糯米酒發(fā)酵過程中微生物基因組提取方法比較

趙文婧，燕平梅

(太原師范學院生物系 山西 晉中 030619)

在生活實踐中，功能性微生物的重要來源途徑是傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，在各個方面都表現(xiàn)出重要作用，而被稱之為發(fā)酵食品是通過微生物的作用而制成的一大類產(chǎn)品，在我國不僅歷史悠久，而且更包含著豐富的內(nèi)涵.

隨著分子生物學實驗技術(shù)的日漸發(fā)展，用于提取生物基因組的方法也越來越多，如：物理法中的研磨、高溫、超聲波、顆粒破碎[1].化學方法的SDS法、酶裂解的蛋白酶-K、溶菌酶以及他們之間相互結(jié)合等方法[2].這些方法各自有其優(yōu)缺點，但是，根據(jù)不同的實驗?zāi)康摹⒉煌膶嶒灢牧?，選擇的方法也是不同的.物理方法因破壞力度較大，往往得到的條帶較小，一般為5到10kb[3]；化學法有成本低、效率高等優(yōu)點；酶裂解方法溫和，所以應(yīng)用較為普遍且效果良好的為化學法和酶裂解法[4].

而不同種生物，由于其結(jié)構(gòu)不同，因此提取方法也有所不同，比如提取植物中基因組時因其細胞有細胞壁，提取土壤中微生物時多需要研磨和洗滌，所以經(jīng)常采用物理與化學方法相互結(jié)合的辦法[5-10]；再提取其他種類生物的基因組DNA時也多見物理法與酶裂解法結(jié)合的應(yīng)用.因糯米酒是由谷物發(fā)酵得來，所以不需要研磨，且糯米酒中含有多糖，所以本實驗運用化學法和酶裂解法互相結(jié)合的三種方法，即：溶解酶-SDS-蛋白酶-K法，改良CTAB法和改良CTAB-溶菌酶法，對糯米酒發(fā)酵過程中微生物基因組DNA進行提取.

糯米酒，又稱江米酒、甜酒、水酒、酒釀、醪糟.口味香甜濃郁，以糯米為原材料，通過泡、蒸、拌等工藝，制作成為米白色、黃色或褐紅色、清晰透明的飲品.中國釀造糯米酒歷史悠久，距今已有7 000余年，糯米酒品種繁多，包括：傳統(tǒng)糯米酒、客家糯米酒、黑糯米酒、花色糯米酒等等，且可以在其中添加很多種材料，以求有不同的養(yǎng)生效果.如糯米酒冷喝有助消化的作用，燙熱時飲用能驅(qū)寒祛濕、活血化淤，且其酒精含量小，營養(yǎng)豐富，適合所有人食用，故深受人們喜愛[11].

糯米酒是由多種菌種發(fā)酵谷物所得，經(jīng)實驗探究糯米酒最佳發(fā)酵條件為：0.4%～0.5%酒曲添加量、料水比為5∶3(g∶mL)、28 ℃、培養(yǎng)50 h[12].

為了了解糯米酒發(fā)酵過程中所含微生物的種類，可以運用的辦法分為兩種，一是傳統(tǒng)微生物的培養(yǎng)方法，即：經(jīng)過純培養(yǎng)后，獲得菌株，再對菌種類群的特性進行描述和研究；另一種方法是在分子生物學的基礎(chǔ)上，運用免培養(yǎng)的方法，進行更加深入的研究，克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法中的無法培養(yǎng)自然少量菌種的不足[13-14].所以簡便、高效地提取DNA對于微生物的深入研究有著重要意義.

國內(nèi)對于糯米酒的研究多局限于其釀造工藝的改進和對于新型糯米酒的開發(fā)，而對于糯米酒發(fā)酵過程中微生物基因組的提取研究還很少見[15-20].因而本實驗對這三種提取微生物基因組的方法進行評析、比較，找到其中更加高效、簡便的方法，為后續(xù)糯米酒發(fā)酵過程中微生物類群的鑒定和研究提供堅實的基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯米酒原液 稱取糯米50 g中加入0.2 g酒曲，添加料水比為5∶3(g∶mL)，在28 ℃培養(yǎng)50 h；

PDB培養(yǎng)基；

Sodium-Chloride-Tris-EDTA Buffer(STE緩沖液) 、10% SDS(十二烷基硫酸鈉)、蛋白酶-K(10 mg/L)、TE、50×TAE購于索萊寶生物科技有限公司；

裂解緩沖液：20 mmol/L Tris-Cl (pH=8.0) 10mL，NaCl 0.12 g,0.5 mol/L (w/v) EDTA 400 μL，ddH2O 9.96 mL，121 ℃滅菌20 min，加入200 ng溶菌酶；

Tris-Cl飽和酚、氯仿、異丙醇購于天津市富宇精細化工有限公司；

2×CTAB：2% CTAB (w/v) 、1.4 mol/L NaCl、0.1 mol/L EDTA(pH=8.0)，121℃滅菌20 min；

β-巰基乙醇：北京慶盛達化工技術(shù)有限公司；

Mr：購于天根生化科技(北京)有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

冷凍離心機 Eppendorf；全溫型多振蕩高速軌道搖床(上海智城分析儀器制造有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；電泳儀(北京百晶生物科技)；凝膠成像系統(tǒng)(Alpha ImagerHp)；美國Alpha Inotech 多功能酶標儀；美國Bio Tek PCR儀.

1.3 方法

1.3.1 溶菌酶-SDS-蛋白酶-K法

以常健提取酸粥基因組DNA的方法為基礎(chǔ)[21]，做出如下改進：取糯米酒發(fā)酵液9 mL，4 ℃12 000 r/min離心10 min，棄上清， 去除培養(yǎng)基，得到糯米酒中的菌種；于PDB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)28 ℃培養(yǎng)50 h.設(shè)置三個重復，分別標號為：A1、A2、A3，其余一致.

1.3.2 改良CTAB法

以常健提取酸粥基因組DNA的方法為基礎(chǔ)[21]，做出如下改進：取糯米酒發(fā)酵液9 mL，4 ℃12 000 r/min離心10 min，棄上清， 去除培養(yǎng)基，得到糯米酒中的菌種；于PDB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)28 ℃培養(yǎng)50 h.設(shè)置三個重復，分別標號為：B1、B2、B3，其余一致.

1.3.3 改良CTAB-溶菌酶法

以常健提取酸粥基因組DNA的方法為基礎(chǔ)[21]，做出如下改進：取糯米酒發(fā)酵液9 mL，4 ℃12 000 r/min離心10 min，棄上清， 去除培養(yǎng)基，得到糯米酒中的菌種；于PDB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)28 ℃培養(yǎng)50 h.設(shè)置三個重復，分別標號為：C1、C2、C3，其余一致.

1.3.4 酶標儀測定DNA濃度

取對照液——無菌去離子水2 μL、4 ℃保存DNA樣品TE溶解液各2 μL分別點樣于酶標儀上，測定所提取的微生物基因組DNA的ABS 260nm/280nm值，以及DNA濃度，實驗設(shè)置三個重復，三個數(shù)值取平均值.

1.3.5 瓊脂糖凝膠電泳

取DNA樣品5 μL于0.6 %瓊脂糖凝膠電泳.Mr為 λDNA/HindⅢ，Mr加樣量5 μL.6×Loading Buffer 1 μL，電泳結(jié)果用UV凝膠成像儀進行照膠檢測.

1.3.6 提取DNA樣品體外PCR擴增

細菌16SRNA序列通用引物[22]27F-1541R，27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1541R：AAGGAGGTCATCCAGCCGCA-3’(上海生工生物工程有限公司合成).

DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，PCR mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL,各種試劑加好后緩慢搖勻.

反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃，5 min；變性94 ℃，30 s；退火55 ℃，30 s；延伸72 ℃，90 s；35個循環(huán)；72 ℃，保溫10 min.

1.4 統(tǒng)計學分析

每個實驗方法設(shè)置三次重復，實驗數(shù)據(jù)用SSPS軟件進行分析，Duncan多重比較法[23]進行多個均數(shù)間的差異顯著性比較.

2 結(jié)果與分析

2.1 糯米酒發(fā)酵過程中微生物基因組提取濃度的比較

三種方法均在提取糯米酒微生物基因組的過程中，有同一現(xiàn)象的出現(xiàn)，即水浴時離心管中的樣品液由黏稠狀白色液體逐漸變化為澄清的較為透明的液體.

由圖1可知，用溶菌酶-SDS-蛋白酶-K法(A法)提取的DNA濃度為：411.67±133.29 ng/μL.用改良CTAB法(B法)提取的DNA濃度為：1 436.03±128.0 ng/μL.用改良CTAB-溶菌酶法(C法)所提取的DNA濃度為：1 573.97±711.51 ng/μL.C法所得的基因組DNA濃度最高，B法第二，A法是三種方法中提取濃度最小的.三種基因組提取方法在DNA濃度水平上差異較為顯著.

A法反應(yīng)條件較為溫和，糯米酒又是谷物發(fā)酵所得到的產(chǎn)品，其中微生物的類群比較繁多，要求進行長時間的水浴，所以長時間的裂解有利于提取到濃度更高且更為完整的基因組DNA，所以把裂解時間確定為18 h左右.

B法反應(yīng)強烈，短時間就可以使細胞裂解，較長時間反而可能損害基因組DNA，提取的基因組DNA通過晃動由松散逐漸變得緊密.但是實驗過程會使用到具有毒性和刺激性的β-巰基乙醇，在實驗室操作時注意通風.

C法在B法的基礎(chǔ)之上進行了改良，可以更加快速地裂解細胞，提高提取基因組DNA的效率.

三種方法提取所得的微生物基因組DNA濃度之間存在顯著差異(p<0.05).

圖1 基因組濃度

2.2 糯米酒發(fā)酵過程中微生物基因組提取ABS 260nm/280nm的比較

由圖2可知，A法所提取的DNA樣品ABS 260nm/280nm為：1.82±0.012.B法ABS 260nm/280nm為：1.99±0.07.C法所提取的DNA樣品ABS 260nm/280nm為：1.99±0.12.通過數(shù)值顯示，三種方法之間的差異顯著，且數(shù)值都處于1.8到2.0之內(nèi)，表明三種提取方法都可獲得高純度的DNA，所得樣品中雜質(zhì)RNA和蛋白質(zhì)含量比較少，三種方法提取所得的微生物基因組DNA濃度之間存在一定的顯著差異(p<0.05)，可進行下一步的研究.

圖2 ABS 260nm/280nm

2.3 糯米酒發(fā)酵過程中微生物基因組提取樣品的電泳檢測結(jié)果比較

由圖3可知，本實驗中的三種方法都可以提取到糯米酒發(fā)酵過程中的比較完整的基因組DNA，其大目標條帶大小約為23 kb，條帶清晰.B法和改良C法方法的電泳條帶亮度無肉眼可見的差別；A法電泳條帶亮度最低.三種方法點樣孔中均無蛋白質(zhì)和RNA殘留.

2.4 糯米酒發(fā)酵過程中微生物基因組提取樣品體外擴增PCR結(jié)果的比較

由圖4可知，三種方法提取出的基因組DNA都可直接用于聚合酶鏈式反應(yīng)，并且其產(chǎn)物條帶亮度都很亮，雜帶和目標條帶之間有清晰的分界線.

圖3 三種方法提取的DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖4 三種方法提取的DNA PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

3 結(jié)論

三種方法提取到的DNA濃度分別為：411.67±133.29 ng/μL；1 436.03±128.0 ng/μL；1 573.97±711.51 ng/μL.三種方法提取基因組DNA的ABS260nm/280nm比值分別為：1.82±0.012；1.99±0.07；1.99±0.12.這兩組數(shù)值都表明這三種方法都能夠提取到糯米酒發(fā)酵過程中質(zhì)量較高的基因組DNA.其中改良CTAB-溶菌酶法能夠得到最高含量的基因組DNA，為后續(xù)的實驗奠定了基礎(chǔ)，更加有利于后續(xù)的糯米酒發(fā)酵過程中微生物的類群鑒定和研究.改良CTAB-溶菌酶法，在改良CTAB法的基礎(chǔ)上加入了溶菌酶，但是唯一的缺點是較改良CTAB法消耗了更多的試劑.改良CTAB法提取的DNA濃度較為低，其提取消耗時間短，但是具有一定的毒性，且實驗過程中有刺激性氣味的試劑.溶解酶-SDS-蛋白酶-K法實驗所需條件溫和，刺激性較弱，安全系數(shù)高相比之下更加適宜在室內(nèi)進行實驗室操作，但是所得的基因組DNA濃度卻是三種方法中最低的.綜上所述，改良CTAB-溶菌酶法是糯米酒發(fā)酵過程中微生物基因組的三種提取方法中效果最好、最適合的方法.