細菌小細胞在癌癥治療中的應用

楊玉瑩，劉青，李沛，羅洪艷，王豪舉，孔慶科

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細菌小細胞在癌癥治療中的應用

楊玉瑩，劉青，李沛，羅洪艷，王豪舉，孔慶科

西南大學 動物科技學院，重慶 400715

癌癥一直是危害人類健康的主要疾病之一。傳統(tǒng)的癌癥治療方法包括放療、化療和手術，均具有明顯的毒副作用或局限性。脂質體和納米顆粒作為被廣泛研究的藥物遞送載體，在人體臨床試驗中也出現(xiàn)了藥物滲漏和裝載功能不全等問題。目前而言，應用具有腫瘤靶向性的載體遞送抗腫瘤藥物或小分子，是有希望介導安全、有效的腫瘤治療的策略之一。近年來，細菌來源的非復制型小細胞已受到越來越多的關注。小細胞是細菌異常分裂時期產(chǎn)生的納米級無核細胞，其直徑為200–400 nm，因而具有較大的藥物裝載能力。對小細胞的表面進行修飾，例如，裝配能與腫瘤細胞表面特異性抗原或受體結合的抗體/配體，可顯著提高小細胞的腫瘤靶向性。這種具有靶向性的納米材料能將抗腫瘤的化療藥物、功能性核酸或編碼功能性小分子的質粒靶向遞送至腫瘤，而減少藥物在正常組織器官的集聚。因此，使用小細胞作為靶向遞送載體有助于降低藥物對機體的毒性，從而最大限度地發(fā)揮藥物分子在體內(nèi)的抗腫瘤活性。文中將對小細胞的產(chǎn)生與純化、藥物裝載、腫瘤細胞靶向性、內(nèi)化過程以及其用于遞送抗腫瘤藥物的研究進展等方面進行綜述，為開發(fā)基于小細胞的癌癥治療策略提供一定的參考。

小細胞，癌癥治療，納米顆粒

無論是發(fā)達國家還是發(fā)展中國家，癌癥的有效治療都是世紀性難題。全球平均每分鐘有18人因癌癥去世；在中國，每年惡性腫瘤新發(fā)病例數(shù)約為380.4萬例[1]。目前，常規(guī)的癌癥治療方式包括化療、放療和手術等，但它們均具有明顯的局限性。例如，化療需要使用高濃度的藥物或抗體才會產(chǎn)生一定療效，但大多數(shù)化療藥物不能特異性地靶向腫瘤細胞，從而導致化療常常伴隨著對機體正常組織的顯著毒性，產(chǎn)生脫發(fā)、惡心嘔吐和肝腎功能損害等副作用[2]。此前有研究應用脂質體和納米顆粒來遞送抗腫瘤藥物，但臨床試驗結果顯示了藥物滲漏等問題[3]。因此，篩選新型的具有腫瘤靶向性的藥物載體迫在眉睫。

小細胞 (Minicells) 是由細菌異常分裂時期產(chǎn)生的直徑約為200–400 nm的納米級無核細胞[4]。目前已成功從大腸桿菌[5-7]、鼠傷寒沙門氏菌[8-9]、志賀氏菌spp.[10]、谷氨酸棒狀桿菌[11]及乳酸菌[12]等細菌中分離得到小細胞。小細胞包含除了染色體DNA外的其他親本細胞所有成分，比如質粒、核糖體、轉移核糖核酸和各種酶類等[13]。將某些特異性的抗體或配體結合到小細胞表面可以使小細胞具有腫瘤靶向性，具有腫瘤靶向性的小細胞則可以用于遞送抗腫瘤藥物，發(fā)揮高效的腫瘤治療作用[5-6,14]。

細菌小細胞作為藥物載體主要有以下幾點優(yōu)勢。1) 小細胞能夠運載化療藥物、功能性核酸分子(siRNAs、miRNA或核酶分子等)、外源蛋白質以及質粒DNA等，并且可以組合遞送這些抗腫瘤藥物以提高治療效果。例如同時遞送DNA疫苗和相應的蛋白，也可以同時遞送兩種或多種小分子藥物，增加了藥物運載的靈活性[7]。2) 小細胞繼承了親本細胞的胞質組成，其細胞膜是由疏水性磷脂雙分子層形成的非滲透性膜，富含心磷脂，維持了胞內(nèi)蛋白質和離子濃度的穩(wěn)定，在治療中能增強藥物的滲透性[15-16]。3) 通過對小細胞表面的改造可以使其靶向特定細胞，從而降低對正常組織造成的毒副作用。另外，腫瘤微環(huán)境內(nèi)對大分子藥物或顆粒的高通透性和滯留效應 (Enhanced permeability and retention effect，EPR效應) 可以使小細胞很容易穿過毛細血管，在腫瘤組織中聚集并長時間滯留[3,17]。4) 小細胞不能生長、分裂，沒有傳染性。因此，相比活菌載體，小細胞具有明顯的安全性[7]。小細胞作為一種新型的抗癌材料，已受到越來越多的關注。文中將對小細胞的生產(chǎn)純化、藥物裝載、靶向機制、內(nèi)化過程及小細胞遞送抗腫瘤藥物介導腫瘤治療等方面的研究進展進行綜述。

1 小細胞的產(chǎn)生與純化

1.1 Min系統(tǒng)對小細胞形成的調(diào)控

細菌小細胞是通過控制細菌分裂基因、抑制細胞分裂的極性位點而產(chǎn)生的無核納米顆粒。目前已經(jīng)鑒定的細菌細胞分裂蛋白主要有20多種，包括FtsZ、FtsA、FtsE、FtsX、FtsK、FtsQ、FtsL、FtsB、FtsW和ZipA等[18-19]，它們可以在分裂位點組裝成蛋白復合物。這種復合物是通過將微管蛋白同源物FtsZ裝配成環(huán)狀結構來起始的，隨后在細胞生長過程中形成細胞動力環(huán) (Z環(huán))。Z環(huán)能收縮成螺旋狀或隔膜狀，介導細胞包膜層 (例如內(nèi)膜、肽聚糖層和外膜) 內(nèi)陷，從而產(chǎn)生分 裂[20]。此外，Lange等[21]發(fā)現(xiàn)一種名為PomZ的新蛋白質，它可以通過將FtsZ募集到細胞中部來正向調(diào)節(jié)Z環(huán)的組裝；缺乏PomZ會導致分裂缺陷形成無染色體的小細胞和絲狀細胞。

調(diào)節(jié)細胞分裂的系統(tǒng)包括類核閉塞系統(tǒng)和Min系統(tǒng) (圖1)。類核閉塞系統(tǒng)決定細胞分裂的潛在位點，防止分裂發(fā)生在類核 (沒有核膜包被的細胞核)，引導Z環(huán)組裝；而Min系統(tǒng)則用于調(diào)節(jié)Z環(huán)的適當位置和拮抗FtsZ的組裝[22]。大腸桿菌的Min系統(tǒng)是目前研究比較清楚的，其基因簇主要編碼MinC、MinD和MinE等蛋白。MinC有兩個大小一致的結構域，由MinD蛋白激活，二者共同作用作為隔膜抑制劑。通過MinC的N端與FtsZ連接，影響FtsZ聚合物的橫向相互作用力，從而阻斷對FtsZ的組裝，防止細胞在極性端形成Z環(huán)[3]。因此，和基因突變均可消除細胞分裂期間在細胞極中形成隔膜環(huán)的抑制，產(chǎn)生正常的子細胞和無核的小細胞。MinE有兩個功能域，誘導MinC在細胞極兩端擺動，特異性地在非極性位點降低MinC的抑制作用，促進小細胞的產(chǎn)生。在生理濃度下，MinE可阻止MinCD (MinC和MinD復合物) 抑制劑作用于新的分裂位點，但不會阻止抑制劑與細胞極上的舊位點相互作用[23-25]。其他類型的菌株中可能存在的同源基因。枯草芽孢桿菌中的Min系統(tǒng)包括MinC、MinD和DivIVA，DivIVA目前被認為是大腸桿菌中的MinE的對應基因[24,26]。Suey等[24]還在枯草芽孢桿菌的Min系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)一個新組件MinJ，它是DivIVA和MinCD之間的橋梁。借助DivIVA的極性，MinC、MinD和MinJ的復合物 (MinCDJ) 可以靶向定位于細胞極，隨后促進Z環(huán)的分解從而防止小細胞形成。有研究者嘗試敲除大腸桿菌中的基因和過表達基因，發(fā)現(xiàn)可誘導細菌的不對稱分裂，并產(chǎn)生大量小細胞[23,27]。過表達FtsZ也可以誘導小細胞的大量生成[28]。

圖1 Min系統(tǒng)對小細胞形成的調(diào)控[3,19]

此外，一些多糖類物質也能影響細菌基因的表達。例如，透明質酸能引起細菌細胞分裂分化，其程度取決于透明質酸的濃度，所以在分裂過程中該物質能促進小細胞的形成[3]。

1.2 小細胞的純化

為了得到無菌小細胞，去除親代細菌、細胞碎片、膜泡、核酸和內(nèi)毒素等，需要進行一系列的純化過程。傳統(tǒng)的差速離心、密度梯度離心及過濾等方法均無法完全去除較小的親本細菌，目前常用的細菌小細胞純化方法主要包括抗生素純化法[4]、自溶素偶聯(lián)離心法[29]、UV輻射和可調(diào)型基因自殺機制 (MSM)[13]等。

抗生素純化法是將抗生素裂解和滲濾法相結合。青霉素、頭孢曲松、萘啶酸和安普霉素等抗生素可以通過抑制DNA和核糖核蛋白的合成來發(fā)揮其對細菌的細胞毒作用，而小細胞的膜完整性和組分不會受到抗生素的影響，但最近研究顯示大腸桿菌突變體產(chǎn)生的小細胞能夠幫助大腸桿菌細胞修復抗生素導致的蛋白質損傷，提高對抗生素的抵抗[30]。自溶素偶聯(lián)離心法思路來源于噬菌體，噬菌體可以通過穴蛋白/溶素蛋白 (Holin/lysin) 裂解宿主細胞。將噬菌體的裂解基因holin/lysin導入細菌后，表達的溶素蛋白可以殺死親本細菌而不影響小細胞；隨后結合常規(guī)的離心方法就可以從細菌培養(yǎng)物中分離出高純度的小細胞。該方法能將親本細菌污染率從初始小細胞溶液中的0.001%降低到0.000 002 5%，但大量游離內(nèi)毒素仍可能包含在里面[27]。UV輻射可以殺死活的親代細菌，但是具有隨機性。此外，可調(diào)型基因自殺機制引入可調(diào)型基因I-I等核酸內(nèi)切酶，通過溫度調(diào)控可誘導親代細胞染色體雙鍵斷裂，形成不可逆的絲狀表型，從而輔助親代細胞與小細胞的分離[13]。有研究將基因自殺機制與FtsZ超表達相結合，獲得了大量親本細菌污染率極低的小細胞。Rang等[31]為了高效純化小細胞，將細菌細胞分裂在高鹽等應激條件下進行，發(fā)現(xiàn)能促進親本細菌轉化為不同長度的細絲，通過離心即可與小細胞分離而除去。

2 小細胞作為藥物遞送載體

2.1 藥物的包裝

小細胞具有遠高于其他納米載體的藥物容納能力。對小細胞藥物包裝的定量研究表明，每個小細胞可以包裝106–107個藥物分子，50個質?；?2 000個小分子干擾RNA (Small interferencing RNA，siRNA)[9,14]。而每個脂質體顆粒僅僅能容納104個藥物分子[32]。而且，由于小細胞磷脂雙層膜的擴散基本上是單向的，所以即使將裝載好藥物的小細胞在明膠磷酸鹽緩沖液或血清中孵育數(shù)小時，或長時間在大量緩沖液沖洗下也沒有發(fā)現(xiàn)藥物泄漏。

利用藥物濃度梯度差是使藥物滲透到小細胞的便利途徑。在這種藥物裝載途徑下，包裝于小細胞內(nèi)的藥物濃度依賴于小細胞所處溶液中藥物的濃度以及孵育時間[6]。在含有小細胞的細胞外介質和小細胞細胞質之間建立藥物濃度梯度 (使細菌小細胞的胞外藥物濃度高于胞內(nèi))，藥物可以通過外膜的非特異性孔蛋白通道滲透到小細胞中[33]。例如，大腸桿菌的外膜通道孔蛋白OmpF和OmpC，可以允許高達600 Da大小的離子和代謝物通過而沒有任何排斥性[34]?？椎鞍淄ǖ赖臐B透效率會受到一些因素的影響。首先，各種生理學相關離子鹽的濃度和種類可以改變孔蛋白OmpC的滲透性，因為離子可以與親和位點中涉及的底物和殘基強烈作用[35]。其次，跨膜電位也可能與擴散過程有關?？椎鞍淄ǖ乐械膸щ姎埩粑锂a(chǎn)生了分離極性和非極性的橫向電場，極性溶質通過滲透過程快速發(fā)生，非極性溶質可通過非特異性運動從細胞外膜蛋白的其他通道進入，例如外膜蛋白的FadL家族[36]和OmpW[37]。此外，還需要考慮外膜主要脂質成分脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)，它的存在會影響細胞膜上的動力學，脂多糖相關的阻滲、有機溶劑耐受性、疏水性、抗生素耐受性、膜通透性等功能與小細胞藥物裝載量和滲透速率有關。

用小細胞裝載藥物的另一種方法是，構建可以表達治療性藥物的重組菌株，重組菌株經(jīng)培養(yǎng)后可以將藥物釋放到細菌的細胞質中；當親本細菌分裂并形成子代小細胞時，小細胞的細胞質中也含有相應的藥物[13]。

2.2 靶向癌細胞

相對于正常組織，小細胞更容易在腫瘤環(huán)境中聚集。正常組織中的微血管內(nèi)皮間隙致密、結構完整，大分子顆粒不易透過血管壁；而實體瘤組織中血管豐富、血管壁間隙較寬、結構完整性差，淋巴回流缺失，可導致粒徑在200–1 000 nm之間的大分子藥物滲入腫瘤組織，蓄積并長時間滯留，實現(xiàn)小細胞在體內(nèi)的被動靶向[17,38-39]。與其他遞送系統(tǒng)一樣，小細胞的主動靶向是通過將靶向配體或雙特異性抗體 (Bispecific antibody，BsAb) 附著在小細胞表面，可以提高裝載有抗腫瘤藥物小細胞對腫瘤細胞的特異靶向性 (圖2)[5]。此外，鼠傷寒沙門氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng) (T3SS) 也被應用于小細胞的特異性靶向。

BsAb的一個臂對小細胞表面的脂多糖或O-抗原等成分具有特異性，另一個臂對腫瘤細胞表面受體如EGFR[33]、HER2/[40-41](也稱為ERBB2)、CD33或CD3[42]等具有靶向性。因此，BsAb既可以附著在小細胞表面，又可以在進入腫瘤微環(huán)境后特異性結合到腫瘤細胞表面高表達的受體上，從而將小細胞與腫瘤細胞特異性地連接起來。但由于雙特異性抗體成本高，且其靶向受體的多態(tài)性和基因突變可能會影響其與抗體的結合以及隨后的內(nèi)化，所以將其用于靶向遞送小細胞運載的藥物，過程復雜而且價格更昂貴。

根據(jù)腫瘤細胞的生長環(huán)境和表面特性，在小細胞表面載入合適的配體也是一種優(yōu)良的選擇。這種雙特異性配體可以是多肽、碳水化合物或糖肽等[43]。葉酸 (Folic acid) 價格便宜，容易與細胞膜表面物質偶聯(lián)，其羧基在偶聯(lián)劑作用下可以與細菌小細胞表面存在的游離胺形成酰胺鍵。有研究證實葉酸受體在大多數(shù)惡性腫瘤 (如卵巢癌細胞) 表面過度表達，因此可作為開發(fā)靶向藥物的配體[14]。此外，可通過蛋白展示技術[44]在小細胞外膜表面插入多肽，如肽PHLIP，它具有靶向腫瘤酸性微環(huán)境的能力。益生菌EcN來源的小細胞在酸配體PHLIP的靶向下可以攜帶化療藥物侵入腫瘤的壞死和缺氧區(qū)域進行治療[45]。小細胞與靶向腫瘤微環(huán)境的配體結合在腫瘤治療中具有相當大的潛力，更多靶向配體正在研發(fā)中。

T3SS可將細菌的毒力效應蛋白輸送到宿主細胞的胞質中[46]。小細胞有能力合成蛋白質并維持質子梯度以供T3SS的能量需求。因此，可以構建毒力減弱的沙門氏菌突變株，將編碼T3SS的質粒導入細菌中，使細菌分泌的小細胞中T3SS組分明顯升高。形成的富含T3SS組分的小細胞制劑可以用來遞送外源抗原 (融合T3SS效應蛋白)，繼而激活抗原特異性CD8+T細胞免疫應答[8]。

圖2 小細胞組裝藥物的流程[3,9]

2.3 小細胞的內(nèi)化

癌細胞大多數(shù)是非吞噬細胞，所以用于小細胞修飾的抗體或配體最好能與癌細胞表面能介導內(nèi)吞作用的受體特異性結合。在游離配體存在的情況下，表面偶聯(lián)配體的小細胞將和游離配體競爭與腫瘤細胞受體的結合，從而影響小細胞被腫瘤細胞攝取內(nèi)吞的效率。由此可見，小細胞表面的配體可通過特異性識別腫瘤細胞表面過度表達的受體而被后者所吞噬 (內(nèi)吞作用)，且小細胞內(nèi)化需要抗體/配體的主動靶向作用。眾所周知，網(wǎng)格蛋白參與細胞的內(nèi)吞作用，并且其攝取過程是需要能量的。因此，阻礙細胞ATP合成或網(wǎng)格蛋白通路的化學物質，如疊氮化鈉、苯賴氨酸氧化物等都可導致細胞內(nèi)化顯著下降[14]。低溫環(huán)境也會影響內(nèi)吞作用，導致細胞攝取率降低，4 ℃下細胞完全不攝取。

小細胞被腫瘤細胞內(nèi)吞后，腫瘤細胞內(nèi)的吞噬小體/溶酶體活性增強，小細胞經(jīng)晚期溶酶體酸化而被降解，完整性受到破壞。從溶酶體中滲漏出的蛋白藥物等可以進入細胞質發(fā)揮相應活性，而siRNA或miRNA則要繼續(xù)進入細胞核才能特異性地沉默相應基因[47]。單個細胞可攜帶多達40–50個小細胞藥物制劑。藥物在體內(nèi)激活Toll樣受體，從而誘導腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、干擾素-γ (IFN-γ) 和白細胞介素-6 (IL-6) 顯著增加[6]。同樣，機體其他組織也會有少量游離小細胞殘留，4 h后體內(nèi)IL-6、IL-8、IL-10升高，24 h后恢復正常。IFN-α在一些患者中會出現(xiàn)持續(xù)升高。血液參數(shù)也會受到短暫的影響，白細胞和中性粒細胞會輕微升高，淋巴細胞和單核細胞下降[5]。雖然機體內(nèi)生化指標會發(fā)生輕微變化，但在最大耐受劑量下并沒有明顯不良反應，無治療致死案例。此外，從血清抗體中檢測到小細胞的弱免疫原性，小細胞表面脂多糖引起體內(nèi)產(chǎn)生的抗脂多糖抗體在第15天內(nèi)達到峰值，反應呈劑量依賴性，重復給藥后未見增強，呈弱陽性[5-6]，說明小細胞在體內(nèi)是安全有效的。

此外，小細胞的來源使其具有天然靶向性，能被體內(nèi)相應的組織細胞內(nèi)吞。沙門氏菌、埃希氏菌和志賀氏菌都攜帶粘附素，在不使用靶向配體的情況下將藥物遞送至哺乳動物細胞時，來源于這些親本細菌的小細胞能被胃腸道中的腸細胞識別、內(nèi)吞而被降解[38]。這種天然靶向適用于遞送對結腸癌細胞有效的藥物。

2.4 遞送抗腫瘤藥物

近幾年研究表明，非復制性小細胞在遞送化療藥物、小分子干擾RNA、治療性蛋白質和DNA疫苗等方面有巨大的潛力。小細胞制劑多數(shù)以靜脈注射給藥，亦可通過口服或者鼻腔給藥，都能引起粘膜和體液免疫應答[48]。

小細胞對于不同結構、疏水性、電荷和溶解度的化學藥物，如紫杉醇 (Paclitaxel)、多柔比星 (Doxorubicin)、阿霉素 (Doxorubicin)、吉西他濱 (Gemcitabine) 等，都能輕易地實現(xiàn)裝載。用小細胞將細胞毒性劑紫杉醇靶向遞送至實體瘤中已進行Ⅰ期臨床試驗，這是一項新的生物系統(tǒng)進入人體臨床研究。在晚期實體瘤患者中，在最大耐受劑量為1010個小細胞作用下，具有表皮生長因子受體(EGFR)靶向、負載紫杉醇的小細胞(EGFR小細胞Pac)在患者中具有一定的腫瘤消除作用。未有治療不良而導致的死亡事件，從而證明小細胞遞送的紫杉醇用于腫瘤治療是安全有效的[5]。載有抗癌藥物多柔比星的小細胞也正應用于膠質母細胞瘤 (一種腦腫瘤) 患者的Ⅱ期試驗[12]。相關動物實驗研究也顯示，裝載了阿霉素或長春堿等藥物的小細胞，通過細胞表面的雙特異性抗體可以特異性地靶向乳腺癌[45]、白血病、肺癌和卵巢癌異種移植小鼠體內(nèi)的腫瘤細胞表面特定受體，從而釋放藥物并介導有效的腫瘤治療。此外，小細胞還可以裝載卡鉑、順鉑、5-氟尿嘧啶 (5-FU)、伊立替康和β-拉帕醌-單星素等化療藥物[6]。

除了包裝化療藥物，小細胞還為RNA干擾技術提供了強有力的載體。小細胞遞送的小分子干擾RNA，不僅可以實現(xiàn)相關基因的特異性沉默，抑制促腫瘤生長蛋白的表達，還能提高機體對藥物的耐受性[49-50]。siRNA和miRNA (由內(nèi)源基因編碼的非編碼單鏈RNA分子) 能夠靶向mRNA形成沉默復合物RISC，從而抑制mRNA表達。但它們在體內(nèi)會被血清核酸酶快速降解，穩(wěn)定性比較差，再加上這些RNA分子的細胞膜通透性也較差，導致其在體內(nèi)被靶細胞攝取的效率嚴重受限。而siRNA和miRNA可以很容易地穿過小細胞的內(nèi)膜，所以可以用小細胞來運載它們，從而實現(xiàn)靶向遞送并延長它們的作用時間[47]。Jivrajani等[14]將針對血管內(nèi)皮生長因子A (VEGFA) 的siRNA包裝在由大腸桿菌突變菌株產(chǎn)生的葉酸偶聯(lián)小細胞 (FA小細胞VEGFA) 中。在腫瘤異種移植小鼠上，F(xiàn)A小細胞VEGFA能夠沉默腫瘤血管內(nèi)皮細胞VEGFA mRNA的表達。VEGFA水平的降低繼而抑制新生血管的形成，切斷腫瘤的氧氣和營養(yǎng)供應，最終實現(xiàn)腫瘤的穩(wěn)定或消退。此外，針對耐藥性腫瘤，siRNA或shRNA還能抑制腫瘤細胞的耐藥性和提高機體對其他化療藥物作用的敏感性。用含有siRNA和細胞毒性藥物的小細胞制劑聯(lián)合治療，能達到比單獨遞送化療藥物更有效的腫瘤治療效果。Karagiannis等[49]發(fā)現(xiàn)，先應用小細胞遞送針對多藥抗性蛋白 (如PGP轉運蛋白) 的特異siRNA，再注射含有細胞毒性藥物的靶向小細胞，可消除之前具有耐藥性的腫瘤。這種組合療法對所涉及的藥物、siRNA和抗體比常規(guī)全身給藥少幾千倍[47]。在人體腫瘤臨床試驗中，用小細胞遞送miRNA模擬物來沉默惡性胸膜間皮瘤的血管內(nèi)皮生長因子，患者耐受良好并顯示了一定的抗腫瘤效果[50]。此外，對于體內(nèi)缺乏miRNA所引發(fā)的疾病，也可以使用小細胞裝載相應的miRNA來補充[51]。

小細胞還能表達質粒DNA上的特殊蛋白。將攜帶大量蛋白質抗原或質粒DNA疫苗的小細胞特異性靶向腫瘤細胞或抗原識別因子，引起機體免疫應答。此外，由于小細胞攜帶了親本細胞的胞質成分，它具有代謝活性，可以主動運輸代謝物、轉錄和翻譯質粒編碼的基因產(chǎn)物。某些經(jīng)改造的活的致病菌，如鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌，能呈現(xiàn)較低毒力甚至無毒力并且具有表達外源抗原的能力，有潛力成為有效的疫苗載體[52-53]，但這些細菌在體內(nèi)的安全性涉及致病性逆轉、水平基因轉移和不良炎癥反應等。而小細胞的使用為進一步開發(fā)安全有效的疫苗提供了一種獨特的替代方法，它保留了細菌能夠刺激機體固有免疫的大部分組分，包括脂多糖、溶血磷脂酸 (LPA) 和完整的肽聚糖層等。這些表面成分能被抗原遞呈細胞 (APC) 迅速識別為病原相關分子模式 (Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs) 從而激發(fā)機體的固有免疫應答[54]。在荷瘤小鼠中，用大腸桿菌小細胞遞送蛋白質抗原和質粒DNA可以誘導機體產(chǎn)生全身性抗原特異性反應，該遞送組合通過肌內(nèi)注射、鼻內(nèi)注射和口服等不同途徑給藥都能誘導產(chǎn)生高水平的特異性血清免疫球蛋白 (IgG)[54]。但應用小細胞同時遞送淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒 (LCMV) 核蛋白 (NP) 和相應的DNA疫苗至患有淋巴細胞脈絡叢腦膜炎的小鼠后，肌肉注射能產(chǎn)生更強的保護性細胞免疫，療效遠高于口服和鼻腔注射[7]。另外，Tsuji等研究顯示，新型生物制藥劑VAX-IP，一種基于表面結合侵襲素 (Invasin) 的細菌小細胞，能將細菌蛋白毒素(穿孔素O) 特異性地遞送至鼠和人尿道上皮細胞中的癌細胞 (高表達整合素異二聚體亞型α5β1或α3β1)，并發(fā)揮該毒素蛋白的腫瘤殺傷作用。為其應用于非肌層浸潤性膀胱癌和其他腫瘤的臨床研究提供依據(jù)[48]。最重要的是，上述實驗均在小細胞重復給藥條件下進行，小鼠存活率顯著提高，這表明小細胞作為藥物載體介導的腫瘤治療是安全有效的。

3 總結與展望

小細胞作為一種新型的藥物載體，可以用于遞送細胞毒性藥物、siRNA、miRNA、外源蛋白以及質粒DNA等，從而介導高效的抗腫瘤作用。目前使用小細胞介導腫瘤治療的臨床試驗也正在進行中[5]。從細菌中提取納米級生物微泡 (即小細胞) 后，可以對其表面進行修飾，使小細胞具有腫瘤靶向能力。經(jīng)過改造的具有腫瘤靶向性的小細胞，即使攜帶微量的藥物也能起到顯著的抗腫瘤作用；而脂質體攜帶的阿霉素劑量是小細胞100倍時，才會產(chǎn)生相同程度的腫瘤抑制作用[6]。相對于脂質體、納米顆粒和外泌體等載體，小細胞能改善藥物滲漏和增加藥物裝載量。而且，盡管化療藥物的結構、電荷、疏水性和溶解度不同，小細胞都可通過非特異性通道裝載；而脂質體、納米顆粒等需要對藥物或載體進行顯著的改變才能完成藥物裝載。外泌體是真核細胞主動分泌產(chǎn)生的一種直徑為40–100 nm的囊泡，只可攜帶蛋白質、mRNA及miRNA，不能對DNA疫苗進行翻譯表達[55]。而小細胞是細菌細胞異常分裂時期產(chǎn)生的，其具有基因表達的基本組分，因此小細胞可以作為良好的DNA疫苗載體。此外，小細胞的尺寸較大 (200–400 nm)，一般不會滲漏到非靶向組織 (正常組織中的微血管內(nèi)皮間隙致密，不允許粒徑大于100 nm的大分子物質自由通過[56])。此外，小細胞的腫瘤滲透性、低毒性和低生物降解性，也是其作為抗腫瘤藥物遞送載體的優(yōu)勢。

與活細菌相反，小細胞療法需要多次給藥。小細胞可以在體內(nèi)高劑量傳遞而不產(chǎn)生毒性，重復給藥后不會對動物造成明顯的毒副作用或死亡。在活體腫瘤模型中，小鼠經(jīng)多次小細胞靜脈注射后，未見發(fā)熱反應、體重減輕、皮膚或皮毛變化等癥狀，體內(nèi)電解質、腎臟和肝臟功能也沒有發(fā)現(xiàn)異常。這些結果說明小細胞的使用具有一定的安全性。然而，小細胞作為細菌的衍生物，其在體內(nèi)的安全使用仍存在幾個問題。首先，即使來源于弱致病性細菌的小細胞，其表面也有毒力因子，仍有可能引起機體產(chǎn)生炎癥甚至毒性不良反應，特別是腸外給藥時。高劑量注射小細胞時，肝酶水平會出現(xiàn)短暫升高，可能引發(fā)肝中毒，因此需要控制使用劑量以降低肝毒性[5]；Isabelle等[57]嘗試通過修飾細菌細胞膜表面成分來降低毒性，發(fā)現(xiàn)細菌缺失基因后，其脂質A豆蔻?；?，從而降低了Toll樣受體4 (TLR-4) 的信號轉導，LPS內(nèi)毒素活性大大減弱；此外，GRAS (Generally recognized as safe) 菌株或益生菌產(chǎn)生的小細胞可以降低其毒性，如天然無內(nèi)毒素的革蘭氏陽性菌谷氨酸棒狀桿菌或乳酸菌通過敲除的同源基因產(chǎn)生的小細胞，具有結構簡單、安全性高、免疫改善和生物降解率高等優(yōu)點[11-12]。其次，使用小細胞來遞送一些腫瘤抗原時，組分復雜的小細胞可能會誘發(fā)多重免疫反應，能否誘導機體產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫保護值得探究。此外，目前還無法實現(xiàn)小細胞的大規(guī)模純化或生產(chǎn)。

小細胞具有獨特的結構和組分，在藥物遞送和疫苗研制方面具有無可比擬的優(yōu)勢。但小細胞作為藥物遞送載體應用于人體臨床治療之前，還需在模式動物體內(nèi)進行毒理學、穩(wěn)定性和有效性等方面的深入研究，以便更好地了解小細胞的應用潛力和局限性。相信隨著生物技術的不斷發(fā)展和相關研究的深入，小細胞的開發(fā)利用一定會取得突破性的進展。

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Role of bacterial minicells in cancer therapy

Yuying Yang, Qing Liu, Pei Li, Hongyan Luo, Haoju Wang, and Qingke Kong

College ofAnimal Science and Technology, Southwest University, Chongqing 400715, China

Cancer is one of the most important diseases threatening human health. Frequently-used traditional cancer treatment methods, like radiotherapy, chemotherapy and surgery, have serious toxic side effects and limitations. The widely-used drug delivery carriers (liposomes, nanoparticles, etc.) have also possessed many issues such as drug leakage and incomplete loading in the late clinical stage. Currently, using tumor-targeting vectors to deliver anti-tumor drugs or small molecules is one of the promising strategies for mediating safe and effective tumor therapy. In recent years, bacterial-derived non-replicating minicells, which are nanoscale non-nucleated cells produced during abnormal bacterial division, have got more and more attention. With a diameter of 200–400 nm, minicells have a large drug loading capacity. Meanwhile, the surface of minicells are able to be modified to load the assembly of antibodies/ligands that bind to tumor cell surface specific antigens or receptors, which can significantly improve tumor targeting of minicells. This tumor-targeting nanomaterials of minicells not only are used to deliver anti-tumor chemotherapeutic drugs, functional nucleic acids or plasmids encoding functional small molecules to mammalian cells, but also greatly increase drug loading and reduce drug penetration. Thus, the use of minicells combining with chemical therapy could help reduce the toxicity and maximize the effectiveness of the drug in the body. This paper summarizes the research and development of production purification, drug loading, tumor cells targeting, and internalization process of minicells, as well as its use in the delivery of anti-tumor drugs, to provide some information for the development and utilization of minicell carriers.

minicells, cancer treatment, nanoparticle

November 8, 2018;

February 11, 2019

National Natural Science Foundation of China (No. 31570928), Natural Science Foundation of Chongqing, China (No. csct2018jcyjA1294), the Fundamental Research Funds for the Central Universities (Nos. SWU117062, SWU117061).

Qingke Kong. E-mail: kongqiki@swu.edu.cn

國家自然科學基金 (No. 31570928)，重慶市自然基金 (No. csct2018jcyjA1294)，中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金 (Nos. SWU117062, SWU117061) 資助。

2019-02-26

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20190225.1030.002.html

10.13345/j.cjb.180460

楊玉瑩, 劉青, 李沛, 等. 細菌小細胞在癌癥治療中的應用. 生物工程學報, 2019, 35(6): 998–1008.

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(本文責編 郝麗芳)