益氣解毒化瘀小復(fù)方及其單味藥對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖及凋亡影響的研究

王圣治， 陳思敏， 劉英楠， 鄭艷

腎小球硬化是各種原因?qū)е履I小球損傷及病理性改變的最終結(jié)局，系膜細(xì)胞過(guò)度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的合成增多是腎小球硬化的主要病理特征；在多種腎臟疾病的發(fā)展中，進(jìn)行性的系膜細(xì)胞凋亡也是導(dǎo)致腎小球硬化進(jìn)展的重要原因之一。在抗腎小球硬化研究方面，目前中醫(yī)藥在該領(lǐng)域研究具有一定優(yōu)勢(shì)及特點(diǎn)，仍然主要集中于抑制系膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的積聚，促進(jìn)系膜細(xì)胞凋亡方面[1]。本研究旨在探討益氣解毒化瘀消瘀方(黃芪、丹參、白花蛇舌草)及其單藥組對(duì)大鼠系膜增生和凋亡的影響，并且提供理論和方法依據(jù)，為進(jìn)一步研究中醫(yī)藥防止腎小球硬化奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)買自沈陽(yáng)藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處[許可證號(hào)：SYXK(軍)2007-004]。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基干粉(美國(guó)GIBCO產(chǎn)品)；MTT(欣博盛生物科技有限公司)；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(美國(guó)Sigma公司)；AnnexinV-FITC(欣博盛生物科技有限公司)；血管緊張素Ⅱ(美國(guó)Sigma公司)；大鼠腎小球系膜細(xì)胞(武漢博士德生物工程有限公司，編號(hào)：HBZY-1，CX0130)。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 中藥飲片黃芪、丹參、白花蛇舌草由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供；西藥替米沙坦(德國(guó)勃林格殷格翰國(guó)際公司)。

1.4 方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)藥物及含藥血清制備 將各組中藥飲片水煎煮并濃縮成相應(yīng)濃度，濃度分別為黃芪0.7 g/mL，丹參0.25 g/mL，白花蛇舌草水煎0.3 g/mL，小復(fù)方組(黃芪、丹參、白花蛇舌草)1.25 g/mL，西藥替米沙坦加入蒸餾水配成濃度為0.6 g/L；60只Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、小復(fù)方組、黃芪組、丹參組、白花蛇舌草組、替米沙坦組，每組10只；正常對(duì)照組每日灌服蒸餾水4 mL，各藥物組分別早晚各一次灌服藥液2 mL，連續(xù)3 d，第3天灌胃后1 h腹主動(dòng)脈采血，采血后離心取得血清，于56 ℃水浴30 min，用無(wú)菌濾器進(jìn)行過(guò)濾，之后凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 大鼠腎小球系膜細(xì)胞培養(yǎng) 腎小球系膜細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于5%CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液1次，當(dāng)系膜細(xì)胞長(zhǎng)至貼壁80%～90%時(shí)，磷酸鹽緩沖液洗2次，25 mg/L胰蛋白酶消化、傳代。

1.4.3 隨機(jī)分組系膜細(xì)胞 將培養(yǎng)后的腎小球系膜細(xì)胞隨機(jī)分為：正常對(duì)照組加入血管緊張素Ⅱ 1×10-6mol/L+正常大鼠血清DMEM液；小復(fù)方組加入血管緊張素Ⅱ 1×10-6mol/L+10%濃度小復(fù)方組大鼠血清的DMEM液；黃芪組加入血管緊張素Ⅱ 1×10-6mol/L+10%濃度黃芪組大鼠血清的DMEM液；丹參組加入血管緊張素Ⅱ 1×10-6mol/L+10%濃度丹參組大鼠血清的DMEM液；白花蛇舌草組加入血管緊張素Ⅱ 1×10-6mol/L+10%濃度白花蛇舌草組大鼠血清的DMEM液；替米沙坦組血管緊張素Ⅱ 1×10-6mol/L+10%濃度替米沙坦組大鼠血清的DMEM液；血管緊張素Ⅱ組分別加入血管緊張素Ⅱ 1×10-6mol/L+10%濃度胎牛血清的DMEM液。

1.4.4 系膜細(xì)胞增殖檢測(cè) 采用MTT比色法，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的大鼠腎小球系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)種于96孔板，每組隨機(jī)設(shè)6個(gè)復(fù)孔，待培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁，換成無(wú)血清DMEM液，使細(xì)胞同步于G0/G1期培養(yǎng)24 h，然后分別加入含10%正常大鼠血清和10%含藥血清，每孔200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)液，分別于培養(yǎng)結(jié)束前6小時(shí)加入MTT 20 μL/孔。培養(yǎng)結(jié)束后，移去MTT溶液，然后每孔加入150 μL二甲亞砜，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)吸光度值A(chǔ)(570 nm處)，測(cè)定各組對(duì)大鼠系膜細(xì)胞增殖的抑制作用。

1.4.5 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 大鼠腎小球系膜細(xì)胞以1×105/mL濃度接種于培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞分組分別加入含10%正常及含藥大鼠血清，用800 μL含1%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞，加入碘化丙啶溶液100 μL和RNA酶A 100 μL，37 ℃孵育30 min，固定的樣品過(guò)濾后上流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡。

2 結(jié)果

2.1 各組對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖結(jié)果 見(jiàn)表1。

表1 各組對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響

注：與正常對(duì)照組比較，aP<0.01；與血管緊張素Ⅱ組比較，bP<0.05；與小復(fù)方組比較，cP<0.05。

表1結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，血管緊張素Ⅱ組能促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞增殖水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示系膜細(xì)胞增殖模型建立成功。與血管緊張素Ⅱ組比較，各藥物組對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖均有抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；各藥物組與小復(fù)方組比較，小復(fù)方組抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖作用最顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或0.05)；其余各組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。藥物血清在作用24、48 h之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明藥物抑制大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖作用不隨時(shí)間的延長(zhǎng)而有顯著性變化。

2.2 碘化丙啶單染流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析大鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡率 見(jiàn)表2。

表2 各組對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡率的影響

注：與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；與血管緊張素Ⅱ組比較，bP<0.05；與小復(fù)方組比較，cP<0.05。

表2結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，血管緊張素Ⅱ組能降低腎小球系膜細(xì)胞凋亡率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與血管緊張素Ⅱ組比較，各藥物組均能夠增加系膜細(xì)胞凋亡率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各藥物組與小復(fù)方組比較，小復(fù)方組抑制腎小球系膜細(xì)胞凋亡作用最顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或0.05)；其余各組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

系膜細(xì)胞是腎小球最活躍的固有細(xì)胞，除具有單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能，還具有分泌細(xì)胞外基質(zhì)、產(chǎn)生細(xì)胞因子(即系膜細(xì)胞的自分泌作用)等功能，因免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、高血壓等因素可刺激系膜細(xì)胞的增殖，而引起細(xì)胞外基質(zhì)合成增多、成分異常，隨病變進(jìn)展繼而引起或加重腎小球硬化，最終可導(dǎo)致終末期腎病[2-4]。正常生理?xiàng)l件下，腎小球系膜細(xì)胞的自我更新和凋亡是同時(shí)存在的，且隨著研究的進(jìn)展，人們意識(shí)到腎小球系膜細(xì)胞凋亡有正面作用及其負(fù)面作用[5-6]：系膜細(xì)胞異常增殖參與了諸多腎小球疾病的發(fā)生發(fā)展，通常會(huì)以白細(xì)胞浸潤(rùn)和系膜細(xì)胞增殖為特征，細(xì)胞凋亡可清除浸潤(rùn)的白細(xì)胞、過(guò)度增殖的系膜細(xì)胞及去除腎纖維化治愈后的成纖維細(xì)胞，這時(shí)的細(xì)胞凋亡有益于腎組織的重塑與腎小球結(jié)構(gòu)與功能的恢復(fù)；然而在多種腎臟疾病如中毒性腎病、腎小球腎炎、梗阻性腎病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，系膜細(xì)胞的凋亡使得大量細(xì)胞被清除，而致腎小球基底膜裸露及足細(xì)胞丟失、進(jìn)行性的系膜細(xì)胞丟失導(dǎo)致腎小球硬化，缺乏細(xì)胞再生導(dǎo)致腎小管萎縮，這時(shí)發(fā)生的細(xì)胞凋亡則是腎小球硬化和腎功能損傷的加重因素。換言之，腎小球腎炎的特征性病理特征是炎癥性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞外基質(zhì)積聚和腎小球系膜細(xì)胞增殖，均導(dǎo)致腎小球硬化和瘢痕形成；由于腎小球系膜細(xì)胞擴(kuò)張可以預(yù)示腎小球瘢痕形成，因此系膜細(xì)胞的自我更新可能是重要的。在某些形式的腎小球損傷中，腎小球系膜細(xì)胞增殖消退，腎小球結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)正常。在系膜增生性腎小球腎炎中，系膜細(xì)胞凋亡是系膜細(xì)胞過(guò)度消退的主要修復(fù)機(jī)制[7-8]。細(xì)胞凋亡也是進(jìn)行性新月體腎小球腎炎中愈合和瘢痕形成的特征[9]。這些研究表明細(xì)胞凋亡在腎小球炎癥和愈合過(guò)程中很重要，但其失調(diào)可能導(dǎo)致瘢痕形成和進(jìn)展為腎小球硬化。例如，在諸如IgA和狼瘡性腎炎的腎小球疾病中，細(xì)胞耗竭是通過(guò)細(xì)胞凋亡，其隨后發(fā)展為硬化[10]。增殖和凋亡之間的平衡可能是損傷期間和之后腎小球重塑的重要機(jī)制。因此，抑制系膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的積聚，促進(jìn)系膜細(xì)胞凋亡，操縱這些途徑可以限制腎小球瘢痕形成，緩解腎小球硬化，保護(hù)腎臟功能方面起著重要的作用。

前期研究結(jié)果顯示，小復(fù)方對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1基因表達(dá)具有明顯的抑制作用，并抑制腎小球系膜細(xì)胞基質(zhì)中合成和分泌纖維蛋白、Ⅳ膠原，增加細(xì)胞外基質(zhì)降解，以有效的預(yù)防腎小球硬化[11]。最近研究結(jié)果表明，黃芪注射液對(duì)腎間質(zhì)纖維化有明顯改善，黃芪含藥血清可減少細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成部分Ⅳ型膠原的生成，降低表達(dá)人類系膜細(xì)胞表面CD4 mRNA[12]；黃芪含藥血清可通過(guò)下調(diào)核因子кB、基質(zhì)金屬蛋白酶-2、Fas/Fas L mRNA表達(dá)水平的作用機(jī)制，達(dá)到抑制大鼠系膜細(xì)胞增生的目的[13]；黃芪總皂苷能抑制高糖誘導(dǎo)下系膜細(xì)胞的過(guò)度增殖[14]。許多促炎性細(xì)胞因子參與了細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)，丹參可以通過(guò)干擾促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生以抑制系膜細(xì)胞增殖[15]；丹參注射液可以降低系膜細(xì)胞中纖溶酶原激活物抑制物-1 mRNA基本表達(dá)及蛋白分泌，下調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1分泌，提高活性氧簇水平，從而抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解，延緩腎小球硬化[16]。有研究表明，白花蛇舌草抑制血管緊張素刺激的系膜細(xì)胞外基質(zhì)纖維蛋白mRNA、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1mRNA表達(dá)及纖維蛋白的合成，從而發(fā)揮抗腎小球纖維化的作用[17]。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)最佳小復(fù)方與其單味中藥的比較，以確定其抗腎小球硬化的作用機(jī)制，并明確最優(yōu)藥物。本實(shí)驗(yàn)將各藥物組干預(yù)后的大鼠腎小球系膜細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，并選用血管緊張素Ⅱ?qū)δI小球系膜細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)性增殖后觀察各組腎小球系膜細(xì)胞增殖及凋亡情況，從而對(duì)小復(fù)方(黃芪、丹參、白花蛇舌草)、其組成的單味藥及西藥替米沙坦各組進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)研究；結(jié)果表明小復(fù)方(黃芪、丹參、白花蛇舌草)組抑制大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖及促進(jìn)系膜細(xì)胞凋亡作用最強(qiáng)，與各單味藥組及替米沙坦比較有明顯差異性。說(shuō)明了中藥復(fù)方在減緩腎小球系膜細(xì)胞增殖及促系膜細(xì)胞凋亡方面具有多途徑、多靶點(diǎn)治療的優(yōu)勢(shì)。本研究結(jié)果表明，黃芪、丹參、白花蛇舌草以及益氣解毒化瘀小復(fù)方均可以抑制由血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖，其中小復(fù)方的效果最佳，其單味藥組療效無(wú)明顯差異；說(shuō)明益氣解毒化瘀在抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖具有優(yōu)勢(shì)。