高溫脅迫對德爾卑沙門氏菌抗逆性的影響

翟立公 杜傳來 楊 晴 陳 晨 王俊穎

(安徽科技學(xué)院，安徽 滁州 233100)

在世界范圍內(nèi)，每年由沙門氏菌引起的食物中毒事件達(dá)到8 030萬件，造成15.5萬人死亡[1]；在中國，細(xì)菌性食物中毒事件中，70%～80%是由沙門氏菌引起的[1-3]。沙門氏菌感染人體后潛伏期短，發(fā)病突然，能引起感染者的腹瀉、發(fā)熱等癥狀，嚴(yán)重者會引起菌血癥[4]。沙門氏菌致病主要是通過食源性感染引起的，全球沙門氏菌病病例中有85.6%是食源性感染[5]。沙門氏菌包括2 600多個血清型，但污染食品的血清型主要集中在腸炎沙門氏菌亞種中的部分血清型[6]。德爾卑沙門氏菌(SalmonellaDerby)在中國的豬肉、雞肉類食品中檢出率較高[7-8]。食品在加工過程中，不同脅迫條件的復(fù)合作用，有助于提高食源性致病菌的抵抗能力，降低殺菌效果，將引起重要的食品安全問題[9]。Fong等[10]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)沙門氏菌經(jīng)過亞致死(45 ℃、3 min)處理后，其耐熱性明顯提高。有研究[10-12]表明，熱適應(yīng)性沙門氏菌對UV輻射的抗性增加；當(dāng)沙門氏菌處于干燥環(huán)境下，其高溫的耐受性也會相應(yīng)增強(qiáng)。經(jīng)過亞致死高溫脅迫能改變沙門氏菌毒性基因的表達(dá)，提高宿主細(xì)胞的被感染率[13]。

在食品加工及貯藏過程中，沙門氏菌會受到多種脅迫因子的交叉協(xié)同作用，造成其對環(huán)境耐受性的改變。研究[14]發(fā)現(xiàn)，酸適應(yīng)性沙門氏菌當(dāng)遇到低溫、高溫、高滲等環(huán)境下，其存活率顯著高于非適應(yīng)性菌，但對NaClO等消毒劑卻更為敏感。在食品加工過程中，加熱處理是最常用的一種滅菌手段，可有效消除食品及加工器具上的食源性致病菌，防止致病菌的傳播。當(dāng)加工過程中加熱溫度及時間未達(dá)到滅菌要求時，會造成污染的沙門氏菌處于亞致死狀態(tài)，促使其開啟熱脅迫應(yīng)答機(jī)制維持其正常的生命活動，從而提高其對高溫脅迫的耐受性[15]。然而，在食品加工過程中沙門氏菌常處于多種脅迫因子的共同作用。因此，針對高溫耐受沙門氏菌對其他脅迫因子交叉抗性的研究將變得非常重要。本試驗擬以德爾卑沙門氏菌(SD)為對象，主要研究沙門氏菌經(jīng)高溫脅迫后，對其他環(huán)境脅迫因子的耐受性影響，為食品加工業(yè)針對高溫耐受沙門氏菌選擇合適滅菌、保藏技術(shù)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

德爾卑沙門氏菌(S. Derby)：中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心(CMCC50719)。

檸檬酸、NaClO：分析純，上海麥克林生化科技有限公司；

乙酸、NaCl、30%過氧化氫、乙醇(95%)：分析純，上海麥克林生化科技有限公司；

LB培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；

胰蛋白酶大豆蛋白胨培養(yǎng)基(TSB)：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

二級生物安全柜：BSC-1100ⅡA2-X型，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；

臺式恒溫培養(yǎng)箱：THZ-92A型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；

智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱：LHP-160型，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 德爾卑沙門氏菌高溫耐受株馴化 德爾卑沙門氏菌(CMCC50719)經(jīng)LB液體培養(yǎng)基活化后，劃線培養(yǎng)，挑取單菌落，轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基，43 ℃、180 r/min培養(yǎng)36 h，再接到LB固體培養(yǎng)基，43 ℃培養(yǎng)，如此反復(fù)進(jìn)行多輪馴化。將馴化獲得的高溫耐受菌株和對照菌株分別接入LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)10 h，平板菌落計數(shù)法獲得以上菌株的初始濃度。同時，各取1 mL培養(yǎng)液，10 000 r/min離心1 min，棄上清，分別加入1 mL無菌生理鹽水，重懸。將兩管菌液置于55 ℃，處理20，25，30 min，用無菌生理鹽水10倍梯度稀釋，取適宜稀釋度平板菌落計數(shù)。按式(1)計算存活率，評價德爾卑沙門氏菌高溫耐受株的耐受性[14]。

存活率=(處理后菌落數(shù)對數(shù)值/處理前菌落數(shù)對數(shù)值)×100%。

(1)

1.3.2 高溫耐受穩(wěn)定性分析 將德爾卑沙門氏菌高溫耐受菌株連續(xù)培養(yǎng)10代，經(jīng)55 ℃水浴，處理30 min，測定高溫耐受菌株和對照菌株的存活率。

1.3.3 高溫耐受SD菌株環(huán)境脅迫抗性分析 高溫耐受菌株和對照菌株，分別經(jīng)LB液體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)，取1 mL 菌液離心，棄上清，根據(jù)以下方法處理，測定高溫耐受SD的環(huán)境脅迫性分析。酸脅迫：用檸檬酸或乙酸分別將生理鹽水的pH調(diào)整到2.4，3.0，各取1 mL加入，重懸菌體(處理30 min)；堿脅迫：用NaOH將生理鹽水的pH調(diào)整至10，11，12，各取1 mL加入，重懸菌體(處理30 min)；乙醇脅迫：配置60%，65%，70%的乙醇溶液，各取1 mL加入，重懸菌體(處理3 min)；過氧化氫脅迫：將30% H2O2與無菌水配置成25，75，125 mmol/L的溶液，各取1 mL，重懸菌體(處理30 min)；次氯酸脅迫：用無菌水分別配置0.1%，0.5%，1.0%NaClO溶液，各取1 mL，重懸菌體(處理15 min)；低溫脅迫：用1 mL生理鹽水重懸菌體后，置于-20 ℃冰箱冷凍處理22 d。以上菌體經(jīng)過環(huán)境脅迫處理后，10 000 r/min離心1 min，棄上清液，加入1 mL生理鹽水重懸，利用平板菌落計算法對脅迫前后菌落計數(shù)，計算脅迫后菌體存活率。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 每組試驗設(shè)3次重復(fù)，利用SPSS 19.0和Origin 7.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫耐受SD菌株馴化及高溫耐受穩(wěn)定性

SD經(jīng)長時間43 ℃馴化培養(yǎng)，獲得的菌株，在55 ℃脅迫條件下的存活率如圖1所示。當(dāng)脅迫時間僅為20 min 時，高溫耐受菌株的存活率達(dá)到61.9%，而對照菌株的存活率僅達(dá)到41.19%，差異顯著；當(dāng)脅迫時間增加到25 min后，高溫耐受菌株的存活率也顯著高于對照菌株；但隨著脅迫時間的延長，馴化菌株的存活率略高于對照菌株。表明經(jīng)高溫馴化后，對高溫脅迫的耐受性具有脅迫時間的相關(guān)性，隨著脅迫時間延長，耐受性降低。

*表示差異顯著(P<0.05)

Figure 1 Survival rate of high temperature SD resistant strain and control strain at 55 ℃ for different treatment time

高溫耐受菌株和對照菌株分別經(jīng)10次傳代后，在55 ℃ 脅迫條件下，高溫耐受菌株的存活率為47.3%仍高于非耐受菌株的38.73%，該結(jié)果表明，馴化后的菌株仍保持較好的高溫耐受性。

2.2 高溫耐受SD菌株酸脅迫抗性

利用檸檬酸或乙酸配置pH 3.0，2.4的無菌生理鹽水溶液，重懸高溫耐受菌株和非高溫耐受菌株，室溫放置30 min，存活率結(jié)果見圖2。當(dāng)菌體處于檸檬酸配置的pH 3.0脅迫條件下，高溫耐受菌株和非高溫耐受菌株的存活率均最高，但馴化后菌株的存活率(97.79%)仍高于未被馴化的菌株(85.91%)。當(dāng)處于pH 3.0環(huán)境下，檸檬酸處理后的高溫耐受菌株和對照菌株的存活率要高于乙酸處理后的高溫耐受菌株和對照菌株，表明在此條件下乙酸對SD的殺菌效果更好。當(dāng)菌株處于pH 2.4脅迫條件下，檸檬酸處理的高溫耐受菌株的存活率略高于非高溫耐受菌株的存活率；乙酸處理后，非高溫耐受菌株完全滅活，高溫耐受菌株的存活率達(dá)到46.7%，具有顯著性。以上結(jié)果表明，SD的高溫耐受性增強(qiáng)，同時也提高了對酸環(huán)境脅迫的抗性。但有研究[16]結(jié)果顯示，當(dāng)沙門氏菌長期處于低酸環(huán)境，反而降低沙門氏菌對高溫的耐受性。

2.3 高溫耐受SD菌株堿脅迫抗性

如圖3所示，當(dāng)沙門氏菌處于低堿環(huán)境下，高溫耐受菌株和對照菌株的存活率均較高；在pH 10脅迫條件下，對照菌株(91.02%)的存活率僅高于高溫耐受菌株(86.21%)存活率4.81%，差異不顯著；在pH 11脅迫條件下，高溫耐受菌株和對照菌株存活率相差7.16%，與pH 10 脅迫條件的結(jié)果相似。當(dāng)SD處于pH 12時，對照菌株的存活率下降明顯達(dá)到33.83%，而高溫耐受菌株甚至全部死亡。該結(jié)果表明，高溫耐受SD對堿環(huán)境較為敏感，其抗性較差，可以采取堿處理方式提高對高溫耐受SD的滅菌效果。

*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著

Figure 2 Survival rate of high temperature resistant SD strain and non-high temperature resistant strain at acid stress

圖3 高溫耐受SD菌株和非高溫耐受菌株在堿脅迫的存活率

Figure 3 Survival rate of high temperature resistant SD strain and non-high temperature resistant strain at alkaline stress

2.4 高溫耐受SD菌株乙醇脅迫抗性

在相同脅迫時間下，乙醇濃度從60%增加到65%時，對照菌株和高溫耐受菌株的存活率均大幅下降，對照菌株和高溫耐受菌株的存活率分別下降了47.03%，39.66%。當(dāng)60%乙醇脅迫時，對照菌株的存活率(82.93%)是高溫菌株存活率(66.04%)的1.26倍，差異顯著；當(dāng)65%的乙醇溶液短時處理后，對照菌株的存活率(35.90%)是高溫耐受菌株存活率(26.38%)的1.36倍，差異顯著。但當(dāng)處于65%，70%乙醇濃度時，高溫耐受菌株存活率變化較小。本研究發(fā)現(xiàn)，高溫耐受SD對乙醇的敏感度更大，且隨著乙醇濃度的升高，其消毒效果也更加明顯。但有研究[17]表明，沙門氏菌經(jīng)低濃度的酒精(5%)脅迫，有助于提高腸炎沙門氏菌的酒精耐受性，但對55 ℃高溫脅迫影響較小。當(dāng)微生物的脅迫順序發(fā)生改變，將直接影響沙門氏菌的耐受性。

*表示差異顯著(P<0.05)

Figure 4 Survival rate of high temperature resistant SD strain and non-high temperature resistant strain at ethanol stress

2.5 高溫耐受SD菌株過氧化氫脅迫抗性

過氧化氫利用活性氧的氧化能力，破壞原生質(zhì)體，實現(xiàn)對微生物消毒滅菌的目的，多用作食品及加工器械的消毒劑[18]。如圖5所示，隨著環(huán)境中H2O2濃度的提高，高溫耐受菌株的存活率影響不大，基本穩(wěn)定在90%左右；但對對照菌株的存活率影響較大，當(dāng)H2O2濃度從75 mmol/L 提升到125 mmol/L時，對照菌株的存活率下降了27.76%。以上結(jié)果表明，高溫脅迫有助于提高SD對H2O2氧化脅迫的耐受性，降低H2O2對SD的消毒滅菌效果。劉佳玫等[14]發(fā)現(xiàn)酸適應(yīng)性海德爾堡沙門氏菌對H2O2的耐受性增強(qiáng)。

**表示差異極顯著(P<0.01)

Figure 5 Survival rate of high temperature resistant SD strain and non-high temperature resistant strain at H2O2stress

2.6 高溫耐受SD菌株次氯酸鈉脅迫抗性

選用0.1%，0.5%，1.0%的次氯酸鈉溶液對高溫耐受菌株脅迫處理，結(jié)果見圖6。在不同濃度NaClO溶液處理30 min，高溫耐受菌株的存活率低于對照菌株。該結(jié)果表明，經(jīng)高溫耐受性處理后SD對NaClO的敏感性增加，增加了高溫耐受菌株的死亡速率。有研究[19]發(fā)現(xiàn)，酸適應(yīng)性鼠傷寒沙門氏對NaClO脅迫條件的敏感性也有顯著提高。通過高溫和酸處理，有助于提高NaClO對SD的滅菌效果。

2.7 高溫耐受SD菌株冷凍脅迫抗性

-20 ℃冷凍保藏是食品冷藏，延長貨架期常用的一種食品保藏手段。將SD高溫耐受菌株和對照菌株放置-20 ℃冰箱冷凍保藏2～22 d，測定兩種菌株的存活率，結(jié)果見圖7。當(dāng)冷凍2 d時，對照菌株存活率(65.86%)下降明顯，相比于高溫耐受菌株的存活率(89.7%)下降了23.83%，差異極顯著；隨著冷凍時間延長到13 d，對照菌株存活率基本保持穩(wěn)定，但延長到22 d時，對照菌株的存活率下降到46.22%。在相同時間的冷凍脅迫下，高溫耐受菌株的存活率均高于對照菌株的存活率。該結(jié)果表明，未經(jīng)過高溫處理的SD對冷凍脅迫較為敏感，高溫脅迫能夠增加SD對低溫冷凍環(huán)境的抗性。

圖6 高溫耐受SD菌株和非高溫耐受菌株在NaClO脅迫的存活率

Figure 6 Survival rate of high temperature resistant SD strain and non-high temperature resistant strain at NaClO stress

*表示差異顯著(P<0.05)

Figure 7 Survival rate of high temperature resistant SD strain and non-high temperature resistant strain at low temperature stress

3 結(jié)論

沙門氏菌的最適生長溫度在37 ℃，本研究在43 ℃條件下進(jìn)行傳代培養(yǎng)，經(jīng)過多輪馴化后發(fā)現(xiàn)該菌株在55 ℃ 處理下的存活率明顯高于對照菌株。因此，在實際生產(chǎn)過程中，為達(dá)到消毒滅菌的效果，應(yīng)采取足夠的溫度和時間進(jìn)行處理。

當(dāng)沙門氏菌暴露在壓力環(huán)境下能產(chǎn)生對其他脅迫條件的聯(lián)合耐受性[20-21]。本試驗揭示了高溫耐受菌株對其他食品加工、貯藏等脅迫環(huán)境下的存活狀態(tài)，當(dāng)沙門氏菌經(jīng)過高溫馴化后，對低酸、低溫和H2O2等脅迫條件具有較好的耐受性，但對乙醇、堿和NaClO等環(huán)境的耐受性降低。沙門氏菌經(jīng)高溫脅迫后，啟動自身的熱脅迫抗性調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，能夠維持細(xì)胞正常的生命活動，但對其他環(huán)境脅迫的耐受性表現(xiàn)存在較大差異。因此，對熱抗性的調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步的深入研究。