富鉀烤煙品種成熟期根系分泌物和根際細菌多樣性特征分析

張小全，闞洪贏，劉冰洋，魏星，胡育瑋

河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院 鄭州文化路95號 450002

根系分泌物在植物與周圍微生物的相互作用中起重要作用。植物根系通過分泌各種次生代謝物質對根際微生物的種類、數(shù)量和分布產(chǎn)生影響,對根際微生物群落結構有選擇塑造作用[1]。根際微生物群落結構變化也對植物根系分泌物釋放、土壤物質循環(huán)、能量流動、信息傳遞有重要的影響,進而影響植物的生長發(fā)育過程[2-3]。

不同物種甚至是同一物種的不同基因型之間根系分泌物和根際微生物的種類和數(shù)量存在著差異[1,3]。在玉米[4-6]、小麥[7]、大麥[8]、牧草[9]等作物上也發(fā)現(xiàn)了根系分泌物和根際微生物在不同基因型間的變化。Chaparro等發(fā)現(xiàn)擬南芥根系分泌物的組分與含量隨生長發(fā)育時期而顯著變化,同時根際微生物群落結構也發(fā)生顯著變化[10]。Gschwendtner等研究發(fā)現(xiàn),不同馬鈴薯基因型之間根際微生物群落差異很大,而且在不同生長發(fā)育時期,馬鈴薯根際微生物群落結構也發(fā)生變化，這可能都與根系分泌物的組成和數(shù)量不同有關[11]。王戈等研究發(fā)現(xiàn)，不同黑脛病抗性烤煙品種不同發(fā)育時期的根系分泌物和根際微生物存在差異，這種差異與品種抗性密切相關[12]。對烤煙鉀吸收利用效率不同的基因型旺長期根系分泌物和根際微生物數(shù)量研究發(fā)現(xiàn)，富鉀品種ND202根系分泌物活化能力強，不同品種根際細菌數(shù)量差異大，烤煙的鉀吸收利用與根系分泌物和根際微生物的差異有關[13-15]。煙草成熟期是決定煙葉鉀含量的關鍵時期，打頂可導致由根系向地上部運輸?shù)拟涬x子減少，根系鉀離子外溢量會顯著增加[16,17]，而成熟期不同鉀吸收利用效率烤煙品種根系分泌物和根際細菌多樣性的差異卻鮮有報道。

本研究選用不同鉀吸收利用效率的烤煙品種為材料，比較了成熟期不同品種根際主要養(yǎng)分含量、根系分泌物和根際細菌多樣性的差異，旨在為進一步研究煙草富鉀品種成熟期高效吸收利用鉀素的機理和富鉀烤煙品種的篩選和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為富鉀烤煙品種ND202、對照品種為K326、NC89。種子由河南農(nóng)業(yè)大學煙草育種實驗室提供。富鉀烤煙品種ND202具有根系發(fā)達、活力強，根系分泌物活化能力強，鉀吸收速高，葉片中的鉀積累量大等特點[13-15]。

1.2 試驗方法

試驗在河南農(nóng)業(yè)大學鄭州科教園區(qū)進行。將種子消毒、浸種，催芽后播于裝有蛭石、珍珠巖、草木灰和適量化肥的塑料格盤內(nèi)育苗，至5 葉1 心時挑選生長健壯、整齊的煙苗進行移栽。

試驗采用盆栽種植（每盆裝25 kg土），供試土壤為土壤肥力一致的壤質潮土，理化性狀為有機質11.50 g/kg，全氮0.85 g/kg，全磷0.11 g/kg，速效鉀120 mg/kg，緩效鉀675 g/kg，pH 7.67。煙苗5 月3日移栽，每個材料種植180株。施用肥料為NH4NO3、NaH2PO4和K2SO4，每盆純氮、磷、鉀元素的施用量分別為3.25g、3.25g、9.75g，分別在移栽時、移栽后第1周、移栽后第2周分3次施入，3次施肥量比例為2∶1∶1。移栽后，使用田間滴灌系統(tǒng)進行水分管理，保持土壤田間持水量在80%左右。煙株第一朵中心花開放50%時，進行打頂，每株留葉數(shù)22片，按優(yōu)質烤煙生產(chǎn)技術進行田間管理。

成熟期根系分泌物的收集：在移栽后85 d（成熟期）各處理分別選3株生長一致代表性煙株，小心將煙株從盆中取出，防止傷及煙株根系。將根系用去離子水沖洗干凈，在2000 mL去離子水中培養(yǎng)，每4 h通氣30 min，24h后加入去離子水至2000 mL，連續(xù)培養(yǎng)2 d，收集剩余液體用去離子水定容至2000 mL，得到根系分泌物樣品。

土壤樣品的獲得：在移栽前2d，隨機取10盆，在表層土壤下20cm處，分別取100g土壤樣品，充分混合后分三份，分別標記為CK 1～3（移栽前：重復I～III）。在移栽后85d（成熟期）每個品種各選6株，分別去掉2cm的表層土壤，輕輕抖動煙株根系外圍土壤，即為非根際土；然后慢慢去除根系周圍較大土塊，用毛刷輕輕從煙株根系表面刷下土壤，即為根際土。根際土和非根際土分別充分混合均勻后分為三份，分別標記為R1 1～3（NC89根際土：重復I～III）、R2 1～3（K326根際土：重復I～III）、R3 1～3（ND202根際土：重復I～3）、NR1 1～3（NC89非根際土：重復I～III）、NR2 1～3（K326非根際土：重復I～III）、NR3 1～3（ND202非根際土：重復I～III）。各土樣用滅菌牛皮紙包好，冰袋保存至實驗室，再從每份土壤樣品中取100g左右，置于滅菌的液氮凍存管中，保存在-80℃冰箱，用于土壤微生物多樣性的檢測，剩余土樣用于土壤主要養(yǎng)分含量測定。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 烤煙根系分泌物的組成與含量測定

參照于會泳的方法[18,19]，將收集的根系分泌物定量過濾，然后用50 mL乙酸乙酯萃取，取有機相，減壓濃縮至0.5 mL（45℃），過0.45 μm濾膜。在濃縮后的樣品中加入0.14mL硅烷化試劑（BSTFA+10%TMCS），加蓋密封后在80℃水浴中衍生2h，待測。將硅烷化處理的樣品用TRACE GC ULTRA-DSQII測定根系分泌物的成分。采用電子轟擊源，轟擊電壓70eV，掃描范圍M/Z 50-650 amu，掃描速度0.2 s掃全程，離子源溫度230 ℃。毛細管柱：HP-5MS UI柱，進樣口溫度250 ℃，柱溫50℃（2 min），以6℃/min程序升溫至250 ℃（保持15 min）。載氣為He，流量1 mL/min，進樣量為1 uL。應用NIST98質譜數(shù)據(jù)庫，分析質譜圖，確定各組分物質名稱,并用歸一法，測定各組分的相對含量。

1.3.2 土壤主要養(yǎng)分含量測定

根際和非根際土壤堿解氮含量的測定采用堿解擴散法，有效磷含量的測定采用鉬銻抗比色法，速效鉀含量的測定采用NH40AC浸提-火焰光度法[20]。

1.3.3 土壤細菌多樣性測定

土壤微生物總DNA提取采用MO BIO公司試劑盒“PowerSoil DNA Isolation Kit"進行，使用1%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000分光光度計來檢測樣品DNA的純度和濃度。

采用帶Barcode 的V3-V4區(qū)域細菌通用引物341（5' - CCTAYGGGRBGCASCAG-3'）and 806R（5' - GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'）擴 增 細 菌16S rRNA 特異片段。PCR產(chǎn)物電泳檢測后使用磁珠純化作為二輪PCR模板，進行二輪PCR擴增和純化，最后進行Qubit 定量。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等量混樣，用Illumina公司的Miseq測序儀測序。

使用Trimmomatic軟件對原始雙端序列進行去雜。再利用FLASH軟件進行拼接。同時，利用usearch檢測并去除序列中的嵌合體序列。測序數(shù)據(jù)進行預處理生成優(yōu)質序列之后，采用UPARSE軟件，按照序列相似度大于或等于97%，將序列歸1個OTU（Operational taxonomic units）。使用QIIME 軟件包挑選出各個OTU 的代表序列并統(tǒng)計每個OTU 中的豐度信息。所有代表序列采用RDP Classifier分別從門和屬水平上進行物種注釋（分類閾值>0.8）[21]。

2 結果與分析

2.1 不同烤煙品種成熟期根系分泌物含量比較

檢測到的3個烤煙品種成熟期根系分泌物主要由酸類、酯類、酚類和醇類等組成（表1）。品種間根系分泌物的主要成分含量有差異，NC89根系分泌物的主要成分是尼古丁、2-甲基丙酸、棕櫚酸、硬脂酸、鄰羥基苯乙酸、鄰苯二酚等，ND202根系分泌物的主要成分是棕櫚酸、硬脂酸、尼古丁、棕櫚油酸、鄰羥基苯乙酸等，K326根系分泌物的主要成分是棕櫚酸、硬脂酸、4-羥基苯乙醇、棕櫚油酸、尼古丁、鄰羥基苯乙酸等。ND202根系分泌有機酸含量占其已檢測出根系分泌物總量的81.80%，比NC89高12.86%，比K326高15.98%。

表1 不同烤煙品種成熟期根系分泌物的組成與相對含量Table 1 Composition and relative content of root exudates of different flue-cured tobacco varieties at mature stage %

2.2 不同烤煙品種成熟期根際主要養(yǎng)分含量比較

成熟期不同烤煙品種根際和非根際土壤主要養(yǎng)分含量見表2。在相同施肥和栽培條件下，成熟期NC89和ND202根際土中的堿解氮和有效磷含量極顯著的低于K326，速效鉀含量3個品種間差異極顯著，ND202根際速效鉀土含量最低。成熟期ND202非根際土中的堿解氮極顯著的高于K326和NC89，有效磷和速效鉀含量3個品種間差異極顯著且均為ND202最高。

表2 成熟期不同烤煙品種根際和非根際土壤主要養(yǎng)分含量比較Table 2 Comparison of main nutrients content between rhizosphere and non-rhizosphere soil for different flue-cured tobacco varieties at mature stage mg/kg

2.3 不同烤煙品種成熟期根際土壤細菌多樣性比較

將來自移栽前土壤、三個品種的根際和非根際土壤的21個樣品細菌測序結果的原始序列過濾掉低質量的序列后，拼接得到有效序列總數(shù)為683 813條，占原始序列數(shù)量的99.5%，各樣品的有效序列數(shù)在10908條到 56144條之間。根據(jù)序列相似度大于或等于97%的原則，共獲得108 451個細菌OTUs，分別屬于41個細菌門，其中優(yōu)勢菌門（相對豐度> 1%）有11個，分別是酸桿菌門（Acidobacteria，36.59%），變形菌門（Proteobacteria，12.21%)，放線菌門（Actinobacteria，15.79%），綠彎菌門（Chloroflexi，10.12%），厚壁菌門（Firmicutes，9.16%)，芽單胞菌門（Gemmatimonadetes，4.18%），TM7（3.25%），硝化螺旋菌門（Nitrospirae，2.26%），擬桿菌門（Bacteroidetes，2.04%），藍 藻（Cyanobacteria，1.22%）和 浮霉菌門（Planctomycetes，1.07%）。

3個烤煙品種成熟期根際和非根際土壤主要細菌在門水平上相對豐度的比較見圖1。與移栽前土壤相比，成熟期根際土壤酸桿菌門、綠彎菌門、TM7、芽單胞菌門、藍藻的相對豐度明顯增加，變形菌門、厚壁菌門、硝化螺旋菌門的相對豐度明顯減少。根際土壤與非根際土壤相比，放線菌門、TM7相對豐度明顯較大，酸桿菌門、擬桿菌門明顯減少。成熟期3個烤煙品種間比較發(fā)現(xiàn)，ND202根際土壤與非根際土壤厚壁菌門、放線菌門豐度相對較高，K326根際土壤TM7、芽單胞菌門相對豐度明顯較大。說明成熟期不同烤煙品種根際土壤細菌在門水平上多樣性發(fā)生了變化，各品種在生長過程中逐漸形成了各自相對獨立的細菌群落。

圖1不同烤煙品種成熟期根際土壤主要細菌在門水平上相對豐度的比較(%)Fig.1 Comparison of the relative abundances of the main bacteria in the rhizosphere soil of different flue-cured tobacco varieties at the phylum level

3個烤煙品種成熟期根際和非根際土壤主要細菌在屬分類水平上，共鑒定出252種細菌，相對豐度>1%的優(yōu)勢屬有18 個（圖2）。移栽前土壤中芽孢桿菌屬（Bacillus）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas）、Kaistobacter屬、Pontibacter屬等四個屬的細菌相對豐度明顯高于成熟期煙株根際和非根際土壤。煙株根際土壤中的鏈霉菌屬（Streptomyces）、倫茨氏菌屬（Lentzea）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、氣微菌屬（Aeromicrobium）等四個屬的細菌的相對豐度高于非根際土壤。

ND202根際土壤中硝化螺菌屬（Nitrospira）、Kaistobacter屬、Steroidobacter屬等三個屬的細菌相對豐度高于非根際土壤，K326根際土壤中紫色非硫細菌屬（Rhodoplanes）和Iamia屬的細菌相對豐度低于非根際土壤，NC89根際土壤中野村菌屬（Nonomuraea）和Pontibacter屬的相對豐度高于非根際土壤。在根際土壤中，芽孢桿菌屬、硝化螺菌屬（Nitrospira）、乳酸乳球屬（Lactococcus）、Steroidobacter屬、Flavisolibacter屬和野村菌屬的相對豐度表現(xiàn)為ND202K326>NC89；在非根際土壤中，硝化螺菌屬、Steroidobacter屬和溶桿菌屬（Lysobacter）的相對豐度表現(xiàn)為ND202K326>NC89。

圖2 不同烤煙品種成熟期根際土壤主要細菌在屬水平上相對豐度的比較(%)Fig.2 Comparison of the relative abundances of the main bacteria in the rhizosphere soil of different flue-cured tobacco varieties at the genus level

3 討論

根系分泌物是植物與土壤進行物質交換和信息傳遞的重要載體，可介導植物對土壤中營養(yǎng)的吸收利用，根系分泌物的種類和數(shù)量受植物種類、基因型、發(fā)育時期、土壤類型、生長環(huán)境等因素的影響[3]。本研究發(fā)現(xiàn)成熟期富鉀品種ND202根系分泌物中有機酸含量較高，根際土壤速效鉀含量較低而非根際速效鉀含量較高。高欣欣等使用水培和砂培的方法對旺長初期烤煙的根系分泌物的分離鑒定發(fā)現(xiàn)，烤煙根系分泌物主要是有機酸類，且品種間有差異[19]。周冀衡等研究發(fā)現(xiàn)不同基因型煙草根系分泌物對礦物鉀均具有活化能力，且不同基因型煙草根系分泌物對不同礦物鉀活化能力具有差異[22]。大量研究表明，根系分泌物中含有的有機酸，可以活化土壤中的礦物鉀，增加植物對鉀的利用。外施有機酸能夠在一定程度上提高根際土壤中有效鉀和煙葉鉀的含量[23,24]。研究發(fā)現(xiàn)ND202根系分泌物對礦物鉀具有較強的活化能力，與其根系分泌物中有機酸含量較高有關[13]。成熟期ND202根際土壤鉀素吸收較多除了與其根系分泌物對礦物鉀具有較強的活化能力，提高根際鉀素供應外，還跟成熟期ND202根系較發(fā)達，鉀離子通道和轉運體基因相對表達量較高等吸收能力較強有關[25]。

植物根系分泌物和根際微生物間可以相互作用和影響。本研究發(fā)現(xiàn)3個烤煙品種成熟期根際和非根際土壤主要細菌在門水平和屬分類水平上相對豐度有較大差異，可能跟成熟期3個品種的根系分泌物差異有關。根系分泌物對某些微生物具有吸引作用，比如豆科植物對根瘤菌的誘導[3]。隨著新一代測序技術的出現(xiàn)，研究宿主基因型對土壤微生物群落組成的影響成為可能。對不同田間環(huán)境中27個玉米自交系的根際細菌多樣性差異研究發(fā)現(xiàn)，基因型效應值較小，但可顯著影響根際細菌多樣性，而且基因型對根際細菌多樣性效應是可遺傳的[5]。有研究發(fā)現(xiàn)水稻中基因型效應可解釋水稻根際微生物組成變化的30%[26]。蔡秋華等以青枯病和黑脛病不同抗性烤煙品種為材料，用平板稀釋計數(shù)法和Biolog技術研究不同抗性品種不同生育期根際微生物群落動態(tài)及功能多樣性的差異，發(fā)現(xiàn)不同抗性品種間根際微生物的群落結構和功能多樣性存在差異，且同一品種因栽培環(huán)境的不同，其根際微生物的群落結構和功能多樣性也有所變化[27]。不同黑脛病抗性烤煙品種微生物數(shù)量及群落多樣性受生長發(fā)育和品種抗性影響，且差異主要表現(xiàn)在烤煙現(xiàn)蕾以前[12]。運用高通量測序技術，本研究也發(fā)現(xiàn)成熟期ND202根際土壤與非根際土壤厚壁菌門、放線菌門豐度相對較高，ND202根際土壤中硝化螺菌屬、Kaistobacter屬、Steroidobacter屬等三個屬的細菌相對豐度高于非根際土壤。不同品種不同發(fā)育時期的根系分泌物含量、根際微生物與根際土壤有效鉀含量間的變化規(guī)律，根際微生物種類變化與根系分泌物種類和含量變化對鉀素的吸收利用的影響等問題，還有待于進一步深入的研究。

4 結論

選用富鉀烤煙品種ND202和常規(guī)品種K326、NC89進行盆栽試驗,對成熟期根際主要養(yǎng)分含量、根系分泌物和根際細菌多樣性的差異分析發(fā)現(xiàn)，成熟期富鉀品種ND202根際土速效鉀含量低于K326和NC89，非根際土速效鉀含量高于K326和NC89，根系分泌物有機酸含量較高。成熟期3個烤煙品種成熟期根際和非根際土壤主要細菌在門水平和屬分類水平上相對豐度有較大差異，ND202根際土壤與非根際土壤中厚壁菌門、放線菌門豐度相對較高，ND202根際土壤中硝化螺菌屬、Kaistobacter屬、Steroidobacter屬等三個屬的細菌相對豐度高于非根際土壤。根際土壤中鏈霉菌屬、氣微菌屬和Iamia屬的相對豐度表現(xiàn)為ND202>K326>NC89，而芽孢桿菌屬、硝化螺菌屬、乳酸乳球屬、Steroidobacter屬、Flavisolibacter屬和野村菌屬的相對豐度則表現(xiàn)為ND202