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    鴨坦布蘇病毒的研究進(jìn)展

    2019-07-08 22:15:19任斌斌于可響黃兵
    家禽科學(xué) 2019年4期
    關(guān)鍵詞:研究進(jìn)展

    任斌斌 于可響 黃兵

    摘? 要:鴨坦布蘇病毒病是由坦布蘇病毒(Tembusu virus,TMUV)引起的一種以產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋量下降和雛鴨或育成鴨出現(xiàn)神經(jīng)癥狀為主要特征的傳染性疾病。2010年在我國(guó)江浙地區(qū)首先暴發(fā),隨后迅速波全國(guó)主要養(yǎng)鴨省份,給我國(guó)的養(yǎng)鴨業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。本文主要從生物學(xué)特征、傳播途徑、流行病學(xué)、臨床癥狀、診斷等方面闡述該病毒的最新研究進(jìn)展,為其相關(guān)研究提供參考。

    關(guān)鍵詞:鴨坦布蘇病毒;暴發(fā);研究進(jìn)展

    中圖分類(lèi)號(hào):S858.325.3? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A? ? ?文章編號(hào):1673-1085(2019)04-0055-05

    自2010年4月以來(lái),在我國(guó)主要養(yǎng)鴨地區(qū),爆發(fā)了一種新型急性傳染病,該病傳播迅速,可造成產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋量嚴(yán)重下降,肉鴨或育成鴨出現(xiàn)神經(jīng)癥狀等。由于產(chǎn)蛋鴨感染后,其特征性病變主要表現(xiàn)為卵泡膜出血,該疾病最初被命名為鴨出血性卵巢炎(DHO)。進(jìn)一步研究證明,該病是由一種新型黃病毒——坦布蘇病毒(TMUV)引起的[1]。

    1? 生物學(xué)特征

    1.1? 分類(lèi)學(xué)地位? 2012年,國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)公布的分類(lèi)結(jié)果表明,坦布蘇病毒歸屬于黃病毒科(Flaviviridae)、黃病毒屬(genus Flavivirus),是蚊媒病毒類(lèi)成員。黃病毒屬有病毒70余種,包含登革熱病毒(Dengue virus,DENV)、日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)、黃熱病毒(Yellow fever virus,YFV)、西尼羅河病毒(West Nile virus,WNV)等多種常見(jiàn)病毒[2]。

    1.2? 形態(tài)結(jié)構(gòu)? 坦布蘇病毒粒子的大小直徑為40~50nm[3],大小為10.9kb[4]。電鏡下呈小球形,為對(duì)稱(chēng)的十二面體,表面有鑲嵌糖蛋白的脂質(zhì)包膜,病毒包膜內(nèi)含有核衣殼蛋白,病毒核酸為單股正鏈RNA[5]。

    1.3? 理化特性和培養(yǎng)特性? 坦布蘇病毒為有囊膜的單股RNA病毒,可被氯仿滅活,對(duì)去氧膽酸鈉敏感。在pH為1.0~5.0時(shí)不穩(wěn)定。該病毒不耐熱,56℃ 15min即可滅活,37℃放置48h病毒滴度由105.75 TCID50/0.2ml下降到102.25 TCID50/0.2ml,4℃放置48h后其TCID50略有下降。1.0mol/L MgCl2不能提高病毒在50℃的穩(wěn)定性[6]。此外,黃病毒大多能夠凝集鵝、鴿和新生雛雞的紅細(xì)胞,但其血凝素易于破壞,而且血凝反應(yīng)要求比較嚴(yán)格的pH域[7]。

    鴨坦布蘇病毒易在9~11日齡的鴨胚、雞胚尿囊腔或尿囊膜上生長(zhǎng),可以用鴨胚或SPF雞胚來(lái)進(jìn)行病毒的分離和增殖,胚的病變主要表現(xiàn)為:胚體出血、死亡,尿囊膜增厚,尿囊液減少[8]。鴨坦布蘇病毒可以在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)和鴨胚成纖維細(xì)胞(DEF)上增殖,適應(yīng)DEF后的病毒通常在36~48h產(chǎn)生CPE,隨時(shí)間延長(zhǎng),CPE更加明顯,表現(xiàn)為細(xì)胞折光性增強(qiáng),細(xì)胞變圓以及細(xì)胞融合,最終崩解死亡[6]。

    2? 流行病學(xué)

    本病最初于2010年春季在我國(guó)江蘇、浙江等地流行,隨后迅速擴(kuò)散到我國(guó)主要的鴨養(yǎng)殖地區(qū)。我國(guó)華東(江蘇、浙江、上海、福建、安徽、山東、江西)、華中(河南、湖南、湖北)、華北(北京、河北)、華南(廣東、廣西)等省區(qū)鴨群均有TMUV感染的報(bào)道[9]。

    大多數(shù)黃病毒屬的病毒能引起人獸共患疾病,并呈現(xiàn)不同的臨床癥狀,主要引起病毒性腦炎甚至全身性感染。節(jié)肢動(dòng)物是黃病毒屬病毒主要的宿主和傳播媒介,在自然條件下,節(jié)肢動(dòng)物的分布特點(diǎn)受地理環(huán)境與季節(jié)氣候的影響,故該類(lèi)病毒的致病性也具有明顯的地域性和季節(jié)性[10]。鴨坦布蘇病毒不僅能在不同品種鴨鵝中傳播流行,還可感染其它動(dòng)物,如豬、雞、麻雀等[11-12]。坦布蘇病毒可通過(guò)庫(kù)蚊傳播,鳥(niǎo)類(lèi)特別是家禽為其貯存宿主[13]。但鴨坦布蘇病毒的具體傳播媒介不明。該病在秋季流行嚴(yán)重,推測(cè)可能與蚊蟲(chóng)有關(guān),但進(jìn)入蚊蟲(chóng)較少的冬季后,該病仍然在部分地區(qū)蔓延,因此,是否有其他的傳播途徑有待進(jìn)一步證實(shí)[14]。

    3? 臨床癥狀及病理變化

    產(chǎn)蛋鴨群多以產(chǎn)蛋下降為主,產(chǎn)蛋率從產(chǎn)蛋高峰(80%~90%)下降至10%以下,甚至絕產(chǎn),蛋殼質(zhì)量變化不明顯,死淘率約1%,后期有繼發(fā)性細(xì)菌感染。少量鴨站立不穩(wěn),頭頸抽搐、行走不穩(wěn)、共濟(jì)失調(diào),病鴨雙腿癱瘓,伴有呼吸系統(tǒng)疾病,側(cè)臥,發(fā)病鴨多排黃綠色糞便[15]。發(fā)病鴨各臟器均有不同程度病變,可見(jiàn)皮下、肌肉彌散性出血;心臟腫大、出血,心肌壞死;肝臟表面有點(diǎn)狀壞死灶,似水煮過(guò),有塊狀出血片,并且呈土黃色;脾臟腫脹、出血、淤血,甚至破裂,呈斑駁樣大理石紋;肺臟腫大、腎臟腫大有壞死點(diǎn),偶見(jiàn)出血點(diǎn);卵泡變性、卵泡膜出血。雛鴨腦部均出現(xiàn)不同程度水腫或呈樹(shù)枝狀充血[16]。

    鴨感染坦布蘇病毒后的病理組織學(xué)變化主要表現(xiàn)為:肝實(shí)質(zhì)嚴(yán)重變性、壞死;肺淤血,內(nèi)有大量炎性細(xì)胞滲出;胰腺組織可見(jiàn)凝固性壞死灶;脾淋巴細(xì)胞局部減少;腎小管上皮細(xì)胞腫脹[17];腦部神經(jīng)元細(xì)胞變性壞死,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)并有“衛(wèi)星現(xiàn)象”,腦部血管壁增厚,血管擴(kuò)張充血,大、小腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生,局部發(fā)生軟化及壞死;肝臟有嚴(yán)重的脂肪變性,充滿(mǎn)膽色素,毛細(xì)血管擴(kuò)張[18]。

    4? 診斷方法

    4.1? 臨床診斷? 首先,根據(jù)鴨坦布蘇病毒病的臨床癥狀特點(diǎn),產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋量驟降,死淘率大約1%;排黃綠色糞便,并且出現(xiàn)少量鴨站立不穩(wěn)、頭頸抽搐、行走不穩(wěn)、共濟(jì)失調(diào)癥狀,嚴(yán)重者病鴨雙腿癱瘓[15]。

    其次,根據(jù)其病理變化的特點(diǎn),各臟器均有不同程度病變,表現(xiàn)為心臟腫大、出血,心肌壞死;肝臟表面有點(diǎn)狀壞死灶,似水煮過(guò),有塊狀出血片,并且呈土黃色;脾臟腫脹、出血、淤血,甚至破裂,呈斑駁樣大理石紋;肺臟腫大,腎臟腫大、有壞死點(diǎn),偶見(jiàn)出血點(diǎn);卵泡變性、卵泡膜出血;腦部出現(xiàn)不同程度水腫或呈樹(shù)枝狀充血[15-16]。

    根據(jù)以上的臨床癥狀和剖檢病理變化來(lái)初步懷疑是否是鴨坦布蘇病毒病,然后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷方法來(lái)確診。

    4.2? 血清學(xué)診斷

    4.2.1? 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)? 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法是在實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)中最常用的檢測(cè)方法之一,具有特異性強(qiáng)、靈敏度高及檢測(cè)速度快等特點(diǎn),目前廣泛應(yīng)用于動(dòng)物的疾病診斷和疫苗效果的評(píng)價(jià)。

    姬希文等[19]、張德寶[20]和陳偉國(guó)等[21]等研究利用純化的鴨坦布蘇病毒奉賢株(FX2010)作為包被抗原,建立了檢測(cè)DTMUV血清抗體的間接ELISA方法,并且對(duì)各種檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化。該方法具有較高的敏感性和特異性。施少華等研究了以純化的鴨坦布蘇病毒W(wǎng)R株為包被抗原,建立檢測(cè)鴨坦布蘇病毒卵黃抗體的間接ELISA方法[22]。萬(wàn)春和等對(duì)鴨坦布蘇病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因進(jìn)行原核表達(dá),并進(jìn)行生物學(xué)活性鑒定,并將表達(dá)成功具有生物學(xué)活性的重組蛋白經(jīng)純化后,作為抗原包被ELISA平板,通過(guò)條件優(yōu)化,建立檢測(cè)禽坦布蘇病毒血清學(xué)檢測(cè)方法[23]。李晨曦等利用DTMUV特異性抗原表位建立Epitopc-ELISA血清學(xué)診斷方法,并對(duì)126份鴨血清樣品進(jìn)行檢測(cè),以中和試驗(yàn)作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較,結(jié)果顯示Epitopc-ELISA檢測(cè)方法的相對(duì)特異性為100%,相對(duì)敏感度為96%,并且Epitopc-ELISA與其他黃病毒血清間不出現(xiàn)交叉反應(yīng)性[24]。

    4.2.2? 乳膠凝集試驗(yàn)? 乳膠凝集試驗(yàn)(LAT)具有準(zhǔn)確靈敏、簡(jiǎn)便易行、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于畜禽傳染病的血清學(xué)檢測(cè)。用于鴨坦布蘇病毒抗體的臨床檢測(cè),不需要特殊設(shè)備,且可在1~5min內(nèi)肉眼觀(guān)察判定結(jié)果,臨床應(yīng)用簡(jiǎn)便快速[25]。

    萬(wàn)春和等以經(jīng)超速和密度梯度離心濃縮純化的鴨坦布蘇病毒抗原進(jìn)行方陣滴定,篩選出致敏乳膠的最佳條件,并制備成鴨坦布蘇病毒乳膠凝集試驗(yàn)(LAT)用抗原,與特異性的鴨坦布蘇病毒陽(yáng)性血清反應(yīng)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集顆粒,進(jìn)而建立檢測(cè)鴨坦布蘇病毒抗體的乳膠凝集試驗(yàn)方法[25]。陳浩等用其實(shí)驗(yàn)室制備并純化的抗坦布蘇病毒 PrM 蛋白單克隆抗體致敏乳膠,采用方陣法,優(yōu)化乳膠凝集試驗(yàn)的最佳條件,建立坦布蘇病毒反向乳膠凝集試驗(yàn)并應(yīng)用于臨床樣品的檢測(cè)[26]。

    4.3? 分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

    4.3.1? RT-PCR檢測(cè)技術(shù)? 張帥等在對(duì) DTMUV序列的比對(duì)分析的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物,通過(guò)優(yōu)化PCR反應(yīng)條件,建立了 DTMUV的一步法RT-PCR檢測(cè)方法。該方法具有特異、快速、敏感、準(zhǔn)確等特點(diǎn),可以檢出1.82個(gè)TCID50的病毒核酸[27]。傅光華等、祖立闖等和王永娟等根據(jù)連接酶依賴(lài)PCR工作原理設(shè)計(jì)并建立一種坦布蘇病毒RT-PCR快速檢測(cè)方法[28~30]。

    4.3.2? 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)技術(shù)? 李慶陽(yáng)等根據(jù)鴨坦布蘇病毒BYD-1株基因序列設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針,建立了快速檢測(cè) DTMUV的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法[31]。萬(wàn)春和等根據(jù)鴨坦布蘇病毒NS5基因序列設(shè)計(jì)引物,建立基于SYBGreenⅠ檢測(cè)模式的實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR,該方法在2.74×103~2.74×107拷貝/μl反應(yīng)范圍內(nèi)有很好的線(xiàn)性關(guān)系[32]。劉青濤等根據(jù)鴨坦布蘇病毒NS2A基因的保守序列,設(shè)計(jì)并合成了1對(duì)特異性引物,建立了一步法實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)方法[33]。

    張艷芳等針對(duì)GenBank中DTMUV基因和鴨瘟病毒(DPV)UL6基因的保守序列,設(shè)計(jì)合成了2對(duì)引物和2條TaqMan探針。通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)體系和條件,建立了鑒別DTMUV和DPV的二重?zé)晒舛縍T-PCR方法[34]。孫敏華等參考GenBank上已發(fā)表的產(chǎn)蛋下降綜合征病毒(EDSV)五鄰體基因序列、H9亞型禽流感病毒的HA基因和鴨坦布蘇病毒E基因序列,分別設(shè)計(jì)了檢測(cè)EDSV、H9 AIV和DTMUV的特異性引物,擴(kuò)增目的片段大小分別為110bp、281bp和266bp,通過(guò)PCR驗(yàn)證及引物濃度的優(yōu)化,建立了針對(duì)這3種病毒的三重?zé)晒?PCR檢測(cè)方法。該方法可以同時(shí)檢測(cè)EDSV、H9AIV和DTMUV,且不能檢出1型鴨甲肝病毒、3型鴨甲肝病毒、番鴨呼腸孤病毒、鴨瘟病毒、鵝細(xì)小病毒、番鴨細(xì)小病毒、新城疫病毒和大腸桿菌基因組 DNA,敏感性試驗(yàn)表明,該方法對(duì)EDSV、H9 AIV和DTMUV核酸的檢測(cè)下限分別為8.0、4.8和1.3個(gè)拷貝,比常規(guī)PCR方法敏感10倍[35]。

    4.3.3? 反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP)檢測(cè)技術(shù)? LAMP技術(shù)通過(guò)兩對(duì)引物,利用Bst DNA聚合酶的鏈置換活性提供反應(yīng)的動(dòng)力,在恒溫條件下完成對(duì)核酸的擴(kuò)增反應(yīng)[36]。該技術(shù)于恒溫條件下幾十分鐘內(nèi)即可完成,無(wú)需昂貴的儀器設(shè)備,結(jié)果可肉眼直接觀(guān)察,具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、特異性好等特點(diǎn)[37]。韓凱凱、董嘉文和吳植等根據(jù)GenBank中登錄的鴨坦布蘇病毒基因序列,分別建立了基于LAMP技術(shù)的鴨坦布蘇病毒檢測(cè)方法[38~40]。

    5? 結(jié)語(yǔ)

    鴨坦布蘇病毒病在我國(guó)流行以來(lái),對(duì)我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的危害,對(duì)養(yǎng)殖戶(hù)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。目前市場(chǎng)上已有商品化的弱毒疫苗,并對(duì)該病起到了很好的防控作用。當(dāng)前對(duì)鴨坦布蘇病毒的研究已經(jīng)很多,但是在傳播途徑、致病機(jī)制和公共衛(wèi)生等方面還需要更深一步的研究。

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    收稿日期:2019-03-22

    *基金項(xiàng)目:國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFD0500800);山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃(SDAIT-11-01)。

    作者簡(jiǎn)介:任斌斌,男,山東人,碩士研究生,E-mail:renbinbinhappy@163.com。

    **通訊作者:黃兵(1973.12-),男,貴州余慶人,研究員,研究方向?yàn)閯?dòng)物分子病毒學(xué)與免疫學(xué),一直從事新城疫、禽流感、傳染性支氣管炎等禽重要傳染性疾病快速檢測(cè)技術(shù)、無(wú)特定病原雞微生物監(jiān)測(cè)技術(shù)及基因工程藥物的研究,E-mail:hbind@163.com。

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