糖尿病斑馬魚模型的建立與南極磷蝦酶解物降血糖活性評價

吉 薇 章超樺 宋 采

(1. 廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣東 廣州 510303；2. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088；3. 圣彼得堡州立大學(xué)生物精神學(xué)實驗室，俄羅斯 圣彼得堡 191036)

糖尿病是一種嚴(yán)重威脅人類健康和生命的代謝性疾病。目前治療糖尿病的藥物主要是人工合成的藥物，有一定的毒副作用[1-2]。研究[3]表明，食物源的DPP-IV抑制肽不僅具有良好的降血糖效果，而且無毒副作用。南極磷蝦蘊藏量巨大，潛在資源蘊量約6.0×108t。蛋白質(zhì)含量高，單只蝦的蛋白含量約為70.58%(干基)，含有人體所需的全部必需氨基酸和一些具有生物活性的特殊氨基酸序列，是制備生物活性肽的良好資源[4]。DPP-IV抑制肽能直接抑制DPP-IV活性，降低GLP-1和GIP的降解速率，從而起到降血糖作用[5]。前期研究[6]證明，南極磷蝦酶解物(AKEH)具有抑制DPP-IV的活性。

生物活性肽的體內(nèi)活性評價主要采用動物模型來實現(xiàn)。以哺乳動物(大鼠、小鼠)為動物模型較為常見[7-8]，這種模型雖然試驗動物個體大，試驗穩(wěn)定性較好，但也有一定的缺點，如試驗周期長，通常需要2～3個月，受試樣品量大，動物發(fā)病后性情狂躁兇險等。斑馬魚具有體積小、與人類基因相似度高、建模周期短，受試物少等優(yōu)點[9]，作為建立糖尿病[10]、心血管疾病[11]、脂肪肝[12]、腎病[13]等模型的模式生物顯示了非常大的潛力。

以斑馬魚為模式動物，建立糖尿病斑馬魚模型，已有相關(guān)報道。Gleeson等[14]采用2%的葡萄糖溶液浸泡的方式誘導(dǎo)斑馬魚產(chǎn)生2型糖尿病，但方法的誘導(dǎo)周期較長(28 d)。Capiotti等[15]采用0.111 mol/L葡萄糖溶液浸泡14 d的方法建立了斑馬魚的高血糖模型，誘導(dǎo)周期相對較短，但模型不穩(wěn)定，而且葡萄糖濃度較高，容易造成斑馬魚死亡。Olsen等[16]通過腹腔注射鏈脲佐菌素方式來誘導(dǎo)斑馬魚持續(xù)高血糖，但是斑馬魚個體小，不易操作。王澤民[17]16采用3%葡萄糖浸泡和高脂食物喂養(yǎng)10 d 的方式建立高糖高脂模型，短時間攝入高糖高脂，容易造成斑馬魚的死亡。本研究采用聯(lián)合葡萄糖溶液浸泡和膽固醇喂養(yǎng)的方法，建立糖尿病斑馬魚模型，并用該模型對3 000～100 Da AKEH的體內(nèi)降血糖效果進(jìn)行評價，旨在為尋求一種高產(chǎn)的具有降血糖功效的食品原料，同時也為南極磷蝦資源的開發(fā)利用提供一定的指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成年野生型(AB)藍(lán)斑馬魚：購自湛江民享水族店；

膽固醇：純度99%，阿拉丁試劑公司；

葡萄糖：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

Trizol試劑、PCR試驗的相關(guān)耗材：廣州齊云生物有限公司；

PrimeScriptTMRT Master Mix (RR036A)試劑盒、SYBER?Premix Ex TaqTMⅡ(RR820A)試劑盒：廣州瑞真生物技術(shù)有限公司；

DPPIV/CD26試劑盒：欣博盛生物科技有限公司；

蛋白質(zhì)試劑盒、膽固醇試劑盒、甘油三酯試劑盒：南京建成生物工程研究所；

葡萄糖試劑盒：蘇州科銘生物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

增力電動攪拌機：JB50-D型，上海精科儀器有限公司；

電子天平：BSA224S-CW型，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；

水族氣泵：APE-960型，廣東閩江水族實業(yè)有限公司；

高速組織研磨器：OSE-Y30型，天根生化科技有限公司；

核酸定量儀：SimpliNano型，美國GE公司；

PCR儀：SC300型，澳大利亞Kyratec公司；

熒光定量PCR：CFX型，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；

離心機：Allegra X-30R型，貝克曼庫爾特有限公司；

離心機：MLX-210迷你型，美國精騏有限公司。

1.3 南極磷蝦酶解物的制備

南極磷蝦原料與水等質(zhì)量混合，添加動物蛋白水解酶237.6 U/g原料，調(diào)節(jié)pH值到7.6，45 ℃酶解3.8 h。根據(jù)張迪等[18]得到的南極磷蝦酶解液脫氟工藝條件，在南極磷蝦酶解液中加入21.5 mg/mL醋酸鈣，用10 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH到10，30 ℃反應(yīng)140 min，4 000 r/min離心10 min得濾液備用。將濾液用200 nm孔徑無機陶瓷膜進(jìn)行分離。收集透過液依次通過3 000，100 Da的超濾膜，得到3 000～100 Da的超濾組分。冷凍干燥，備用。

1.4 糖尿病斑馬魚建模方法

1.4.1 斑馬魚的準(zhǔn)備 提前3 d將自來水，用水過濾器過濾到儲物箱，保持水溫在(27±1) ℃。pH為7.0～7.4，通氧7.20 mg O2/L，晝夜循環(huán)為14 h光照/10 h避光[14]。將大小接近的黑色活潑斑馬魚連同原來的水緩慢地一起倒入預(yù)先準(zhǔn)備好的過濾水中，前2 d禁食。第3天，斑馬魚對環(huán)境不緊張從容游動時，開始喂養(yǎng)，每天每條喂食0.003 g。喂養(yǎng)2 d即可開始后續(xù)試驗。

1.4.2 斑馬魚飲食與喂養(yǎng) 糖尿病的主要特征是高糖高脂。高糖主要采用20 g/L的葡萄糖浸泡實現(xiàn)；高脂的實現(xiàn)是靠飼料中添加10 g/100 g的膽固醇喂養(yǎng)[17]16。隨機將斑馬魚分為試驗組(n=30)和對照組(n=30)，每日投喂飼料2次(上午9點，下午6點)，每次0.003 g。試驗組每天用葡萄糖水浸泡，投喂添加膽固醇的飼料；對照組每天用系統(tǒng)水浸泡，投喂添加正常飼料；持續(xù)投喂20 d。每天換1次水。

1.5 3 000～100 Da AKEH的喂養(yǎng)

DPP-IV抑制肽的高劑量濃度是根據(jù)糖尿病斑馬魚浸泡10 min，頭部無紅色充血現(xiàn)象為依據(jù)，確定為5.40 g/L，中、低劑量組濃度的確定是在高劑量組的基礎(chǔ)上成倍降低，確定中劑量組為2.70 g/L，低劑量組為1.35 g/L。隨機將斑馬魚分成10組，每組40條。通氧7.20 mg O2/L，恒溫(27±1) ℃，每條魚每日正常飼料喂養(yǎng)0.003 g，清水飼養(yǎng)，每日上午10點，使用3 000～100 Da AKEH溶液浸泡糖尿病斑馬魚5 min，持續(xù)浸泡15 d。

1.6 指標(biāo)評價方法

1.6.1 理化指標(biāo)檢測 斑馬魚放入冰水混合液中，1 min后取出超純水清洗2次，取斑馬魚去除頭部放入1.5 mL離心管中，加入相應(yīng)緩沖液用組織研磨器將其勻漿。DPP-IV按照試劑盒說明測定；蛋白質(zhì)采用BCA法測定；葡糖糖、甘油三酯(GPO-PAP酶法)、膽固醇(COD-PAP法)測定結(jié)果根據(jù)蛋白質(zhì)含量推算。

1.6.2 實時定量PCR 根據(jù)理化指標(biāo)檢測前處理方法，在勻漿的魚肉中加入TRIzol 裂解液，根據(jù)說明，提取RNA。使用Prime ScriptTMRT Master Mix (RR036A)試劑盒，按說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；使用SYBER?Premix Ex TaqTMⅡ(RR820A)試劑盒，在冰上，按說明配制PCR反應(yīng)液，包括正向和反向引物(表1)。依次加入到PCR反應(yīng)的八連管中并混合，采用CFX熒光定量PCR儀檢測。兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。第一步：預(yù)變性95 ℃，30 s；第二步：39個循環(huán)(變性95 ℃ 5 s，60 ℃退火30 s，65 ℃延伸30 s)。

表1 基因檢測引物列表?

?β-actin，Insa，Glucagon根據(jù)文獻(xiàn)[17]20設(shè)計，Pck1由生工生物有限公司設(shè)計，4個基因都由生工生物有限公司合成。

1.7 數(shù)據(jù)分析

每組試驗平行重復(fù)3次，基因表達(dá)水平計算采用CT法(2)[19]，結(jié)果以(X±SD)表示，采用Excel 2013及SPSS 19.0(單因素ANOVA顯著性分析)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用Origin 8.5進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高糖高脂處理對斑馬魚理化指標(biāo)的影響

由于斑馬魚體積較小，無法采集血液樣本，直接將魚體勻漿測定。用于糖尿病斑馬魚模型評價的理化指標(biāo)主要有DPP-IV活性、葡萄糖、膽固醇和甘油三酯。DPP-IV抑制劑可以阻斷DPP-IV酶發(fā)揮作用，使血糖保持正常水平，所以監(jiān)測DPP-IV的活性，可以反映DPP-IV抑制劑的效果[20]。在糖尿病斑馬魚模型建立試驗中，DPP-IV活性測定結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出，未處理的斑馬魚，DPP-IV活性為43.56%。通過聯(lián)合葡萄糖浸泡和膽固醇喂養(yǎng)方法飼養(yǎng)了20 d的斑馬魚，DPP-IV活性達(dá)到98.67%，斑馬魚DPP-IV活性增加了1倍多，說明通過聯(lián)合葡萄糖和膽固醇飼養(yǎng)的方法可使DPP-IV活性增加，可側(cè)面反映血糖升高。

字母不同表示差異性顯著(P<0.05)

雖然魚體的葡萄糖、膽固醇和甘油三酯的水平與血液中的葡萄糖、膽固醇和甘油三酯的定量關(guān)系有待建立，但也可從側(cè)面反映血糖的高低。圖2中，試驗組葡萄糖、甘油三酯及膽固醇含量分別為對照組的2.68，2.80，3.50倍，表明葡萄糖和膽固醇聯(lián)合處理的方法能使斑馬魚出現(xiàn)高糖高脂的特征。Olsen等[16]根據(jù)斑馬魚體重，對其腹腔進(jìn)行0.3%的STZ注射處理(350 mg/kg)，每日1次，持續(xù)3周，結(jié)果表明，該方法能使斑馬魚空腹血糖值升高，非酶的糖化血清蛋白含量增加，胰島素含量降低。王澤民[17]16-24采用3%的葡萄糖浸泡，10%的膽固醇雞蛋喂養(yǎng)的方法，持續(xù)飼養(yǎng)10 d，根據(jù)胰島素、胰高血糖素、葡萄糖、甘油三酯和膽固醇為指標(biāo)，進(jìn)行評價，相比空白組，試驗組都有顯著性差異，建立了糖尿病斑馬魚模型。本研究結(jié)果與這些研究結(jié)果相一致，證明糖尿病斑馬魚模型建模成功。

字母不同表示差異性顯著(P<0.05)

2.2 高糖高脂處理對斑馬魚血糖相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

胰島素和胰高血糖素是人體血糖調(diào)控的一對重要激素。胰島素基因有Insa、Insb兩種類型。Insa基因的主要功能是控制葡萄糖的調(diào)節(jié)；Insb在生長發(fā)育中起到重要作用[21]。因此本研究考察斑馬魚Insa基因的表達(dá)水平。胰高血糖素通過腺苷酸環(huán)化酶來提高cAMP的水平，這樣能夠使磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK, phosphoenolpyruvate carboxykinase)的水平也相對提高。PEPCK有Pck1和Pck2兩種，Pck1主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，Pck2主要存在于線粒體。Pck1是一種裂解酶，能限制糖質(zhì)新生反應(yīng)進(jìn)程，阻礙葡萄糖類化合物的合成[10]。利用實時定量PCR檢測了高糖高脂處理后的斑馬魚對Insa、Glucagon和Pck1基因的表達(dá)水平。從圖3中可以看出，Insa基因的表達(dá)量較低，相比未處理的斑馬魚Insa基因表達(dá)量降低了50%左右。Capiotti等[15]采用0.111 mol/L 葡萄糖溶液浸泡14 d的方法誘導(dǎo)斑馬魚，結(jié)果表明眼部糖化蛋白增加，胰島素mRNA水平也比處理前有所降低。撤去葡萄糖溶液后，斑馬魚的葡萄糖水平低于0.111 mol/L葡萄糖浸泡的斑馬魚，高于空白對照組。Glucagon基因和Pck1基因的表達(dá)量分別是原來的6.0，4.5倍。說明經(jīng)過了葡萄糖和膽固醇處理組斑馬魚的血糖含量相比未處理的斑馬魚血糖含量是上升的。

圖3 糖尿病斑馬魚模型的基因表達(dá)相對水平圖

考慮到本方法后續(xù)斑馬魚需要撤去葡萄糖溶液的環(huán)境，參考Gleeson等[14]14 d建立糖尿病斑馬魚模型的方法并對模型的穩(wěn)定性進(jìn)行了初步探究。本研究的建模時間在此基礎(chǔ)上延長了6 d，更加保證了糖尿病斑馬魚模型的穩(wěn)定性。綜合理化指標(biāo)和基因指標(biāo)，采用20 g/L葡萄糖溶液浸泡和10%膽固醇喂養(yǎng)20 d的方法，能夠建造糖尿病斑馬魚模型。

2.3 南極磷蝦3 000～100 Da 酶解組分對糖尿病斑馬魚理化指標(biāo)的影響

前期研究[5]得出南極磷蝦酶解物具有DPP-IV抑制活性，其中3 000～100 Da的酶解組分對DPP-IV的抑制活性最高。在本研究中，以南極磷蝦3 000～100 Da的酶解組分為材料，采用建立的糖尿病斑馬魚模型中來評價其降血糖效果，糖尿病斑馬魚經(jīng)過15 d的南極磷蝦3 000～100 Da 酶解組分浸泡后，對其DPP-IV活性和理化指標(biāo)進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖4、5。從圖4中可以看出，與陰性對照組相比，DPP-IV活性都有所降低，但都比陽性對照的DPP-IV含量高，中、低劑量組的DPP-IV活性無顯著性差異，而高劑量組的DPP-IV活性有顯著性降低，達(dá)到80.47%，降低了18.22%。結(jié)果表明，3 000～100 Da AKEH對糖尿病斑馬魚的DPP-IV具有一定抑制作用。

經(jīng)3 000～100 Da AKEH浸泡后，糖尿病斑馬魚的葡萄糖、膽固醇和甘油三酯的含量如圖5所示。從圖5中可以看出，與陰性對照組相比，隨著AKEH濃度的增加，各指標(biāo)含量整體呈下降趨勢。其中低劑量組的葡萄糖、甘油三酯、膽固醇含量與陰性對照組無顯著性差異，中劑量組中，葡萄糖含量與陰性對照組有顯著性差異，甘油三酯和膽固醇和陰性對照組無顯著性差異。說明3 000～100 Da AKEH用低濃度浸泡糖尿病斑馬魚，降血糖功效不明顯。而高劑量組葡萄糖、甘油三酯和膽固醇含量相比陰性對照組都有顯著性降低，說明降血糖效果顯著。綜合理化指標(biāo)，3 000～100 Da的高劑量組AKEH改善糖尿病斑馬魚的高血糖癥狀明顯。研究結(jié)果與劉雪峰等[22]研究的杏仁多肽對糖尿病大鼠的降血糖活性結(jié)果相一致。

1. 陰性對照 2. 陽性對照(0.130 7 g/L 西格列汀) 3. 1.35 g/L 4. 2.70 g/L 5. 5.40 g/L

字母不同表示差異性顯著(P<0.05)

圖4 糖尿病斑馬魚3 000～100 Da AKEH處理15 d后DPP-IV活性測定

Figure 4 DPP-IV activity determination of diabetic zebrafish treated with 3 000～100 Da AKEH after 15 days

1. 陰性對照 2. 陽性對照(0.130 7 g/L 西格列汀) 3. 1.35 g/L 4. 2.70 g/L 5. 5.40 g/L

字母不同表示差異性顯著(P<0.05)

圖5 糖尿病斑馬魚經(jīng)3 000～100 Da AKEH浸泡15 d后的理化指標(biāo)

Figure 5 Physicochemical indexes of diabetic zebrafish treated with 3 000～100 Da AKEH after 15 days

2.4 南極磷蝦3 000～100 Da酶解組分對糖尿病斑馬魚血糖相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

糖尿病斑馬魚經(jīng)3 000～100 Da AKEH浸泡15 d后Insa、Glucagon和Pck1 3個基因的實時定量PCR的結(jié)果如圖6所示。糖尿病患者體內(nèi)的胰島素含量一般是維持在一個較低的水平。從圖6(a)中可以看出，陰性對照的糖尿病斑馬魚組的Insa基因的表達(dá)量較低，隨著AKEH濃度的增加，Insa基因的表達(dá)量都有不同程度的增加，其中，中、低劑量組相比陰性對照無顯著性差異。高劑量組相比陰性對照有顯著性差異，表達(dá)水平是處理前的1.563倍。胰高血糖素與胰島素是相互拮抗的一對調(diào)節(jié)血糖的激素，因此Glucagon基因表達(dá)量越高，說明體內(nèi)血糖越低，降血糖效果越好。從圖6(b)中可以看出，隨著AKEH濃度的增加，Glucagon基因的表達(dá)降低，Glucagon基因的表達(dá)量與3 000～100 Da AKEH濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。其中，相比陰性對照，中、低濃度的Glucagon基因表達(dá)無顯著性差異；高濃度的Glucagon基因表達(dá)顯著降低。PEPCK能限制糖質(zhì)新生反應(yīng)進(jìn)程，阻礙葡萄糖的合成，所以葡萄糖含量越低，說明PEPCK含量越高，Pck1基因的mRNA表達(dá)量也越高Pck1基因與AKEH濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[圖6(c)]。高濃度的3 000～100 Da AKEH處理后Pck1基因的表達(dá)水平是處理前的0.664倍。綜合基因指標(biāo)說明，低濃度的3 000～100 Da AKEH降血糖效果不明顯，高濃度的3 000～100 Da AKEH具有較好的降血糖效果。Huang 等[19]采用風(fēng)味酶酶解豬皮凝膠，將具有較強DPP-IV抑制活性的<1 kDa超濾組分進(jìn)行大鼠動物試驗，用<1 kDa 超濾組分以每天300 mg對糖尿病大鼠進(jìn)行灌胃處理，飼養(yǎng)42 d后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測，血漿DPP-IV活性顯示，試驗組的DPP-IV活性(63.3%)與空白組的DPP-IV活性(112.4%)有顯著性差異；試驗組的血漿GLP-1水平也比未處理組有顯著提高；胰島素水平在DPP-IV抑制肽的作用下，能提升到2 mg/L；血漿胰高血糖素水平相比空白組，也有顯著性降低。說明DPP-IV抑制肽能夠提高GLP-1和胰島素含量；能降低DPP-IV活性、胰高血糖素含量。

1. 陰性對照 2. 陽性對照(0.130 7 g/L 西格列汀) 3. 1.35 g/L 4. 2.70 g/L 5. 5.40 g/L

字母不同表示差異性顯著(P<0.05)

圖6 糖尿病斑馬魚經(jīng)3 000～100 Da AKEH浸泡15 d后基因的相對表達(dá)

Figure 6 Relative Glucagon gene expression of diabetic zebrafish treated with 3 000～100 Da AKEH after 15 days

3 結(jié)論

通過聯(lián)合20 g/L葡萄糖溶液浸泡和10%膽固醇喂養(yǎng)20 d的方法，快速建立了糖尿病斑馬魚模型，通過理化指標(biāo)和基因表達(dá)水平的測定驗證了該模型可靠性強。應(yīng)用建立的糖尿病斑馬魚模型對3 000～100 Da AKEH的降血糖功效進(jìn)行了評價，通過對糖尿病斑馬魚理化指標(biāo)與血糖水平相關(guān)基因的水平檢測，證實了高劑量(5.40 g/L)的3 000～100 Da AKEH具有一定的降血糖功效，表明了南極磷蝦酶解物開發(fā)為降血糖產(chǎn)品原料的潛力，對于促進(jìn)南極磷蝦資源的開發(fā)利用具有重要意義。但AKEH如何在體內(nèi)消化吸收和代謝，以及DPP-IV抑制肽的降血糖機制有待進(jìn)一步的研究。