基因工程功能化絲蛋白生物材料及其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

張蕾，向仲懷，趙蓋超，吳宗輝，崔紅娟

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基因工程功能化絲蛋白生物材料及其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

張蕾1,2,3，向仲懷1,2,3，趙蓋超1,2,3，吳宗輝4，崔紅娟1,2,3

1 西南大學(xué) 家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400716 2 重慶市蠶絲生物材料與再生醫(yī)學(xué)工程研究中心，重慶 400716 3 西南大學(xué) 腫瘤生物醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化工程研究中心，重慶 400716 4 西南大學(xué) 西南大學(xué)醫(yī)院，重慶 400716

絲蛋白生物材料具有優(yōu)異的力學(xué)性能、良好的生物相容性及可降解性，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力?，F(xiàn)有絲蛋白生物材料在結(jié)構(gòu)和功能方面的相關(guān)知識(shí)，為設(shè)計(jì)合成新型絲蛋白生物材料提供了理論基礎(chǔ)。此外，利用基因工程技術(shù)可將編碼新肽或結(jié)構(gòu)域的基因序列添加到編碼絲蛋白的基因序列中，以獲得具有新功能的絲蛋白生物材料，并更好地滿足現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)的需求。文中總結(jié)了基因工程功能化的絲蛋白生物材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用現(xiàn)狀和發(fā)展前景。

絲蛋白，生物材料，功能化，基因工程，生物醫(yī)學(xué)

天然絲纖維具有極高的拉伸強(qiáng)度和延展性，同時(shí)具有質(zhì)輕的特點(diǎn)[1]?；谶@種天然聚合物的新型材料有許多潛在的應(yīng)用。例如應(yīng)用絲素蛋白制備的防彈背心、多功能繩索、降落傘顯示了良好的應(yīng)用前景[2-5]。因其卓越的生物相容性和生物可降解性，絲蛋白材料在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用受到了越來越多的關(guān)注。天然絲蛋白和重組絲蛋白可以加工成各種形貌，如薄膜、海綿、無(wú)紡布?jí)|、水凝膠、支架、膠囊或球體[2,6]。應(yīng)用絲蛋白材料構(gòu)建組織工程基質(zhì)以及構(gòu)建藥物、核酸和蛋白質(zhì)載體系統(tǒng)被證明具有巨大潛力[2-3,5-7]。

天然絲蛋白可以從不同的生物體中提取，蜘蛛和蠶是最常見的天然絲蛋白源。天然蛛絲蛋白因來源個(gè)體不同而材料性質(zhì)存在差異[8]，此外在蠶絲蛋白加工過程中需要去除絲膠蛋白，通常還需要進(jìn)一步的改性[9-11]。

以上問題都可以通過基因工程的手段來解決。通過基因重組技術(shù)可以個(gè)性化合成重組絲蛋白，以解決絲蛋白的可及性問題。此外，通過添加特定功能的基因片段可操縱氨基酸的組成，以實(shí)現(xiàn)絲蛋白生物材料的功能化(圖1)。這類改性可以增強(qiáng)絲蛋白纖維的優(yōu)異性能，并為進(jìn)一步修飾絲蛋白生物材料以實(shí)現(xiàn)應(yīng)用個(gè)性化提供可能。文中涵蓋了基因工程功能化絲蛋白生物材料的應(yīng)用現(xiàn)狀及其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的潛在應(yīng)用。

圖1 絲蛋白的獲取和功能化策略[11]

1 絲蛋白及其重組變體

1.1 天然絲蛋白的主要來源

最常用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究的天然蛛絲蛋白(Spidroins) 主要來自于絡(luò)新婦屬的金紡蜘蛛和圓蛛屬的十字園蛛[12]。絡(luò)新婦屬蜘蛛拖牽絲蛋白MaSp1、MaSp2以及十字園蛛絲素蛋白ADF4、ADF3是具有代表性的蜘蛛拖牽絲蛋白[13]。這些蛋白由富含甘氨酸和丙氨酸的重復(fù)結(jié)構(gòu)域組成[14-15]。富含丙氨酸的 (A)n或(GA)n基序形成β-折疊構(gòu)象，從而提高蛛絲的強(qiáng)度；富含甘氨酸的基序易于形成螺旋結(jié)構(gòu)，賦予蛛絲優(yōu)良的彈性。兩個(gè)含甘氨酸的GGX基序形成31-螺旋，與含脯氨酸的GPGXX基序一同參與β-轉(zhuǎn)角螺旋的形成[14]。這些重復(fù)單元的兩端由非重復(fù)且保守的N端和C端構(gòu)成，從而控制絲蛋白的溶解度及牽引絲的形成[12,16-17]。另一種表征較多的絲蛋白來自家蠶蠶繭的蠶絲蛋白。家蠶生產(chǎn)出的絲纖維由兩種絲蛋白組成：輕鏈(約26 kDa) 和重鏈(約390 kDa)，并通過二硫鍵連接。此外，糖蛋白P25以1∶6∶6 (P25∶重鏈∶輕鏈) 的比例通過非共價(jià)鍵與重-輕鏈復(fù)合物連接。重鏈的核心區(qū)域有大段重復(fù)的(GAGAGS)n基序，這些基序形成的β-折疊構(gòu)象有助于增加蠶絲纖維的強(qiáng)度[18]。

1.2 重組絲蛋白的獲取

如上所述，蠶絲蛋白可從家蠶蠶繭中獲得，但蛛絲蛋白需要利用生物技術(shù)工藝生產(chǎn)。利用天然cDNA在細(xì)菌中表達(dá)重組絲蛋白的方法是不可行的[19]。蠶絲蛋白的大型結(jié)構(gòu)及其片段重復(fù)的特點(diǎn)容易導(dǎo)致翻譯錯(cuò)誤及包涵體中的蛋白積累，最終導(dǎo)致絲蛋白的產(chǎn)量很低[19]。表達(dá)重組絲蛋白最有效的策略是采用具有重復(fù)核酸片段的可編碼絲蛋白多聚體的合成基因。可以根據(jù)天然絲蛋白的氨基酸序列，設(shè)計(jì)并合成出短單體模塊[20]。利用串聯(lián)、逐步連接或遞歸定向連接的方法，可以得到更大的多聚體結(jié)構(gòu)[20-21]。合成出的生物工程絲蛋白的編碼基因可以在不同宿主中表達(dá)。目前，生物工程重組絲蛋白已能夠在細(xì)菌(如大腸桿菌)、酵母(巴斯德畢赤酵母)、昆蟲(蠶幼蟲)、植物(大豆、擬南芥、馬鈴薯、煙草)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(幼倉(cāng)鼠腎BHK細(xì)胞系) 以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(小鼠、山羊) 中表達(dá)生成[22-27]。合成重組絲蛋白的最常用的表達(dá)系統(tǒng)是細(xì)菌。生產(chǎn)過程簡(jiǎn)單、擴(kuò)增時(shí)間較短、成本低以及生產(chǎn)過程可規(guī)?；羌?xì)菌表達(dá)系統(tǒng)的主要優(yōu)勢(shì)[21,28]。

盡管通過合成基因生產(chǎn)重組絲蛋白的方法為獲取理想特性的絲蛋白材料提供了可能，但這種方法仍需要改進(jìn)。編碼絲蛋白的基因序列在異源宿主中的表達(dá)產(chǎn)量會(huì)受到其序列大小和高度重復(fù)性片段的限制。為滿足絲蛋白表達(dá)的需求，需對(duì)宿主中核苷酸、tRNA、RNA聚合酶和核糖體的存量進(jìn)行評(píng)估。已有報(bào)道指出可以通過工程化宿主代謝途徑來提高重組絲蛋白的產(chǎn)量和質(zhì)量[28]。Xia等利用基因重組技術(shù)在大腸桿菌表達(dá)出來自絡(luò)新婦屬的金紡蜘蛛的一個(gè)284.9 kDa大小的拖牽絲蛋白，并成功將其紡成高強(qiáng)度的絲樣纖維，該纖維的機(jī)械性能可以與天然蛛絲媲美[28]。此外，在代謝組學(xué)、合成/系統(tǒng)生物學(xué)、數(shù)學(xué)和計(jì)算模型方面的最新進(jìn)展也有助于克服重組絲蛋白生產(chǎn)過程中的問題[29]。

除了蜘蛛和家蠶外，蜜蜂、螞蟻和大黃蜂等昆蟲也能生產(chǎn)絲纖維。與蠶絲和蜘蛛絲不同，這些物種的絲纖維不是由大段的重復(fù)性纖維蛋白組成的，而是由4個(gè)小的非重復(fù)性卷曲蛋白組成，編碼這些蛋白的基因已被鑒定[30-31]。由于其大小和結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，卷曲螺旋絲更適合于異源宿主中的重組生產(chǎn)[32-33]。重組獲得的絲蛋白可以通過自組裝形成原生卷曲螺旋結(jié)構(gòu)并能夠形成纖維[32]。此外，由單一重組絲蛋白組裝而成的纖維在結(jié)構(gòu)和功能上與由4個(gè)卷曲蛋白形成的天然絲相似[34]。其簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)方式和獨(dú)特的結(jié)構(gòu)性質(zhì)使得卷曲螺旋絲蛋白在開發(fā)用于生物醫(yī)學(xué)的新材料方面有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

利用絲蛋白材料的結(jié)構(gòu)和相應(yīng)功能的信息，可以設(shè)計(jì)出模仿天然絲蛋白特性的等價(jià)新材料[35]。這種方法為精確控制絲蛋白特性提供了可能。絲蛋白的分子量和氨基酸序列的改變以及基序位置的變化可影響絲蛋白的性質(zhì)，如二級(jí)結(jié)構(gòu)組成、溶解度、疏水性及電荷，這些反過來又會(huì)影響最終材料的形態(tài)[36]。此外，最近的一項(xiàng)研究指出，重組絲蛋白純化的方法也會(huì)影響最終絲蛋白生物材料的形態(tài)和性質(zhì)[37]。此外，計(jì)算機(jī)建模有助于生成具有可調(diào)特性的材料[38-39]。介觀耗散粒子動(dòng)力學(xué)(Dissipative particle dynamics，DPD) 模擬被用于描述蠶絲蛋白作為多嵌段共聚物的粗粒度，然后應(yīng)用該模型得出控制絲蛋白纖維組裝的加工條件和設(shè)計(jì)參數(shù)，該模型得到了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證[38]。模擬程序能夠大大減少設(shè)計(jì)和表征絲蛋白新材料所需的時(shí)間。

除了直接控制材料特性之外，基因工程還能夠?qū)崿F(xiàn)絲蛋白生物材料的功能化。編碼其他肽鏈或結(jié)構(gòu)域的核酸序列可以融合進(jìn)絲蛋白的編碼序列，這些新增的氨基酸序列可以賦予絲蛋白聚合物更多理想的特性。在擴(kuò)大絲蛋白生物材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用方面，基因工程起著至關(guān)重要的作用。

2 通過改變氨基酸序列實(shí)現(xiàn)絲蛋白生物材料的功能化

可以通過修飾絲蛋白的氨基酸序列來實(shí)現(xiàn)絲蛋白生物材料的功能化。針對(duì)絲蛋白序列關(guān)鍵位置上具有特定性質(zhì)的側(cè)鏈序列，添加或替換單個(gè)或多個(gè)氨基酸可以實(shí)現(xiàn)對(duì)絲蛋白生物材料性質(zhì)的控制(表1)。

2.1 修飾氨基酸序列可以控制絲蛋白的溶解度

將6-mer絲蛋白(基于絡(luò)新婦屬蜘蛛拖牽絲蛋白MaSp1) 的聚丙氨酸區(qū)域與甲硫氨酸側(cè)接，可以有效控制蠶絲的溶解度[40]。甲硫氨酸有觸發(fā)氧化還原的作用。β-折疊結(jié)構(gòu)在還原態(tài)下形成，而甲硫氨酸殘基選擇性氧化可以抑制β-折疊結(jié)構(gòu)的形成，加大蛋白結(jié)構(gòu)的體積并增加絲蛋白的親水性[40]。加強(qiáng)對(duì)溶解度的控制，能夠防止絲蛋白過早沉淀，從而大大提高絲蛋白材料的凈化效率。還可以利用這種方式來設(shè)計(jì)刺激響應(yīng)性材料，使其在刺激下從水相轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔?。此外，與結(jié)晶度高的絲素膜相比，結(jié)晶度較低的絲素膜能更有效地結(jié)合帶正電荷的藥物[41-42]。通過操縱絲蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，可以控制絲蛋白生物材料與藥物結(jié)合和釋放的特性及其可生物降解性[43-44]。

2.2 修飾氨基酸序列可以改變絲蛋白的總電荷

修飾氨基酸序列可導(dǎo)致重組絲蛋白的總電荷發(fā)生變化。用帶正電荷的氨基酸取代帶負(fù)電荷的氨基酸可以極大地增強(qiáng)細(xì)胞攝取絲蛋白載體的能力。用賴氨酸取代重組絲蛋白eADF4 (C16) (基于十字園蛛絲素蛋白ADF4) 中所有的谷氨酸殘基所得到的陽(yáng)離子變體(eADF4(κ16)) 形成的球體，其內(nèi)化速率與未修飾的eADF4 (C16) 球體相比顯著增加[45]。在eADF4 (C16) 的氨基酸序列中插入半胱氨酸，可以引入一種新的分子結(jié)合位點(diǎn)[46]。半胱氨酸殘基上的巰基可與多種化合物如染料、生物素或β-半乳糖苷酶形成共價(jià)鍵[46]。并且，這種修飾方法得到的絲蛋白可以用于合成具有多層結(jié)構(gòu)的多用途材料。

2.3 修飾氨基酸序列可以控制絲蛋白的生成和純化

通過氨基酸序列修飾的功能化不僅限于絲蛋白的重復(fù)區(qū)域，其末端結(jié)構(gòu)域也可以進(jìn)行氨基酸序列的修飾。非洲育兒網(wǎng)蛛絲蛋白MaSp1 N末端結(jié)構(gòu)域的雙重突變體，可以應(yīng)用于重組絲蛋白的生成和純化[47]。在N末端結(jié)構(gòu)域用賴氨酸替換40位天冬氨酸，并用天冬氨酸取代65位賴氨酸，將其產(chǎn)生的突變體命名為NT*。與野生型相比，NT*變體對(duì)pH不敏感，其性質(zhì)穩(wěn)定并且溶解度極高。與其他常用的溶解性標(biāo)簽相比，這種突變體使重組生成各種疏水和/或聚集傾向性絲蛋白成為可能，且產(chǎn)量更高，通過這種方法可以合成藥學(xué)相關(guān)的重組絲蛋白并在臨床中應(yīng)用。

表1 通過改變氨基酸序列實(shí)現(xiàn)絲蛋白生物材料的功能化

3 通過添加功能性肽實(shí)現(xiàn)絲蛋白生物材料的功能化

功能性肽由多個(gè)(通常為8–12個(gè)) 氨基酸組成并具有一定的性質(zhì)，例如抗微生物活性、酶活性、受體配體識(shí)別或與靶分子結(jié)合的特性。通過基因工程的方法，可以將這些肽的編碼序列引入生物工程絲蛋白的編碼序列中。這種簡(jiǎn)單的基因修飾能夠形成適用于藥物遞送和組織工程的功能化絲蛋白材料。本文中論述的通過添加功能肽實(shí)現(xiàn)絲蛋白生物材料功能化的實(shí)例見表2。

3.1 用于細(xì)胞靶向藥物遞送系統(tǒng)的絲蛋白材料的功能化

藥物遞送系統(tǒng)應(yīng)通過減少藥物與生物體之間的不良相互作用，將治療劑的不利影響降至最低。使用載體包埋藥物不僅是為了降低其毒性，還應(yīng)保護(hù)藥物在遞送過程中不被降解。遞送系統(tǒng)的另一個(gè)特性應(yīng)該是在釋放上載藥物之前到達(dá)靶向器官、組織或細(xì)胞。此外，用于藥物輸送的載體應(yīng)該是無(wú)毒并可生物降解的。未經(jīng)修飾的基于絲蛋白的藥物遞送系統(tǒng)只能解決上述提到的部分問題。盡管有無(wú)毒和可生物降解的已知絲蛋白載體，并且能夠有效地保護(hù)其包埋的藥劑免于降解[48-49]，但是這些未經(jīng)修飾的絲蛋白載體無(wú)法實(shí)現(xiàn)靶向遞送，并且其細(xì)胞內(nèi)化的效率極低[49-50]。已被報(bào)道的利用未經(jīng)修飾的絲素蛋白載體的抗癌療法，可以遞送小分子藥物如阿霉素[51]、紫杉醇[52]、姜黃素[53]或順鉑[54]，這些研究指出載體會(huì)因?yàn)楦咄ㄍ感院蜏粜?yīng)(Enhanced permeability and retention，EPR) 而沉積在腫瘤部位。

通過將適當(dāng)?shù)墓δ苄噪囊肷锕こ袒z蛋白，可以有效改善絲蛋白載體的細(xì)胞內(nèi)化效率。添加聚賴氨酸(KKKKKKKKKKKKKKK) 或聚精氨酸片段(RRRRRRRR) 顯著增加了細(xì)胞對(duì)絲蛋白球的攝取[45,49,55]。這些殘基的正電荷還能夠通過與磷酸主鏈上的負(fù)電荷相互作用實(shí)現(xiàn)與核酸的結(jié)合[46–47]。這些肽的插入不會(huì)影響MS2 (基于絡(luò)新婦屬蜘蛛拖牽絲蛋白MaSp2) 和6-mer絲蛋白(基于絡(luò)新婦屬蜘蛛拖牽絲蛋白MaSp1) 的自組裝能力，并且這些功能化絲蛋白能夠形成與核酸結(jié)合的球體或復(fù)合物[46-47]。與帶正電荷的肽融合的6-mer絲蛋白可應(yīng)用于合成絲蛋白膜以遞送治療性基因[55]。目前可用的病毒載體在體內(nèi)應(yīng)用后可能產(chǎn)生副作用，而基于絲蛋白的基因遞送系統(tǒng)是較好的替代品[56]。

為了進(jìn)一步改善細(xì)胞內(nèi)化，整合素結(jié)合基序及各種細(xì)胞穿膜肽(Cell-penetrating peptides，CPPs) 已應(yīng)用于生物工程化絲蛋白載體[7,45,48,57-58]。雖然CPPs能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)化作用，但其缺乏細(xì)胞特異性。為了獲得更高的選擇性，可以將識(shí)別細(xì)胞表面特定分子的肽與絲蛋白融合。腫瘤歸巢肽(Tumor-homing peptides，THPs)能夠有效靶向腫瘤微環(huán)境[59]，F(xiàn)3肽(KDEPQRRSARLSAKPAPPKP EPKPKKAPAKK) 能夠特異性結(jié)合核仁素(在血管內(nèi)皮細(xì)胞及一些腫瘤細(xì)胞表面上表達(dá)的分子)，CGKRK肽能夠與腫瘤血管中存在的硫酸乙酰肝素特異性結(jié)合[60]。這些肽都已成功地融合到聚賴氨酸肽功能化的6-mer蛋白中[58]。CGKRK肽和F3功能化絲/pDNA復(fù)合物對(duì)MDA-MB-435黑素瘤癌細(xì)胞及MDA-MB-231高轉(zhuǎn)移性人乳腺癌細(xì)胞顯示出了靶向特異性，但對(duì)非致瘤性的MCF10A乳腺上皮細(xì)胞(對(duì)照組) 則沒有靶向特異性[61]。在體外實(shí)驗(yàn)中，這兩種復(fù)合物在測(cè)試的癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染率顯著高于對(duì)照細(xì)胞。Numata等合成了pDNA的納米復(fù)合物以及一種工程化絲蛋白單體(1-mer) (基于絡(luò)新婦屬蜘蛛拖牽絲蛋白MaSp1)，其經(jīng)聚賴氨酸肽功能化可與核酸結(jié)合，同時(shí)也具有F3或Lyp1肽的特性[58]。Lyp1肽(CGNKRTRGC) 可靶向某些腫瘤的淋巴管[62]。與未修飾的變體和非致瘤性乳腺上皮細(xì)胞相比，這種功能化絲蛋白/pDNA的納米復(fù)合物在MDA- MB-231和MDA-MB-435細(xì)胞中也顯示出更高的轉(zhuǎn)染率[58]。

還有研究提出針對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體2 (Her2) 的絲蛋白修飾[50,63]。Her2在20%–30%的浸潤(rùn)性乳腺癌中過度表達(dá)[64]。由Her2結(jié)合肽功能化的重組MS1 (基于絡(luò)新婦屬蜘蛛拖牽絲蛋白MaSp1) 蛋白球在呈Her2陽(yáng)性的SKOV3和SKBR3細(xì)胞系中有細(xì)胞內(nèi)化現(xiàn)象，這與普通MS1蛋白球和Her2陰性細(xì)胞系對(duì)照組觀察到的情形相反[50]。兩種腫瘤歸巢肽的變體H2.1 (MYWGDS HWLQYWYE) 和H2.2 (LTVSPWY) 在不同的構(gòu)型(在N和C末端融合) 情況下被評(píng)估。在N末端具有H2.1或H2.2結(jié)合肽的變體顯示出比C末端變體更高的結(jié)合效率。此外，這些用于靶向遞送的肽不會(huì)損害絲蛋白自組裝的能力，因此能夠成功生成球體。另外，載有模型藥物多柔比星(Dox) 的功能化球體能夠有效地將細(xì)胞毒性藥物遞送到靶細(xì)胞中[50]。使用相同的肽(H2.1或H2.2) 對(duì)MS2功能化得到的球體與靶細(xì)胞的結(jié)合作用明顯低于MS1功能化絲蛋白球[63]。根據(jù)不同重量比(8∶2) 混合功能化MS1和MS2絲蛋白球與靶細(xì)胞的結(jié)合水平與功能化MS1絲蛋白球相同，但其物理化學(xué)性質(zhì)有了顯著的改善。此外，與功能化MS1絲蛋白球相比，裝載藥物的功能化MS1∶MS2顆?？梢酝ㄟ^誘導(dǎo)相當(dāng)?shù)偷姆翘禺愋远拘远行⑺腊屑?xì)胞[63]。

絲蛋白藥物遞送系統(tǒng)的替代策略涉及使用腫瘤特異性配體，例如CpG-siRNA的核酸序列[49]。由聚賴氨酸肽KN (KKKKKKKKKKKKKKK) 功能化的MS2絲蛋白球顯示出CpG-siRNA的有效加載。這些絲蛋白球保護(hù)其搭載物在血清中被降解，使其內(nèi)化進(jìn)入靶細(xì)胞，并可持續(xù)性釋放基于siRNA的治療劑到細(xì)胞質(zhì)中[49]。此外，工程化絲蛋白球的封裝改變了CpG-STAT3siRNA加工的動(dòng)力學(xué)，導(dǎo)致靶分子延遲并延長(zhǎng)了CpG-STAT3siRNA的沉默[49]。在該策略中，特異靶向性由核酸CpG序列提供，并可以選擇性地影響細(xì)胞對(duì)Toll樣受體9 (Toll-like receptor 9，TLR9) 的表達(dá)。另外，此系統(tǒng)可以通過加載不同的基于核酸的治療劑(靶向不同的細(xì)胞或沉默不同的基因)，擴(kuò)展基于絲蛋白核酸遞送系統(tǒng)的潛在靶標(biāo)。

3.2 具細(xì)胞粘附性的絲蛋白材料的功能化

絲蛋白材料的生物相容性及獨(dú)特的物理性質(zhì)使其在組織工程領(lǐng)域中非常有用。絲蛋白材料的功能化有助于更好地滿足再生醫(yī)學(xué)的需求。整合素結(jié)合基序(如RGD) 的添加不僅可以介導(dǎo)絲蛋白藥物載體進(jìn)入細(xì)胞的內(nèi)化作用[45,57]，而且還能促進(jìn)細(xì)胞在絲蛋白基質(zhì)上的粘附和增殖[65-67]。RGD功能化的生物工程絲蛋白比用RGD基序化學(xué)修飾的絲蛋白在細(xì)胞粘附和增殖方面的表現(xiàn)更為突出[65]。其優(yōu)勢(shì)在于其合成比化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)更容易、更快，另外化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)還需要一些額外的步驟[65]。此外，化學(xué)改性的絲蛋白還存在污染及副作用等潛在問題。

Widhe等分析了成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和Schwann細(xì)胞對(duì)用整合素蛋白結(jié)合肽如RGD或IKVAV功能化的生物工程4RepCT絲蛋白(基于育兒網(wǎng)蛛拖牽絲蛋白MaSp1) 基質(zhì)的粘附作用[66]。研究顯示RGD功能化的絲蛋白基質(zhì)(纖維、薄膜和泡沫) 的細(xì)胞粘附性明顯高于未修飾的絲蛋白基質(zhì)。與未修飾的4RepCT基質(zhì)相比，Schwann細(xì)胞對(duì)含有IKVAV肽的薄膜也顯示出更好的粘附性[66]。這些功能化材料可用作研究細(xì)胞培養(yǎng)或組織再生的支架材料。結(jié)合肽(RGD、IKVAV和YIGSR) 也可以與4RepCT生物工程絲蛋白融合，用作體外胰腺細(xì)胞培養(yǎng)的支 架[67]。這些修飾(特別是RGD肽) 強(qiáng)化了絲蛋白支架維持人胰島細(xì)胞培養(yǎng)的能力，并使細(xì)胞的增殖能力得到增強(qiáng)[67]。該系統(tǒng)可用于糖尿病治療。由于有效移植需要大量的活細(xì)胞，可行有效的方法是在移植前分離胰島并對(duì)其進(jìn)行體外培養(yǎng)。功能化的絲蛋白支架有助于獲取足夠數(shù)量的胰島細(xì)胞以進(jìn)行有效的糖尿病治療。

科學(xué)家還利用家蠶胚胎發(fā)育期的卵進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將YIGSR和RGD基序成功引入了絲素蛋白序列，獲得了能夠產(chǎn)生功能化絲蛋白的轉(zhuǎn)基因家蠶品系。研究表明，含有層粘連蛋白肽YIGSR的絲蛋白材料具有良好的生物相容性，在血管移植物應(yīng)用方面具有前景[68]。

含有RGD基序的肽的長(zhǎng)度、數(shù)量、相鄰的氨基酸及二級(jí)結(jié)構(gòu)在細(xì)胞粘附過程中起重要作用。在與4RepCT絲蛋白融合的RGD基序的3種不同形式的肽中(一種環(huán)形和兩種線性對(duì)照形)，環(huán)形肽對(duì)角質(zhì)細(xì)胞與絲蛋白基質(zhì)(膜) 的粘附有最佳增強(qiáng)效果。肽的環(huán)化是通過將半胱氨酸殘基插入其序列(CTGRGDSPAC) 中來實(shí)現(xiàn)的[69]。

3.3 具有抗菌特性的絲蛋白材料的功能化

用于組織工程的具有抗菌特性的生物材料將有助于防止植入部位的局部感染，從而顯著縮短患者的康復(fù)時(shí)間。生物工程絲蛋白已被具有抗菌特性的肽功能化，如人中性粒細(xì)胞防御素HNP-2 (CYCRIPACIAGERRYTSGTCIYQGRLWAFCC)、HNP-4(VCSCRLVFCRRTELRVTSGNCCLIGGVSFTYCCTRV)和鐵調(diào)素(DTHFPICIFCCGCCHRSK CGMCCKT)[70]。絲蛋白和抗菌肽的融合在合成防止植入后感染的材料方面很有潛力。除了生物醫(yī)學(xué)中的潛在應(yīng)用(如上所述，例如血管移植物、植入物涂層和組織工程基質(zhì))，具有抗菌活性的絲蛋白在化妝品和食品工業(yè)中也有應(yīng)用潛力。

3.4 結(jié)合無(wú)機(jī)分子的絲蛋白材料的功能化

在溫和的生理?xiàng)l件下，諸如筒柱藻等生物能夠生成多功能二氧化硅三維多孔結(jié)構(gòu)。Silaffin親硅蛋白在這一過程中起著重要作用。來自親硅蛋白的R5肽(SSKKSGSYSGSKGSKRRIL) 能夠以受控方式結(jié)合并沉積二氧化硅[71]。據(jù)報(bào)道，R5肽功能化的6-mer絲蛋白薄膜不僅能夠在其表面沉積生物硅，還能通過控制絲蛋白的β-折疊含量來控制二氧化硅礦化的尺寸和速率[72]。此外，用R5肽功能化15-mer絲蛋白形成的復(fù)合絲/二氧化硅膜，能夠促進(jìn)hMSCs的增殖及其向成骨譜系的分化[73]。這些性質(zhì)使R5肽功能化的絲蛋白基質(zhì)可在以骨再生為目的的應(yīng)用中發(fā)揮作用。

適用于骨重建的絲蛋白材料的另一種合成方法，涉及到VTK肽(VTKHLNQISQSY) 與15-mer絲蛋白的融合[74]。由絲蛋白-VTK形成的薄膜是無(wú)毒的，并且與未改性絲蛋白制成的對(duì)照材料相比，它不僅能夠成功地誘導(dǎo)生物礦化，還可以增強(qiáng)hMSC的分化[74]。

絲蛋白材料也已被成功改性以結(jié)合金屬。結(jié)合銀納米粒子的肽的功能化使得具抗菌特性的絲蛋白膜的設(shè)計(jì)得以實(shí)現(xiàn)[75]。12-氨基酸肽Ag-4 (NPSSLFRYLPSD) 和Ag-P35 (WSWRSPTPHVVT)與6-mer和15-mer生物工程絲蛋白融合后，成功誘導(dǎo)了銀納米顆粒從硝酸銀溶液(AgNO3) 中的生成[75]。并且這種功能化不會(huì)影響絲蛋白的自組裝功能。在沉積銀納米顆粒后，這種功能化的絲蛋白薄膜對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌具有更長(zhǎng)效的抗菌活性[75]。

衍生自草履蟲鈣調(diào)蛋白的突變片段用U1肽(EQIAEFKEAFALCTKDGTGYITTKELGTCMRSLTS)和U2肽 (EQIAEFKEAFALCTKDGTGYITT KELGTCMRSLTS)2肽功能化后，鈾酰離子可與絲蛋白結(jié)合[76]。天然肽中鈣結(jié)合位點(diǎn)的點(diǎn)突變實(shí)現(xiàn)了對(duì)鈾酰離子的選擇性結(jié)合[77]。用這些肽修飾6-mer絲蛋白，可以獲得能夠螯合鈾酰離子的功能性融合蛋白[76]。這種改性絲蛋白可用于設(shè)計(jì)新的生物材料，實(shí)現(xiàn)治療暴露性鈾污染、環(huán)境污染的生物修復(fù)及構(gòu)建生物傳感器等目的。

表2 通過添加功能性肽實(shí)現(xiàn)絲蛋白生物材料的功能化

能夠強(qiáng)化細(xì)胞粘附的功能化絲蛋白材料可以作為植入材料的涂層使用。絲蛋白涂層可以幫助周圍的細(xì)胞附著到植入物的表面，進(jìn)而縮短恢復(fù)期并增加植入材料(例如鈦) 的生物相容性。生物工程4RepCt絲蛋白通過纖連蛋白的細(xì)胞結(jié)合肽(CTGRGDSPAC) 和抗菌基序Mag (GIGKFLH SAGKFGKAFVGEIMKS)功能化后，被成功地加工到了鈦、不銹鋼、羥磷灰石和聚苯乙烯基質(zhì)的涂層中[4]。涂覆過程并不影響生物工程絲蛋白的功能。Fn功能化絲蛋白更強(qiáng)的細(xì)胞粘附性及Mag肽功能化絲蛋白更好的抗菌性能證明，這種生物工程絲蛋白可以用于無(wú)機(jī)植入物涂層材料的合成[4]。

4 通過設(shè)計(jì)嵌合蛋白實(shí)現(xiàn)絲蛋白生物材料的功能化

設(shè)計(jì)者可以從天然絲蛋白獲得設(shè)計(jì)新生物材料的靈感，利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系，將衍生自不同蛋白的序列融合，從而生成新的生物材料。這種新的生物材料可以擁有獨(dú)特的生物物理和生物化學(xué)性質(zhì)。通過該策略產(chǎn)生的絲蛋白嵌合體可以擁有絲蛋白的強(qiáng)度、生物相容性及自組裝能力，而結(jié)合到絲蛋白中的其他蛋白的基序/結(jié)構(gòu)域則能夠提供額外的功能。對(duì)這些功能加以控制，則能夠使這些新材料準(zhǔn)確適用于各種應(yīng)用。本文中論述的通過設(shè)計(jì)并添加嵌合蛋白實(shí)現(xiàn)絲蛋白生物材料功能化的實(shí)例見表3。

4.1 嵌合生物聚合物

絲彈性蛋白聚合物(Silk elastin-like protein, SELP) 是基于家蠶絲蛋白基序(GAGAGS) 和哺乳動(dòng)物彈性蛋白基序(GXGVP，其中X可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸) 的串聯(lián)重復(fù)單元[78]。SELP由半結(jié)晶(絲) 塊和彈性(彈性蛋白) 嵌段組成。絲肽自組裝成不溶性β-折疊結(jié)構(gòu)以提供熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械穩(wěn)定性，而彈性蛋白通過可逆的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變以提供動(dòng)態(tài)功能[78]。在適當(dāng)?shù)臐舛群蜏囟认?，SELP可以通過快速的親水-疏水轉(zhuǎn)變以響應(yīng)溫度、pH及離子強(qiáng)度變化等刺激，實(shí)現(xiàn)由可溶狀態(tài)向水凝膠狀態(tài)的轉(zhuǎn)變[78-79]。彈性蛋白序列中重復(fù)區(qū)段和X殘基的數(shù)量決定了該材料的物理化學(xué)性質(zhì)[80-81]。由于其在一定溫度下能表現(xiàn)出可溶狀態(tài)及在體溫下呈固體狀態(tài)，該材料可用作組織定位藥物或基因遞送的可注射、無(wú)溶劑的儲(chǔ)存庫(kù)，或用于以組織再生為目的應(yīng)用[82-85]。

由疏水膠原蛋白和富含組氨酸的絲蛋白組成的絲-膠原蛋白嵌合體能夠?yàn)榇碳ろ憫?yīng)水凝膠提供穩(wěn)定的平臺(tái)。由于在絲蛋白的側(cè)翼位置存在膠原結(jié)構(gòu)域，嵌合蛋白在生理pH下能夠從可溶狀態(tài)轉(zhuǎn)化為固體纖維和水凝膠。由于在這種絲-膠原蛋白嵌合體中缺乏細(xì)胞結(jié)合基序，細(xì)胞不會(huì)像對(duì)照(膠原蛋白)組中的細(xì)胞那樣擴(kuò)散和附著；這種絲-膠原水凝膠能夠支持大鼠骨間充質(zhì)干細(xì)胞在成骨培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)。絲-膠原蛋白嵌合體的主要優(yōu)點(diǎn)是在細(xì)胞培養(yǎng)的21 d期間沒有觀察到材料的收縮。材料的收縮是膠原蛋白凝膠的主要缺點(diǎn)，因?yàn)樗z網(wǎng)絡(luò)的收緊可能導(dǎo)致鈣的流失[86]。

4.2 用于結(jié)合無(wú)機(jī)分子的絲嵌合蛋白

牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1 (Carboxyl terminal domain of dentin matrix protein 1，CDMP1) 與15-mer蜘蛛絲蛋白重復(fù)嵌段的融合產(chǎn)生了新的功能材料DMP1。DMP1具有成核能力，并能夠在成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞或成釉細(xì)胞中表達(dá)。DMP1能夠通過羥基磷灰石的成核影響骨重建過程。由這種嵌合蛋白制成的耐用薄膜，也能夠使羥基磷灰石成核[87]。這些特性使得絲-牙本質(zhì)嵌合膜成為骨組織工程和牙組織工程上具有應(yīng)用前景的新材料。

基于6-mer絲蛋白和骨涎蛋白(Bone sialoprotein，BSP) 的嵌合蛋白可用于制備模擬ECM的骨組織再生薄膜[88]。BSP由成骨細(xì)胞(特別是礦化結(jié)締組織)表達(dá)，能夠促進(jìn)細(xì)胞粘附和分化，在骨形成和重塑中起重要作用[89]。體外研究表明，絲-BSP嵌合蛋白可誘導(dǎo)磷酸鈣(CaP) 的成核[88]，hMSC細(xì)胞在絲-BSP膜上培養(yǎng)2周后，能夠在成骨培養(yǎng)基中維持增殖并分化為成骨細(xì)胞[88]。

4.3 用于結(jié)合有機(jī)分子的絲嵌合蛋白

擁有結(jié)合各種有機(jī)分子的能力可以顯著增加絲蛋白作為生物材料的相關(guān)性。蛋白質(zhì)片段，如白蛋白結(jié)合域(Albumin-binding domain，ABD)、生物素結(jié)合域(M4)、鏈球菌蛋白G (Streptococcal protein G，SPG) 的IgG結(jié)合域(C2) 及葡萄球菌蛋白A (Staphylococcal protein A，SPA) 的IgG結(jié)合域(Z)，均已成功融合到4RepCT生物工程絲蛋白上，并且不會(huì)影響絲蛋白自組裝成纖維和薄膜的能力[90]。此外，融合和加工成基質(zhì)并不會(huì)損害所添加的結(jié)構(gòu)域選擇性結(jié)合靶分子的能力。由兩種不同的絲融合蛋白制成的基質(zhì)還顯示出了結(jié)合特性。許多分子在固定時(shí)容易失去生物活性，因此通過融合進(jìn)行絲蛋白材料功能化的方法非常重要。合成材料結(jié)合特定分子的能力可以用于不同類型的測(cè)試，而絲蛋白則可以充當(dāng)固定分子的平臺(tái)[90]。

Thatikonnda等提出了一種由絲蛋白與人抗體衍生的單鏈可變片段(Single-chain variable fragment，scFv) 融合而成的絲蛋白材料[91]。scFv結(jié)合了輕抗體鏈和重抗體鏈中負(fù)責(zé)抗原識(shí)別的可變片段。通過兩種識(shí)別不同血清蛋白的scFv和兩種部分絲蛋白變體(稱為RC和NC) 的基因融合，產(chǎn)生了幾種絲蛋白嵌合體的變體。在這些絲蛋白嵌合體中保留了scFv結(jié)構(gòu)域的抗原識(shí)別，并且這些雜合蛋白能夠選擇性地結(jié)合它們的靶標(biāo)。此外，scFv/NC變體顯示出更好的溶解性，能夠?qū)⒔z蛋白納米分散成納米陣列[91]。這種材料是下一代免疫測(cè)定和生物傳感器的潛在選擇。

用于診斷和生物傳感器的絲蛋白材料的另一種功能化是通過絲蛋白與酶的融合實(shí)現(xiàn)的。絲可以作為穩(wěn)固的框架，而酶可以為生物工程材料提供催化功能。木聚糖酶與4RepCT絲蛋白的成功融合表明這種修飾確實(shí)可行且有效。這種材料在乙醇清洗時(shí)很耐用，并可以重復(fù)使用和儲(chǔ)存。此外，將嵌合蛋白加工成不同的形態(tài)(纖維、薄膜和泡沫)后，這些特性仍得以保留[92]。

纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Cellulose-binding domain，CBD) 與15-mer絲蛋白融合得到的重組絲蛋白可以有效地結(jié)合纖維素納米晶體(Cellulose nanocrystals，CNCs)，從而形成絲蛋白-CBD-CNC納米復(fù)合材料[93]。與絲蛋白一樣，纖維素具有突出的機(jī)械性能，常用于形成透明薄膜和水凝膠。然而，由于其加工所需的環(huán)境要求較高，其在體內(nèi)的應(yīng)用相當(dāng)有限。CBD結(jié)構(gòu)域的存在使絲蛋白通過絲蛋白-CBD二聚體而能夠形成更高的有序結(jié)構(gòu)(即纖維)[93]。向絲蛋白-CBD溶液中添加CNCs可以進(jìn)一步排列纖維，從而形成高度有序和透明的材料[93]。生成的薄膜可應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)。由于其高度透明的特性，該生物材料特別適合促進(jìn)角膜再生。

表3 通過設(shè)計(jì)嵌合蛋白實(shí)現(xiàn)絲蛋白生物材料的功能化

5 總結(jié)及展望

5.1 基因工程化絲蛋白的應(yīng)用現(xiàn)狀

目前，在大量已有的生物材料平臺(tái)中，絲蛋白因其機(jī)械性能高、生物相容性好和可生物降解脫穎而出(圖2)。在分子水平上利用基因工程的手段改造絲蛋白，可以使其更多樣化地應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域。此外，基因工程化方法可以進(jìn)一步改善絲蛋白生物材料的顯著特性。已有報(bào)道證實(shí)了絲蛋白材料在癌癥治療[94]、再生醫(yī)學(xué)[95]及基因傳遞系統(tǒng)[55]中具有巨大的應(yīng)用價(jià)值，并且某些絲蛋白生物材料已經(jīng)進(jìn)入臨床測(cè)試階段[96]。此外，肽序列數(shù)據(jù)庫(kù)(PepBank) 有助于進(jìn)一步設(shè)計(jì)和開發(fā)具備更多功能的絲蛋白生物材料[97]。對(duì)新型個(gè)性化生物材料的需求在持續(xù)增加，基因工程為設(shè)計(jì)新的生物聚合物以匹配生物材料的特殊功能提供了新的途徑。

5.2 基因工程化絲蛋白的應(yīng)用前景和挑戰(zhàn)

由于利用基因工程技術(shù)可以在分子水平上對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)并實(shí)現(xiàn)更便利的控制，基因重組技術(shù)促進(jìn)了絲蛋白生成的產(chǎn)量和質(zhì)量，但這些蛋白的高度重復(fù)性序列以及其表達(dá)量和結(jié)構(gòu)的大小依然是主要的挑戰(zhàn)，合成生物學(xué)新策略的開發(fā)將在這些問題上提供更多的可能。而生物技術(shù)策略的使用不僅解決了絲蛋白材料易獲得性的問題，而且能夠使絲蛋白的性能得到改變，并為絲蛋白生物材料添加更多新的特性。

雖然基因工程拓寬了絲蛋白材料的潛在應(yīng)用范圍，但其仍可能存在一些局限性。一種新的生物工程絲蛋白必須保留源絲蛋白的特性，即具有自組裝能力。此外，添加新的結(jié)構(gòu)域可能會(huì)誘導(dǎo)絲蛋白的免疫原性或毒性，這是在體內(nèi)應(yīng)用具有關(guān)聯(lián)性的關(guān)鍵問題。因此，有必要對(duì)改性絲蛋白生物材料的性能進(jìn)行詳細(xì)的評(píng)價(jià)。目前，基因工程化的方法修飾絲蛋白材料還有較大研究潛力，相信未來具有可調(diào)可控特性的絲蛋白聚合物作為安全的功能材料會(huì)在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用。

圖2 生物工程絲的功能化應(yīng)用[11]

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Functionalized genetic engineered silk-based biomaterials and their applications

Lei Zhang1,2,3, Zhonghuai Xiang1,2,3, Gaichao Zhao1,2,3, Zonghui Wu4, and Hongjuan Cui1,2,3

1 State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Southwest University, Chongqing 400716, China 2 Chongqing Engineering and Technology Research Center for Silk Biomaterials and Regenerative Medicine, Chongqing 400716, China 3 Engineering Research Center for Cancer Biomedical and Translational Medicine, Southwest University, Chongqing 400716, China 4 Hospital of Southwest University, Southwest University, Chongqing 400716, China

Silk-based biomaterials are featured with excellent mechanical properties, good biocompatibility and biodegradability, which contribute to their potential applications in biomedical field. The current recognition of silk protein materials in structure and function provides a basic theory for the transformation of silk protein into new types of biomaterials. In addition, exogenous sequences encoding new peptide or structural domain can be inserted into the maternal gene sequences encoding silk proteins through genetic engineering technology to synthesize novel silk-based biomaterials with unique functions. This review summarizes the current trend and development perspective of genetically engineered functional silk-based materials for biomedical applications.

silk protein, biomaterials, functionalization, genetic engineering, biomedicine

October 23, 2018;

December 28, 2018

Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. XDJK2018C010).

Zonghui Wu. Tel: +86-23-68253565; E-mail: wuzh@swu.edu.cn

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi) (No. XDJK2018C010) 資助。

2019-01-09

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20190107.1310.003.html

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(本文責(zé)編 陳宏宇)