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    馬鈴薯Y病毒兩個(gè)黑龍江煙草分離物的全基因組序列分析

    2019-07-10 03:12:32姜瀚林程林發(fā)姜鵬超郭兆奎劉永中李向東
    中國(guó)煙草學(xué)報(bào) 2019年3期
    關(guān)鍵詞:株系核苷酸煙草

    姜瀚林,程林發(fā),姜鵬超,郭兆奎,劉永中,李向東*

    1 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,山東泰安岱宗大街61號(hào) 271018;

    2 山東濰坊煙草有限公司安丘分公司,山東省安丘市擁翠街129號(hào) 262133;

    3 黑龍江省煙草科學(xué)研究所,黑龍江哈爾濱哈藥路17號(hào) 150076

    馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)的代表種,是危害煙草和馬鈴薯等茄科作物的主要病毒。PVY基因組為正義單鏈RNA,全長(zhǎng)約9700核苷酸(nt),5'-端有一個(gè)基因組連接蛋白(viral protein genome- linked,VPg),3'-端有 poly(A)[1]。

    PVY侵染煙草可引起葉片花葉以及沿葉脈壞死等癥狀,造成煙草減產(chǎn)甚至絕收[2],嚴(yán)重危害煙草生產(chǎn)。明確PVY基因組對(duì)鑒定病毒株系,研究其致病機(jī)理和指導(dǎo)檢測(cè)及防治有重大意義。吳元華等依據(jù)生物學(xué)方法將東北地區(qū)PVY分離物進(jìn)行株系劃分;萬(wàn)秀清等[3]通過(guò)多重PCR和系統(tǒng)進(jìn)化分析將黑龍江煙區(qū)PVY分離物劃分株系,但未對(duì)序列進(jìn)行重組分析、選擇壓分析等研究。本文測(cè)定了2個(gè)黑龍江煙草PVY分離物的全基因組序列,并與GenBank中35個(gè)PVY分離物進(jìn)行了一致率、重組、系統(tǒng)發(fā)育和選擇壓力等分析,發(fā)現(xiàn)兩個(gè)分離物均為PVYN-Wi株系,可為黑龍江煙區(qū)PVY檢測(cè)及抗病育種提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    2個(gè)煙草樣品采自黑龍江省哈爾濱市和牡丹江市,分別命名為Harbin和MDJ。大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。植物總RNA提取試劑盒Transzol、DNA凝膠回收試劑盒等均購(gòu)自北京全式金公司;Phusion超保真DNA聚合酶購(gòu)自Thermo公司,M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、pMD18-T克隆載體、LA Taq DNA聚合酶和末端轉(zhuǎn)移酶購(gòu)自TaKaRa公司;Super ScriptTMⅣ反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Invitrogen公司。其他生化試劑及普通化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 引物合成

    使 用 DNAMAN(version7)對(duì) GenBank中 的PVY序列進(jìn)行比對(duì),選擇保守片段進(jìn)行引物設(shè)計(jì),引物由北京華大基因公司合成,序列詳見(jiàn)表1。

    表1 PVY全基因組擴(kuò)增引物Tab.1 Oligonucleotide primers used to amplify the complete genome of PVY

    1.2.2 植物總RNA提取、RT-PCR擴(kuò)增及5′RACE

    使用Transzol試劑盒提取植物總RNA,以O(shè)ligo(DT)15為引物,以M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,分三段擴(kuò)增5′端以外PVY基因組序列。5′端基因組序列由5′RACE獲得,依照Elizabeth等[4]的方法進(jìn)行。

    1.2.3 克隆及序列測(cè)定

    PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后,紫外燈下切取目的膠條(2686bp、3777bp和3054bp)。使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收PCR產(chǎn)物并連接pMD18-T載體,轉(zhuǎn)化Escherichia coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞后,藍(lán)白斑篩選挑取白色單菌落,經(jīng)PCR驗(yàn)證陽(yáng)性后選取3個(gè)克隆送北京華大基因公司測(cè)序。

    式中,平均輸出電壓為30 V,負(fù)載電阻30 Ω,輸出電流為1 A,平均輸入電壓為20 V,則PWM占空比D為0.33,若最小輸入電壓為15 V,變換效率取95%,則滿載時(shí)輸入電流為

    1.2.4 核苷酸序列一致率分析

    測(cè)得序列使用DNASTAR軟件包的Seqman軟件進(jìn)行拼接,通過(guò)CLUSTAL X1.81軟件與GenBank中PVY分離物(表2)序列進(jìn)行比對(duì),使用MegAlign軟件分析2個(gè)分離物全基因組與參比序列在氨基酸和核苷酸水平的一致率。

    1.2.5 重組分析

    比對(duì)后的序列用RDP(version4.95)軟件包進(jìn)行重組分析。通過(guò)軟件包中 RDP、GENECONV、BOOTSCAN、MAXCHI、CHIMAERA、SISCAN 和3Seq 共七種算法進(jìn)行分析。當(dāng)四種以上算法支持重組,且P<1.0×10-6時(shí),可認(rèn)定該分離物存在重組。同時(shí)用Simplot(version3.51)驗(yàn)證重組并繪制重組分析示意圖。

    表2 本文分析用的37個(gè)PVY分離物序列號(hào)及來(lái)源Tab.2 Accession number,host and geographical origin of the 37 PVY isolates analyzed in the paper

    續(xù)表2

    1.2.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

    以馬鈴薯A病毒(PVA)芬蘭分離物(Z21670)為外組,使用MEGA7中 CLUSTAL W模塊比對(duì)表2中37個(gè)PVY分離物的全基因組序列,并采用鄰接法(Neighbor-Joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),重復(fù)1000次并去掉小于50%的分支。

    1.2.7 選擇壓力分析

    使用 MEGA7中 Nei-Gojobri method(Jukes-Cantor)算法,分別計(jì)算各蛋白的dN/dS值。若dN/dS>1,說(shuō)明存在正選擇;若dN/dS=1,說(shuō)明存在中性選擇;若dN/dS<1,說(shuō)明存在負(fù)選擇。

    1.2.8 遺傳分化系數(shù)

    按照寄主來(lái)源將參比序列分為煙草和馬鈴薯兩組,使用DnaSP(version5.10)計(jì)算兩組序列遺傳分化系數(shù)(FST)。若FST=0,則兩種群基因型完全相似;FST<0.33,則兩種群基因交流密切;若FST=1,則兩種群完全隔離。

    2 結(jié)果

    2.1 基因組結(jié)構(gòu)

    分離物Harbin和MDJ基因組RNA全長(zhǎng)均為9699 nt(GenBank登錄號(hào)分別為MH933741和MH933742)。Harbin基因組A、C、G、U的含量為 別 為 31.1%、18.9%、23.4% 和 26.6%,MDJ為31.0%、18.8%、23.5%和26.7%。

    2個(gè)分離物基因組均包含2個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)。ORF1起于186 nt,止于9368 nt,編碼一個(gè)含有3061個(gè)氨基酸的多聚蛋白,該蛋白可被切割為P1、HCPro、P3、6K1、CI、6K2、VPG、NIa、NIb 和 CP 等10個(gè)蛋白。兩個(gè)分離物蛋白酶P1的識(shí)別位點(diǎn)均為Q/G,HC-Pro的識(shí)別位點(diǎn)均為G/G,NIa的識(shí)別位點(diǎn)為Q/R、Q/S、Q/A、Q/G、E/A、Q/A、Q/A。ORF2起于2921 nt,止于3145 nt,由P3的氨基端滑動(dòng)轉(zhuǎn)錄構(gòu)成PIPO。

    2.2 核苷酸和氨基酸一致率

    在核苷酸水平上,Harbin、MDJ與分離物GBVC 26全基因組的一致率最高,三者之間均為98.5%,與美國(guó)分離物MN一致率最低,分別為85.0%和84.8%。在氨基酸水平上,Harbin和MDJ的一致率最高為99.5%。與美國(guó)分離物NC57一致率最低,分別為89.3%和89.2%。在 Harbin和MDJ 編碼的11 個(gè)蛋白中,P1 變異最大,核苷酸一致率分別為71.5%~99.4%和71.7%~98.9%,氨基酸一致率分別為62.0%~99.6%和62.3%~99.6%。核苷酸水平上,CP變異最小,兩分離物與其它分離物的一致率分別為89.7%~99.7%和88.5%~99.7%;氨基酸水平上,CI變異最小,兩分離物與其它分離物的一致率分別為95.5%~100%和95.4%~100%(表3和表4)。

    圖1 PVY分離物Harbin和MDJ基因組結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 The genomic structure of PVY isolates Harbin and MDJ

    表3 Harbin與其他PVY分離物核苷酸/氨基酸的序列一致率Tab.3 Sequence identities(%)between Harbin and other PVY isolates at nucleotide/amino acid levels

    表4 MDJ與其他PVY分離物核苷酸/氨基酸的序列一致率Tab.4 Sequence identities(%)between MDJ and other PVY isolates at nucleotide/amino acid levels

    2.3 重組結(jié)構(gòu)

    經(jīng)RDP軟件分析,7種軟件都證明Harbin和MDJ均為重組分離物(表5)。兩個(gè)分離物均為PVYN株系與PVYO株系分離物的重組體。Harbin分離物主要親本為美國(guó)PVYO株系分離物Oz(1-502 nt;2396-9699 nt),次要親本為瑞士PVYN株系分離物N-605(503- 2395 nt)。MDJ分離物主要親本為美國(guó)PVYO株系分離物CW(1-508 nt;2518 -9699 nt),次要親本同樣為N-605(509-2517 nt)。Harbin分離物基因組有2個(gè)重組位點(diǎn),分別位于P1基因內(nèi)和HC-Pro基因的的3'-端,與PVYN-Wi株系重組類型一致;MDJ分離物基因組也有2個(gè)重組位點(diǎn),分別位于P1基因內(nèi)和P3基因的5'-端。

    表5 分離物Harbin與MDJ重組分析Tab.5 Recombination analysis of isolates Harbin and MDJ

    2.4 系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

    系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示,37個(gè)分離物分為9個(gè)組,分別對(duì)應(yīng)9個(gè)PVY株系類型。其中Harbin和MDJ分離物均屬PVYN-Wi組,同組的還有比利時(shí)分離物GBVC 26和波蘭分離物L(fēng)W。PVYE組的兩個(gè)分離物PYVMON和PVYAGA全部來(lái)自巴西。PVYNTN-NW組由3個(gè)敘利亞分離物和一個(gè)德國(guó)分離物156var。PVYNTN組由Gr99等4個(gè)波蘭分離物組成。PVYN組包含瑞士分離物N-605、中國(guó)分離物Guiyang、美國(guó)分離物Mont和英國(guó)分離物SCRI-N。PVYNA-N/NTN組則由中國(guó)分離物ME162、美國(guó)分離物RRA1、英國(guó)分離物SASA-6和加拿大分離物Tu660組成。PB209等3個(gè)美國(guó)分離物組成PVYN:O組。美國(guó)分離物MN和NC57,意大利分離物NNP,澳大利亞分離物KIP1,法國(guó)分離物Adgen和英國(guó)分離物CRM1組成PVYC組,加拿大分離物RB和O-139,美國(guó)分離物CO1898、Oz和CW以及英國(guó)分離物SCRI-O組成PVYO組。

    圖2 Harbin與MDJ分離物的重組模式示意圖Fig.2 Recombination pattern of isolates Harbin and MDJ

    圖3 Harbin分離物重組分析示意圖Fig.3 Recombination analysis of isolate Harbin

    圖4 MDJ分離物重組分析示意圖Fig.4 Recombination analysis of isolate MDJ

    2.5 選擇壓力

    選擇壓力分析表明,PVY的11個(gè)蛋白的dN/dS值均小于1,說(shuō)明11個(gè)蛋白均存在負(fù)選擇。其中NIa的dN/dS值最小,為0.02776,而PIPO的dN/dS值最大,為0.38013,說(shuō)明在PVY的11個(gè)蛋白中NIa受到的選擇壓最大,而PIPO最小。

    圖5 基于Harbin、MDJ和其他35個(gè)PVY分離物全基因組序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree constructedbased on complete genomic sequences of Harbin,MDJ and other 35 PVY isolates

    表6 PVY各蛋白選擇壓力分析Tab.6 Selection pressure analysis of PVY proteins

    2.6 遺傳分化系數(shù)

    將來(lái)自煙草和馬鈴薯的PVY分別作為一組,利用DnaSP分析遺傳分化系數(shù)。結(jié)果表明,兩組PVY間的FST值為0.04424,小于0.33,說(shuō)明煙草PVY分離物和馬鈴薯PVY分離物間的基因交流非常頻繁。

    3 討論和結(jié)論

    3.1 我國(guó)煙田PVY分布及株系演化

    1950年,陳瑞泰在山東臨朐首次發(fā)現(xiàn)PVY為害煙草[5]。1978-1979年,陳瑞泰等調(diào)查黑龍江、山東、四川、遼寧和吉林5省煙區(qū)病毒病類型,主要病毒種類為TMV和CMV[6],PVY并非主要病害。1983年,韓曉東[7]等報(bào)道PVY廣泛分布與我國(guó)山東、河南、安徽、云南、廣東、遼寧等10個(gè)煙區(qū)。1991年已擴(kuò)大到13個(gè)省區(qū),1996年則擴(kuò)大至16個(gè)省區(qū)[6]。

    吳元華等將東北地區(qū)煙草PVY分離物分為PVYO(普通株系)、PVYN(脈壞死株系)、PVYNS(莖壞死株系)和PVYC(點(diǎn)刻條斑株系)四個(gè)株系,黑龍江地區(qū)以PVYN(脈壞死株系)為優(yōu)勢(shì)株系。王勁波[8]等通過(guò)生物學(xué)方法鑒定山東煙區(qū)分為PVYN(壞死株系)和PVYC(普通株系)兩個(gè)株系,PVYN(壞死株系)為優(yōu)勢(shì)株系。蔡偉[9]等經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和重組分析鑒定山東、貴州、河南三省煙區(qū)PVYNTN-NW為優(yōu)勢(shì)株系。Tian等[10]證明中國(guó)煙草PVY可以分為PVYN、PVYO、PVYNTN、PVYN-Wi和 PVYN-HcO等 五個(gè)株系,其中3個(gè)黑龍江PVY分離物均屬于PVYN-Wi株系。萬(wàn)秀清等[3]將黑龍江煙草PVY分離物劃分為PVYNTN、PVYN、PVYN-Wi和PVYNTN-NW四個(gè)株系。本研究根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化和重組分析結(jié)果證明采集的2個(gè)PVY分離物均屬于PVYN-Wi株系。綜合以上結(jié)果,PVYN-Wi株系是黑龍江煙草PVY的優(yōu)勢(shì)株系。

    3.2 MDJ分離物重組位點(diǎn)分析

    系統(tǒng)發(fā)育分析判定Harbin和MDJ均為PVYN-Wi株系,該株系為重組株系,兩個(gè)重組位點(diǎn)通常位于P1和HC-Pro[11]。經(jīng)重組分析,Harbin分離物重組位點(diǎn)與PVYN-Wi株系株系一致,MDJ分離物的第二個(gè)重組位點(diǎn)則位于P3,為新的重組位點(diǎn)。Hu等[12]曾對(duì)14個(gè)PVYN-Wi株系分離物進(jìn)行重組分析,發(fā)現(xiàn)其中13個(gè)分離物的第二個(gè)重組位點(diǎn)均位于2395-2398nt處,僅分離物261-4(AM113988)第二個(gè)重組位點(diǎn)位于2417 nt處。本文參比序列有4個(gè)PVYN-Wi株系分離物,其中Harbin和LW兩個(gè)分離物的第二個(gè)重組位點(diǎn)均在2395nt,位于HC-Pro 基因3'-末端,與PVYN-Wi株系的重組位置一致。分離物GBVC 26的第二個(gè)重組位點(diǎn)在2408nt,其重組位點(diǎn)位于P3基因[13]。MDJ分離物的第二個(gè)重組位點(diǎn)在2517 nt,比GBVC 26分離物又后移109 nt,兩個(gè)分離物第二個(gè)重組位點(diǎn)均位于P3基因的5'-端。MDJ與Harbin兩分離物序列一致率最高,且有相同的地理和寄主來(lái)源,但在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中,MDJ與Harbin分為兩個(gè)分支(圖5),擁有不同的重組類型(圖2)。像MDJ分離物這種重組位點(diǎn)位于P1基因和P3基因內(nèi),重組區(qū)域包括部分P1基因、整個(gè)HC-Pro基因和部分P3基因的分離物可能是一類特殊的PVYN-Wi株系重組分離物。

    3.3 煙草PVY毒源

    生產(chǎn)上普遍認(rèn)為PVY在馬鈴薯塊莖上越冬,第二年隨蚜蟲(chóng)取食馬鈴薯植株傳播到煙草上[14]。本文將煙草PVY分離物與馬鈴薯PVY分離物分組并計(jì)算遺傳分化系數(shù),證明二者基因交流頻繁,印證了此觀點(diǎn)。杜絕煙草與馬鈴薯間作以避開(kāi)初始毒源,并及時(shí)防蚜治蚜,切斷傳播途徑,是防治煙草PVY行之有效的方法。本研究從PVY的遺傳分化上為該方法提供了理論依據(jù)。

    4 結(jié)論

    本研究測(cè)定了黑龍江煙區(qū)2個(gè)PVY分離物的全基因組序列,進(jìn)行了一致率、重組、系統(tǒng)進(jìn)化和選擇壓分析,主要結(jié)論如下:

    (1)Harbin和MDJ的基因組全長(zhǎng)均為9699核苷酸,均為重組體,且MDJ分離物中存在新的重組位點(diǎn)。

    (2)PVY根據(jù)全基因組序列分為9個(gè)組,其中Harbin和MDJ均屬PVYN-Wi組。

    (3)PVY的11個(gè)基因均處于負(fù)選擇,其中NIa的選擇壓力最大。

    (4)煙草PVY分離物和馬鈴薯PVY分離物基因交流頻繁。

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