左半與右半結(jié)腸癌K-RAS基因及腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞表達(dá)的比較

許洪寶 張貴陽(yáng) 鄭照正 蔡煒龍 汪偉民 樓能

結(jié)直腸癌(colorectal cancer)是世界上第3大常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是導(dǎo)致癌癥死亡的第4大原因[1]。K-RAS基因是目前結(jié)直腸癌研究領(lǐng)域中最受關(guān)注的基因之一，它對(duì)調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)起著樞紐作用。K-RAS基因突變能夠?qū)е录?xì)胞生長(zhǎng)失去調(diào)控，引起腫瘤細(xì)胞快速生長(zhǎng)[2]。因此K-RAS基因是否有突變是影響腫瘤預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）是直接從腫瘤組織中分離出來(lái)的淋巴細(xì)胞，它們能夠識(shí)別腫瘤抗原，直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞溶解，或釋放特定的趨化和促炎細(xì)胞因子[3]。TIL是否大量存在與結(jié)直腸癌患者的臨床預(yù)后密切相關(guān)[4]。這兩項(xiàng)指標(biāo)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后關(guān)系密切，近年已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。由于左半與右半結(jié)腸癌有不同的臨床特征，其K-RAS基因和TIL表達(dá)情況如何，筆者作了進(jìn)一步研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集本院2017年1月至2019年1月手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者315例。根據(jù)病變部位分為兩組，其中左半結(jié)腸癌175例，右半結(jié)癌（包括直腸癌）140例，兩組患者在性別、年齡、淋巴轉(zhuǎn)移狀態(tài)、腫瘤分化程度、病理分期等方面的比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）,見(jiàn)表1。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病理檢查確診為結(jié)直腸癌；（2）未行化療、放療等其他抗腫瘤治療；（3）本人或其家屬簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并有其他惡性腫瘤；（2）合并有嚴(yán)重心肺疾?。唬?）合并有克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎等其他腸道疾病。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 兩組結(jié)腸癌患者一般資料比較[例（%）]

1.2 方法

1.2.1 K-RAS基因突變情況檢測(cè) 采用二代測(cè)序技術(shù)，按照說(shuō)明書(shū)步驟在組織標(biāo)本中提取各組DNA，應(yīng)用高通量基因測(cè)序儀檢測(cè)結(jié)直腸癌K-RAS基因突變狀態(tài)，依次構(gòu)建文庫(kù)、基因測(cè)序和數(shù)據(jù)分析。具體步驟如下：根據(jù)測(cè)序需要，將提取的DNA構(gòu)建文庫(kù)；根據(jù)擴(kuò)增片段，加用測(cè)序接頭，進(jìn)行文庫(kù)的擴(kuò)增。然后應(yīng)用測(cè)量?jī)x檢測(cè)DNA濃度。根據(jù)樣本的測(cè)序需求混合樣本，繼續(xù)檢測(cè)取得的混合樣本中DNA的濃度，稀釋制備模板。在測(cè)序完成后進(jìn)行拼接、過(guò)濾，舍棄低質(zhì)量序列及雜合序列，獲得用于分析的優(yōu)質(zhì)序列，最后在基因測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 TIL（CD3＋、CD4＋T淋巴細(xì)胞）表達(dá)水平檢測(cè) （1）先通過(guò)固定、浸泡、脫蠟方式處理組織切片；（2）用PBS液沖洗3次以上，然后將切片置于加熱后的檸檬酸緩沖液中；（3）約15min后取出切片，待冷卻后再次用緩沖液沖洗；（4）切片加一抗處理，置于冰箱內(nèi)以4℃保存約24h，取出后再次進(jìn)行沖洗；（5）切片加二抗處理，室溫下孵育約10min，再用緩沖液沖洗；（6）PBS液洗膜，DAB顯色處理，顯微鏡觀察染色結(jié)果。染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)色為0分，淺黃色為1分,黃色為2分，深黃色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分：≤5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分,51%～75%為3分，＞75%為4分。最終的結(jié)果為染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分的乘積：＜3分為陰性（-），3～4 分為弱陽(yáng)性（+），4～5分為中等陽(yáng)性（++），＞6分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組K-RAS基因突變情況比較 對(duì)左半結(jié)腸癌與右半結(jié)腸癌K-RAS基因突變情況檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)左半結(jié)腸癌K-RAS基因野生型比例高于右半結(jié)腸癌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.27，P＜0.05），見(jiàn)表 2。

表2 兩組K-RAS基因突變情況的比較[例（%）]

2.2 兩組TIL表達(dá)情況的比較 免疫組化染色法檢測(cè)CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞陰性及陽(yáng)性表達(dá)情況見(jiàn)圖1。對(duì)左、右半結(jié)腸癌TIL表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)左半結(jié)腸癌CD3+、CD4+比例均高于右半結(jié)腸癌，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見(jiàn)表 3。

圖 1 免疫組化染色結(jié)果[a～c：陰性對(duì)照；d～i：陽(yáng)性對(duì)照；d：CD3（+）；e：CD3（++）；f:CD3（+++）；g：CD4（+）；h：CD4（++）；i：CD4（+++）；免疫組化染色，×400]

2.3 兩組肝、肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率的比較 對(duì)左半結(jié)腸癌與右半結(jié)腸癌肝、肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)右半結(jié)腸癌肝、肺轉(zhuǎn)移比例均高于左半結(jié)腸癌，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見(jiàn)表 4。

表3 兩組CD3+、CD4+表達(dá)情況的比較[例（%）]

表4 兩組肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率的比較[例（%）]

3 討論

結(jié)直腸癌早期診斷困難，許多患者就診時(shí)已發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，5年生存率低，是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率都極高的惡性腫瘤[5-7]。隨著人們對(duì)結(jié)直腸癌信號(hào)通路與分子分型研究的深入，發(fā)現(xiàn)K-RAS通路對(duì)結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展起重要作用[8]。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究表明，K-RAS基因野生型控制著細(xì)胞生長(zhǎng)路徑的調(diào)控，K-RAS基因突變可能與結(jié)直腸癌病變部位有關(guān)，且通常右半結(jié)腸癌發(fā)病率高于左半結(jié)腸癌，但與其他臨床病理特征無(wú)關(guān)[9-10]，本研究結(jié)果與此一致。K-RAS作為RAS基因中的一員，突變頻繁，檢出率可達(dá)40%，K-RAS基因突變會(huì)直接影響抗腫瘤藥物的療效，從而影響腫瘤患者的預(yù)后[11]。

在結(jié)直腸癌中，免疫反應(yīng)和TIL分析已被作為腫瘤分類的手段和預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中存在 TIL，大多數(shù)研究表明，CD3+、CD8+、PTPRC+或FOXP3+T淋巴細(xì)胞密度越高，臨床療效越好（能表現(xiàn)出較強(qiáng)的免疫應(yīng)答）[12]。在Kwak等[13]的研究中，證實(shí)腫瘤組織中TIL不僅存在數(shù)量上的差異，而且與腫瘤部位關(guān)系密切，本研究結(jié)果也與此一致，即CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞比例左半結(jié)腸癌高于右半結(jié)腸癌。CD4+作為輔助T淋巴細(xì)胞的主要表面標(biāo)志物，是免疫腫瘤細(xì)胞死亡的主要介質(zhì)，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的表達(dá)，對(duì)腫瘤進(jìn)展起保護(hù)作用[14]。在一些強(qiáng)調(diào)CD4+細(xì)胞可能通過(guò)Th1機(jī)制介導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌抗腫瘤免疫中CD4+T淋巴細(xì)胞發(fā)揮不可或缺的作用。近年來(lái)多項(xiàng)研究表明，CD4+T淋巴細(xì)胞不僅可以提高CD8+T淋巴細(xì)胞的療效，而且還具有單獨(dú)消除腫瘤細(xì)胞的作用。

左、右半結(jié)腸癌具有不同的生物學(xué)和臨床特征，在Salem等[15]的研究中發(fā)現(xiàn)，與左半結(jié)腸癌相比，右半結(jié)腸癌具有頻繁的EGFR通路異?；顒?dòng)和突變風(fēng)險(xiǎn)。一項(xiàng)關(guān)于結(jié)腸癌生存周期的研究表明，右半結(jié)腸癌的預(yù)后比左半結(jié)腸癌差[16]。Baldus等[17]研究表明，Kras基因突變的結(jié)直腸癌患者，出現(xiàn)遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的發(fā)生概率更高。Testa等[18]研究證實(shí)，結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移與K-RAS基因突變和Tp53基因突變相關(guān)。

探討左、右半結(jié)腸癌K-RAS基因及TIL表達(dá)情況，可以為結(jié)直腸癌患者療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估提供臨床檢測(cè)指標(biāo)，同時(shí)充分考慮左、右半結(jié)腸癌臨床表現(xiàn)特征，為患者提供個(gè)體化診療方案，減少不必要的醫(yī)療費(fèi)用。本研究從K-RAS基因突變類型和TIL表達(dá)水平層面探討了左、右半結(jié)腸癌的差異，由于存在樣本量相對(duì)較小、未進(jìn)行多中心研究的不足，其最終結(jié)論有待于進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，從多個(gè)醫(yī)院采集病例，進(jìn)行多中心研究來(lái)加以驗(yàn)證。