METTL3在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

黃忠炎 王劍飛 孫金杰 田洋洋

結(jié)直腸癌是目前常見的惡性腫瘤，同時(shí)也是高致死率的惡性疾病之一，嚴(yán)重威脅國民健康。盡管結(jié)直腸癌診治技術(shù)近年來迅速發(fā)展，化療方案不斷更新，但結(jié)直腸癌的長期生存情況仍然較差，研究結(jié)直腸癌診斷、預(yù)后評價(jià)以及與其臨床特征相關(guān)的分子標(biāo)志物仍具有重大意義[1-2]。

N6-甲基腺苷（M6A）是mRNAs和lncRNAs最常見的修飾方式。M6A修飾主要發(fā)生在RACH序列中的腺嘌呤上（R=G或A；H=A、C或U）并參與了RNA的穩(wěn)定性、定位、剪接和翻譯的調(diào)節(jié)[3-5]。M6A可影響多種生物學(xué)過程，包括發(fā)育、免疫、DNA損傷反應(yīng)、腫瘤形成和轉(zhuǎn)移、干細(xì)胞更新、生物節(jié)律、細(xì)胞分化及細(xì)胞周期等[6-7]。M6A的修飾是通過甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3（METTL3）、甲基轉(zhuǎn)移酶樣 14（METTL14）和 Wilms腫瘤相關(guān)蛋白（WTAP）實(shí)現(xiàn)的[8-9]。目前證實(shí)METTL3是促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的重要因素[10]，但對結(jié)直腸癌METTL3是否可作為結(jié)局預(yù)判的指標(biāo)報(bào)道不多，故我們收集67例結(jié)直腸癌患者的病理組織標(biāo)本進(jìn)行研究，觀察METTL3 mRNA和蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況，探討其與患者生存時(shí)間及臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2013年4月至2017年12月在本院接受結(jié)直腸癌根治術(shù)的67例患者作為研究對象，其中男性 29例，女 38例，年齡 18～70（59.03±12.84）歲；瘤徑＜5cm者35例，＞5cm者32例；腫瘤組織分化好者19例，分化差者48例；存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者23例，未轉(zhuǎn)移者44例；存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者39例，未轉(zhuǎn)移者28例；腫瘤侵襲深度達(dá)T1、T2水平共18例，T3、T4水平共49例。收集術(shù)中切除的結(jié)直腸癌組織及配對癌旁正常組織標(biāo)本，以及24例肝轉(zhuǎn)移組織標(biāo)本。所有患者術(shù)前未接受過放化療，組織標(biāo)本的使用取得患者或家屬的知情同意。本研究經(jīng)本院倫理委員會審查通過。本研究所采用的RT-PCR及免疫組化技術(shù)檢測均委托杭州億徠生物科技有限公司進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 METTL3 mRNA 檢測采用RT-PCR技術(shù)。原位腫瘤組織、正常組織及肝轉(zhuǎn)移組織通過液氮碾碎后經(jīng)Trizol法提取RNA。通過TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本寶日醫(yī)生物科技公司產(chǎn)品）合成cDNA，再通過一步法SYBR熒光定量試劑盒（北京全式金生物科技公司產(chǎn)品）于PCR儀（美國羅氏公司產(chǎn)品）進(jìn)行定量檢測和分析。所有定量結(jié)果與GADPH相比較。所有引物購自于杭州億徠生物科技有限公司。引物如下：METTL3 forward，50-TTGTCTCCAACCTTCCGTAGT-3′;METTL3 reverse，50-CCAGATCAGAGAGGTGGTGTAG-3′；GAPDHforward，50-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′；GAPDHreverse，50-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。

1.2.2 METTL3蛋白 檢測采用免疫組化技術(shù)。對獲得的組織進(jìn)行石蠟包埋，同時(shí)切成4μm每張行免疫組化染色，應(yīng)用En Vision法通過自動免疫組化染色機(jī)器（Dako，丹麥）進(jìn)行染色，病理結(jié)果由2位高年資病理科醫(yī)師進(jìn)行判定。鼠抗人METTL3蛋白單克隆抗體為美國Abcam公司產(chǎn)品，En Vsion免疫組化試劑盒為丹麥Dako公司產(chǎn)品。METTL3的染色定位在核上，以細(xì)胞核被染成棕黃色者為陽性細(xì)胞。根據(jù)陽性細(xì)胞百分比評分：0%為0分；1%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；＞75%為4分。染色深度評分：0分為沒有染色；1分為弱染色；2分為中度染色；3分為強(qiáng)染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson法；采用ROC曲線法計(jì)算METTL3 mRNA相對表達(dá)量的截?cái)嘀?。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，計(jì)算METTL3 mRNA高表達(dá)與低表達(dá)患者的生存時(shí)間，并采用log-rank法比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 METTL3 mRNA在正常組織、腫瘤組織及肝轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)情況 見圖1。

圖1 METTL3 mRNA在腫瘤組織及肝轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)情況（*P＜0.05）

由圖1可見，與正常組織比較，METTL3 mRNA在腫瘤組織及肝轉(zhuǎn)移組織中存在高表達(dá)（P＜0.05）。結(jié)直腸腫瘤Ⅰ/Ⅱ期患者中METTL3 mRNA的表達(dá)也是低于Ⅲ/Ⅳ期患者（P＞0.05）。通過ROC曲線計(jì)算得METTL3 mRNA相對表達(dá)量的截?cái)嘀禐?.85。METTL3 mRNA相對表達(dá)量高于2.85視為高表達(dá)，反之視為低表達(dá)。

2.2 METTL3蛋白在正常組織、腫瘤組織及及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)情況 見圖2。

由圖2可見，METTL3蛋白在腫瘤組織中存在明顯的中強(qiáng)染色，在正常組織中存在弱染色，且陽性細(xì)胞比例遠(yuǎn)低于腫瘤組織中。

2.3 METTL3 mRNA的表達(dá)與臨床病理因素的相關(guān)性見表1。

由表1可見，METTL3 mRNA的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在顯著相關(guān)性（P＜0.01），但是其與年齡、性別、腫瘤大小、組織分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及侵襲深度無明顯的相關(guān)性。

圖2 METTL3蛋白在正常組織、腫瘤組織及及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)情況（免疫組化染色，×400）

表1 METTL3mRNA的表達(dá)與臨床病理因素的相關(guān)性[例（%）]

2.4 METTL3 mRNA的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者生存預(yù)后的關(guān)系 見圖3。

由圖3可見，METTL3 mRNA高表達(dá)與低表達(dá)患者的中位生存時(shí)間分別為23個(gè)月與43個(gè)月，在隨訪的4年時(shí)間中METTL3 mRNA低表達(dá)患者的生存率為41.2%，明顯高于METTL3 mRNA高表達(dá)者的24.2%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖3METTL3mRNA高表達(dá)與低表達(dá)患者生存曲線

3 討論

METTL3作為mRNA甲基轉(zhuǎn)移酶，參與mRNA的生成和剪切調(diào)控進(jìn)而促使癌基因的翻譯介導(dǎo)了腫瘤進(jìn)展，并且這種化學(xué)修飾是可逆的，廣泛存在于真核生物體內(nèi)[4]。已有的研究證實(shí)METTL3在人肝細(xì)胞癌（HCC）中表達(dá)上調(diào)并預(yù)測不良預(yù)后，通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)敲除METTL3可在體外抑制肝癌細(xì)胞增殖和遷移，同時(shí)在體內(nèi)抑制肝癌成瘤性和肺轉(zhuǎn)移[11]。然而，在另一項(xiàng)研究中，METTL3被認(rèn)為是腎癌的抑癌基因，抑制腫瘤的增殖、遷移和細(xì)胞周期[12]，這些結(jié)果表明，METTL3可能在不同分化腫瘤中起相反的作用，這可能是由于腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性和腫瘤高度異質(zhì)性所致。同時(shí)這也與METLL3參與腫瘤的作用機(jī)制密不可分。METTL3在腫瘤中的作用機(jī)制可分為兩種模式：M6A依賴性和M6A非依賴性。例如，在肝癌中敲除METTL3可以減少M(fèi)6A甲基化介導(dǎo)的SOC2降解，從而增強(qiáng)SOC2的表達(dá)，從而抑制肝癌的進(jìn)展[11]。相反的，在乳腺癌中METTL3通過M6A修飾增強(qiáng)HBXIP的表達(dá)，從而進(jìn)一步促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展[13]。然后METTL3在結(jié)直腸癌中的作用機(jī)制仍不明顯，需要進(jìn)一步探索。

本研究著眼于METTL3 mRNA在結(jié)直腸癌中的差異表達(dá)出發(fā)，探索其在結(jié)直腸癌中作為癌基因的作用，以及其與結(jié)直腸癌臨床病理之間的關(guān)系。本研究不僅證實(shí)了METTL3 mRNA及蛋白在結(jié)直腸癌標(biāo)本中高表達(dá)，高表達(dá)的患者生存時(shí)間較低表達(dá)患者短，同時(shí)本研究探索出METTL3 mRNA在Cut-off值，為后續(xù)的臨床研究提供方向。本研究的局限是結(jié)果建立在67例樣本之上，需要更大的樣本量來支撐。非常有趣的是，METTL3 mRNA和蛋白的表達(dá)在本研究中與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在顯著性關(guān)系，然而與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移未存在明顯關(guān)系，這可能提示METTL3的作用地位集中在疾病進(jìn)展期間。這也需要大量的后續(xù)研究來證實(shí)。

綜上所述，METTL3 mRNA和蛋白在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，與結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在密切關(guān)系。故而，METTL3可作為預(yù)測結(jié)腸癌分化水平和轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)，為以后治療及藥物研發(fā)提供了重要依據(jù)。關(guān)于METTL3在結(jié)直腸癌的發(fā)生與發(fā)展中的調(diào)控作用及其分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。