連續(xù)密度梯度離心純化病毒

將收集的病毒液于4 ℃、4 800 r/min離心25 min，上清經(jīng)0.4 μm濾器過濾后轉(zhuǎn)移至高速離心管中，平衡后于4 ℃、15 700 r/min離心2 h，棄上清。取0.5 mL DMEM吹懸病毒沉淀并于4 ℃溶解過夜。分別取900 μL 40%、30%、20%和10% (/) 碘克沙醇(Iodixanol) 梯度介質(zhì)依次緩慢注入超速離心管中配制密度梯度，將已溶解的病毒液緩慢加于密度梯度溶液上層，平衡后于4 ℃、20 300 r/min離心3 h，分別取病毒可能所在條帶并轉(zhuǎn)移至高速離心管中，平衡后于4 ℃、15 700 r/min離心2 h，所得沉淀即為純化后的病毒粒子。用適量DMEM溶解沉淀，分裝凍存于–80 ℃。取一部分純化的病毒樣品通過SDS-PAGE、免疫印跡、電鏡觀察以及毒價測定確定病毒純化成功。

1.5 蛋白樣品制備及免疫印跡

收集細胞樣品，加入細胞裂解液，使用BCA試劑盒進行蛋白質(zhì)定量。取等量的蛋白樣品進行SDS-PAGE，半干轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，膜經(jīng)封閉、一抗和二抗等處理后，使用ECL顯色液顯色。本研究中使用的一抗分別為：抗細胞色素C鼠單抗(1︰1 000)、Tomm 20兔單抗(1︰1 000)，AIF兔單抗(1︰1 000)、caspase 3兔單抗(1︰4 000)、caspase 9鼠單抗(1︰200)、β-actin兔單抗(1︰1 000)、PDCoV S兔多抗(1︰500) 和PDCoV N鼠多抗(1︰500)，對應的二抗為HRP標記的羊抗鼠二抗(1︰8 000) 和HRP標記的羊抗兔二抗(1︰8 000)。

1.6 Caspase 8活性檢測

2 000 r/min離心5 min收集細胞樣品，加入50 μL預冷的細胞裂解緩沖液重懸細胞沉淀，冰上孵育10 min后，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清加入50 μL 2×反應緩沖液/DDT混合液，冰上孵育30 min；隨后加入5 μL 1 mmol/L的caspase 8底物(IETD-pNA)，37 ℃水浴1 h；最后，使用酶標儀測定405 nm波長下的吸光值。再根據(jù)標準曲線計算pNA量。

1.7 胞漿和線粒體組分分離

1 500 r/min室溫離心5 min收集細胞，用預冷PBS重懸細胞。4 ℃、2 500 r/min離心5 min，向沉淀中加入1 mL線粒體分離試劑，重懸細胞后于冰浴放置15 min。隨后，將細胞懸液勻漿后于4 ℃、2 500 r/min離心10 min。上清于4 ℃、10 800 r/min離心10 min。此時，收集所得沉淀加入150 μL線粒體裂解液得到樣品即為線粒體組分，而上清液再經(jīng)11 300 r/min離心10 min所得上清即為胞漿組分。

1.8 線粒體膜電位檢測

待96孔板細胞密度達到70%時接種PDCoV，分別在接毒后16 h、24 h和32 h檢測。將JC-1試劑與DMEM按1︰10稀釋混勻，避光放置培養(yǎng)箱中溫浴至37 ℃后，向樣品孔中分別加入10 μL JC-1混合液，混勻后避光置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育20 min。樣品經(jīng)DMEM培養(yǎng)基洗滌兩次后置于OLYMPUS DP72倒置熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 PDCoV激活凋亡依賴于病毒復制

本研究使用Optiprep不連續(xù)密度梯度離心對擴繁所得PDCoV病毒進行純化。純化后的病毒粒子存在于Optiprep介質(zhì)的20%與30%梯度之間，透射電鏡觀察可見直徑100 nm左右、形態(tài)規(guī)則、外有囊膜、表層有日冕狀纖突的病毒粒子(圖1A)。經(jīng)紫外線滅活的純化PDCoV (UV-PDCoV)與未滅活PDCoV分別感染ST細胞，檢測凋亡指示蛋白caspase 3的剪切體水平，十字孢堿(Staurosporine，STS) 處理作為凋亡陽性對照。結(jié)果如圖1B和1C所示，UV-PDCoV感染的細胞幾乎檢測不到病毒S蛋白和caspase剪切體(Cleaved-caspase，Cl-caspase)，而活病毒感染后可檢測到大量的S蛋白和Cl-caspase 3，說明只有活PDCoV可以使caspase 3發(fā)生剪切，表明ST細胞凋亡的激活依賴于PDCoV的復制。

2.2 PDCoV感染激活細胞內(nèi)源性與外源性凋亡通路

為了進一步驗證PDCoV激活細胞凋亡的途徑，我們收集了感染PDCoV不同時間點的細胞樣品，并檢測凋亡相關Cl-caspase及caspase酶活性。與未感染組比較，感染細胞內(nèi)Cl-caspase 3和Cl-caspase 9條帶均顯著增多，并與感染病毒量呈正相關(圖2A、2B和2C)。病毒感染后24 h，Cl-caspase 9水平最高(圖2A和2C)；感染后32 h，Cl-caspase 3水平最高(圖2A和2B)。Caspase 8活性檢測結(jié)果顯示，病毒感染后24 h，caspase 8酶活性顯著增強；感染后32 h，酶活性逐漸回落至正常水平(圖2D)，表明PDCoV激活了感染細胞中內(nèi)外源性凋亡信號通路。

圖1 PDCoV活化感染細胞的caspase 3

圖2 PDCoV激活感染細胞內(nèi)caspase 9

2.3 PDCoV感染誘導細胞色素C釋放胞漿

依據(jù)上述實驗結(jié)果，我們使用細胞線粒體分離試劑盒分離PDCoV感染與未感染細胞的胞漿和線粒體組分，免疫印跡分析細胞色素C和AIF變化。結(jié)果如圖3所示，PDCoV感染細胞后，感染時間越長，細胞漿中細胞色素C的水平越高；而AIF則變化不顯著，依然定位在線粒體內(nèi)，表明PDCoV感染后可引起線粒體膜通透性增強，導致線粒體膜間隙內(nèi)可溶性蛋白細胞色素C釋放胞漿，從而激活下游caspase依賴的線粒體凋亡通路。此外，我們還觀察到，線粒體和胞漿組分中均能檢測到PDCoV的N蛋白，而S蛋白則僅存在于線粒體組分中(圖3A)。

2.4 PDCoV感染不改變線粒體膜電位

線粒體膜通透性增強是內(nèi)源性凋亡起始的關鍵[14]。目前研究表明，線粒體外膜通透性增強和線粒體內(nèi)膜通透性增強均能激活線粒體凋亡通路，引起細胞凋亡[15-17]。通過JC-1染料檢測線粒體膜電位，在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物，濃度較高，產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低，即線粒體內(nèi)外膜通透性增強時，JC-1染料逸出線粒體進入胞漿中，濃度較低，成單體形式存在，產(chǎn)生綠色熒光。結(jié)果如圖4所示，PDCoV感染細胞與未感染細胞的紅色熒光強度并無明顯差異；病毒感染時間對綠色熒光強度也無影響，表明PDCoV感染后線粒體膜電位沒有發(fā)生改變。

圖3 PDCoV對感染細胞中細胞色素C及AIF分布的影響

圖4 PDCoV感染細胞的線粒體膜電位變化

3 討論

病毒感染細胞的過程是病毒與宿主之間的一場博弈過程。宿主細胞在該過程中可產(chǎn)生凋亡或自噬等一系列免疫調(diào)節(jié)機制以保護細胞免受侵害，而病毒則會劫持利用細胞凋亡或自噬機制或進化出免疫逃避的策略以利于病毒自身復制[18]。冠狀病毒是一類對人和動物有嚴重危害的病原，近些年重癥急性呼吸綜合征(Severe acute respiratory syndrome，SARS) 和中東呼吸綜合征的暴發(fā)引起了人們對于冠狀病毒的廣泛關注[19-21]。同樣，PEDV和PDCoV等冠狀病毒給畜禽養(yǎng)殖業(yè)也造成了嚴重的經(jīng)濟損失。近年來，已有研究發(fā)現(xiàn)冠狀病毒的致病機制與細胞凋亡密切相關。SARS通過誘導凋亡引起擴散性肺組織細胞損傷，從而使肺部組織中出現(xiàn)大量泡沫狀巨噬細胞和多核合胞體[22-24]；豬傳染性胃腸炎病毒感染引起細胞氧化應激反應，可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能性損傷誘導caspase依賴的細胞凋亡[25]；PEDV通過誘導AIF移位到胞核引起細胞凋亡[12]，亦有研究報道，PEDV木瓜蛋白酶可通過激活caspase 3誘導細胞凋亡[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，PDCoV病毒感染不僅激活外源性凋亡(圖2D)，還激活內(nèi)源性凋亡通路(圖2A-C)，并通過增強線粒體外膜通透性(圖4)，促進線粒體膜間隙中的可溶性蛋白細胞色素C釋放入胞漿(圖3)，在胞漿中激活起始caspase 9 (圖2A，2C)，隨后激活效應caspase 3 (圖2A、2B)，最終引發(fā)凋亡。

病毒感染細胞的整個過程都可能誘導凋亡發(fā)生。病毒黏附、入胞及其遺傳物質(zhì)釋放過程都可調(diào)節(jié)細胞凋亡。然而，這些也僅僅是其誘導凋亡的一小部分，大部分凋亡的調(diào)節(jié)依賴于病毒復制后翻譯出的病毒蛋白。例如，豬圓環(huán)病毒2型ORF4蛋白通過結(jié)合線粒體ANT3蛋白促進線粒體膜通透性增強誘導線粒體凋亡[27]；人類免疫缺陷病毒1型的胞膜糖蛋白復合物(gp140和gp41)通過P53依賴反式作用于puma和bax，從而激活線粒體凋亡[28-29]；丙型肝炎病毒的NS3蛋白，可結(jié)合caspase 8并增強caspase 8活性從而誘導細胞凋亡[30-31]。之前有研究顯示，PDCoV激活caspase依賴的內(nèi)源性凋亡由bax的線粒體募集引起[13]。bax是Bcl-2家族蛋白中最重要的凋亡效應蛋白，在凋亡信號刺激下，bax蛋白聚集在線粒體形成多聚體穿孔復合物，在線粒體外膜打開孔道，釋放膜間隙可溶性蛋白，從而誘發(fā)凋亡[32]。PDCoV誘導凋亡機制已有初步研究報道[8, 13]，本研究通過caspase試劑盒檢測caspase 8活性，發(fā)現(xiàn)PDCoV可以通過外源性凋亡通路誘導ST細胞凋亡，這與報道通過使用caspase 8抑制劑獲得的結(jié)論有所不同。caspase信號通路中存在復雜的反饋調(diào)節(jié)機制，外源性凋亡通路中的重要凋亡相關蛋白caspase 8涉及細胞增殖分化等多種生物學功能。我們目前先探索了內(nèi)源性凋亡通路，選擇檢測細胞色素C和AIF的胞漿線粒體分布以及通過JC-1染料檢測線粒體膜電位等方法從不同層面探討PDCoV誘導ST細胞凋亡的機制，具體外源性凋亡通路有待進一步探討。線粒體膜電位與線粒體內(nèi)膜通透性相關，線粒體膜通透性增強是內(nèi)源性凋亡起始的關鍵。本研究使用JC-1染料檢測線粒體膜電位，詳細分析了線粒體膜通透性在凋亡過程中的具體變化，證實PDCoV感染通過引起線粒體外膜通透性增強，使細胞色素C釋放進入胞漿引起凋亡。有研究表明，冠狀病毒在入侵宿主細胞時，通過S蛋白介導以膜融合方式將病毒基因釋放入胞[33]。宿主細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成新的S蛋白，通過與其他病毒蛋白組裝成為完整病毒粒子釋放出胞，完成病毒復制過程。關于S蛋白的亞細胞定位與具體功能，目前研究還不是很透徹。在本研究中，我們首次證實PDCoV S蛋白定位于線粒體(圖3A)，這與我們對S蛋白的已有認知有所不同[33-34]，推測PDCoV激活ST細胞線粒體凋亡與S蛋白合成相關，這可能是PDCoV凋亡誘導研究的一個重要線索，有待進一步證實。

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Porcine deltacoronavirus induces mitochondrial apoptosis in ST cells

Shaoyong Jiao1, Cui Lin2, Liuyang Du1, Junli Liu1, Jinyan Gu1, and Jiyong Zhou2

1Institute of Immunology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu, China 2 Key Laboratory of Animal Virology of Ministry of Agriculture, Zhejiang University, Hangzhou 310058, Zhejiang, China

Porcine deltacoronavirus (PDCoV) is a newly emerging enteropathogenic swine coronavirus causing acute diarrhea and vomiting in pigs. The apoptosis of ST cells induced by PDCoV infection was studied in this research. In ST cells, caspase activity assay showed that the activity of caspase 3, caspase 8 and caspase 9 increased significantly with the infection of PDCoV, but not observed in UV irradiated PDCoV-infected cells, indicating that PDCoV infection activated both endogenous and exogenous apoptotic pathways in ST cells, and the induction of apoptosis depended on viral replication. To further investigate the endogenous apoptosis induced by PDCoV, cytochrome C and apoptosis-inducing factors in cytoplasm and mitochondria were detected. Compared with normal cells, the amount of cytochrome C released from mitochondria to cytoplasm increased significantly in PDCoV-infected cells, and the release increased with the prolongation of infection, while the apoptosis-inducing factor was always localized to mitochondria, suggesting that PDCoV induced apoptosis was initiated through caspase-dependent mitochondrial apoptosis pathway by promoting cytochrome C in the mitochondrial membrane gap into the cytosol. In conclusion, this study reveals the mechanism of PDCoV inducing apoptosis.

porcine deltacoronavirus, mitochondrial apoptosis, cytochrome C

December 10, 2018;

April 15, 2019

National Key Research and Development Program of China (No. 2016YFD0500102), the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.

Jinyan Gu. Tel: +86-25-84396068-8041; E-mail: gjy@njau.edu.cn

國家重點研發(fā)計劃(No. 2016YFD0500102)，江蘇高校優(yōu)勢學科建設項目資助。

2019-04-28

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190426.1620.001.html

10.13345/j.cjb.180512

焦少勇, 林翠, 杜柳陽, 等. 豬丁型冠狀病毒誘導的細胞線粒體凋亡. 生物工程學報, 2019, 35(6): 1050–1058.

Jiao SY, Lin C, Du LY, et al. Porcine deltacoronavirus induces mitochondrial apoptosis in ST cells. Chin J Biotech, 2019, 35(6): 1050–1058.

(本文責編 郝麗芳)