牛呼吸道疾病綜合征病例的病原探析

周發(fā)勇

摘 要：為了解肉牛呼吸綜合癥（BRDC）對(duì)肉牛的致病性，對(duì)肉牛疾病預(yù)防進(jìn)行指導(dǎo)?，F(xiàn)場研究、臨床癥狀和病理變化的分析、病理分離和病原體根據(jù)藥物試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和處理。從該病例的肺組織中，分離到一種預(yù)防措施和一種蘭科病原體。在PPLO固體生長基團(tuán)上，觀察到典型的“煎蛋狀”的細(xì)菌滴。我們用PCR擴(kuò)增了牛OPF基因的485個(gè)靶點(diǎn)。牛前體OPF的基因序列為美國分離株gp45核苷酸序列的98.4%。革蘭氏陰性菌的生物學(xué)特性與內(nèi)臟硫酸菌的生物學(xué)特性相一致。PCR擴(kuò)增16S的rrn基因，擴(kuò)增到14BP。結(jié)果，GenB庫中記錄的賴氏囊藻核苷酸的同源性為99.0%。這些分離物對(duì)大鼠有害。對(duì)牛的突起高度敏感，對(duì)青霉素、西西林、阿米卡星、青霉素、米尼西林敏感。結(jié)果表明，該綜合病原菌是山谷真菌的主體。

某養(yǎng)牛場，從東北的一個(gè)牛場進(jìn)口肉牛。疾病在被運(yùn)回后三天就開始了病牛體溫升高，咳嗽、喘息，伴有漿液性流涕、嚴(yán)重呼吸困難等呼吸道癥狀。有些牛還患有血液稀疏。18頭牛在整個(gè)病程中死亡，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。為了解肉牛發(fā)病和死亡的原因，通過田間調(diào)查、臨床癥狀和病理觀察、病原分離鑒定和藥敏試驗(yàn)，對(duì)肉牛發(fā)病和死亡的病原進(jìn)行了分析。在此基礎(chǔ)上，提出了綜合防治措施。

一、材料與方法

1.材料

（1）從死牛的肺和肝組織中分離出無菌材料和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。同時(shí)對(duì)肺組織進(jìn)行無菌研磨，充分研磨少量PPLO支原體培養(yǎng)基。樣品冷凍、解凍三次，在-20℃冰箱保存。2013年，廣西獸醫(yī)研究所細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存了支原體陽性對(duì)照GL-1。從廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買昆明種小鼠18-20g。

（2）試劑和儀器兔血瓊脂平板由廣西獸醫(yī)研究所細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室制備。PPLO肉湯購自杭州貝斯特生物技術(shù)有限公司，TSA、TSB購自北京路橋科技有限公司，微生物生化反應(yīng)管和藥敏試驗(yàn)紙購自杭州天河微生物制劑有限公司，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、PCR擴(kuò)增和克隆試劑w從北京康威世紀(jì)生物技術(shù)有限公司采購的低溫臺(tái)式離心機(jī)購自貝克曼公司，YY2Ⅲ-8B穩(wěn)定穩(wěn)定電泳儀購自北京61儀器廠;Pro Flex PCR系統(tǒng)購自生命科技公司;721BR09310型凝膠成像系統(tǒng)從Bio-Rad公司購買;孵化器從公司購買。

2.方法

（1）野外調(diào)查，觀察臨床癥狀和病理變化，詢問發(fā)病情況，解剖死牛，肉眼觀察器官形態(tài)。

（2）支原體1.2.2不孕癥的分離、培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)鑒定：將病牛肺組織切成研磨碗，加入3mL PPLO支原體培養(yǎng)基充分研磨，4000r/min離心10分鐘，丟棄沉淀物，上清液經(jīng)0.45μm過濾。一次性針頭過濾器。濾液以1：10稀釋液接種于PPLO支原體培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72-96小時(shí)。觀察。如果液體介質(zhì)變色，則將線轉(zhuǎn)移至PPLO固體介質(zhì)。接種后，菌落在37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72～96小時(shí)。

（3）細(xì)菌的分離和鑒定：將肺和肝組織制成組織接觸，固定，革蘭氏染色，顯微鏡觀察，取肺和肝組織分別接種在5%兔血瓊脂平板、TSB平板和麥康凱瓊脂平板上，按照俞雄標(biāo)報(bào)道的方法進(jìn)行培養(yǎng)。37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱。24-48小時(shí)后，觀察細(xì)菌生長，進(jìn)一步取優(yōu)勢菌落。評(píng)價(jià)。

（4）生物降解特性試驗(yàn)方法進(jìn)行了細(xì)菌分離的生物測定。該菌株的單個(gè)真菌落下，并進(jìn)行生物測定。將0.2毫升單滴接種在微生物化學(xué)試管中，如乳糖、葡萄糖、甘蔗和芥末糖。在尿素等生物測定試管中，應(yīng)用無菌液蠟，37～48小時(shí)。觀察到冷卻后的反應(yīng)結(jié)果。

（5）細(xì)菌16SrRNA基因的PCR鑒定

通過接種環(huán)式無菌法，從肺組織分離到一個(gè)顯性生長菌落，溶于10μL滅菌ddH 2 O 2。2μL菌液充分搖勻。采用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因。PCR反應(yīng)體系為50ugL：模板2ugL，上下游引物（10ugol/L）2ugL，2x Taq PCR母體混合物25ugL，在50ugL中加入ddH_2O。PCR反應(yīng)條件為：95預(yù)變性5分鐘，95預(yù)變性60秒，60退火72延伸60秒，共35個(gè)反應(yīng)周期，72預(yù)變性10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠水回收后送北京華諾夫時(shí)代科技有限公司測序。用BLAST方法分析NCBI的核苷酸同源性。

二、結(jié)果與分析

1.現(xiàn)場調(diào)查、臨床癥狀和病理變化

在引入的58頭小牛中，38頭生病，18頭死亡。在疾病中，預(yù)防和己糖苷的治療是無效的。發(fā)病率和死亡率分別為65.5%和22.4%。病牛體溫高，咳嗽，呼吸困難，流鼻涕。在解剖學(xué)上，這種疾病僅限于肺部和胸部。心臟尖端的葉子、心臟和葉子都有每種紅肉的退化。肺間質(zhì)腫塊增加。這個(gè)壞蛋的大小像黃奶酪和白奶酪。氣管支氣管內(nèi)有大量白色牛奶泡沫。箱內(nèi)有少量液體，一袋液體袋和液體黃色。

2.支原體的分離、培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)鑒定

培養(yǎng)72h開始變色，變色培養(yǎng)基用0.22μm濾針過濾。將濾液接種到PPLO支原體液體和固體培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)。結(jié)果表明，液體變色時(shí)間縮短。液體在24-48h內(nèi)變色時(shí)間由紅色變?yōu)楹稚?，培養(yǎng)基顏色均勻、澄清，無渾濁。在PPLO固體培養(yǎng)基上，可以觀察到針尖大小的菌落生長48-96小時(shí)。在100x顯微鏡下，所有菜肴均出現(xiàn)典型的“煎蛋狀”菌落。核心更厚，向下生長到中間。在它周圍有一層透明的薄層。根據(jù)菌落形態(tài)特征，初步鑒定為牛支原體。

3.病原菌的分離結(jié)果

有少量的堅(jiān)韌的革蘭陰性菌在肺組織的組織染色后仍在正常肝組織中不可見。5%兔血瓊脂平板和TEC板提高后，肝組織不分離細(xì)菌，中等大小，圓形，表面在肺組織的提高，濕滑的灰白色菌落。凈化后，他們使用新鮮血液瓊脂平板接種。在相同條件下，孵育24小時(shí)。根據(jù)研究結(jié)果，新鮮血液瓊脂證明有沒有黃色，中等大小，無細(xì)菌生長。這種真菌是透明、光滑、無溶血。A在室溫下24小時(shí)后，在菌落中心觀察到紅色的色素。TSB組成長24小時(shí)渾濁和沉淀管底部的小點(diǎn)點(diǎn)。在蘭蘭染色檢測，純化后的菌株是革蘭陰性菌。

4.株細(xì)菌生化特性的鑒定

根據(jù)生化特性試驗(yàn)方法進(jìn)行生化鑒定。表明該分離物能分解葡萄糖、蔗糖、不水解尿素等。V-P試驗(yàn)陽性。該菌的生化特性符合粘質(zhì)沙雷氏菌的基本生化特性。

5.藥物敏感性試驗(yàn)和治療結(jié)果

根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，肉牛機(jī)體對(duì)有遠(yuǎn)見的犬毒、阿替西林、新卡尼林敏感，對(duì)真菌和青霉素敏感。對(duì)多合子細(xì)菌的B-和向下的尼西林VI不敏感。對(duì)青霉素、聚石灰B、利福庫敏感。先鋒六號(hào)和其他無反應(yīng)物質(zhì)。在家里，用100種毒液對(duì)一頭有流淚、咳嗽和稀釋癥狀的肉牛進(jìn)行消毒，并對(duì)整頭牛進(jìn)行消毒，收集糞便并進(jìn)行發(fā)酵。它是用5-7天的鸚鵡素和磨碎的半松樹來對(duì)抗牛和牛的肌肉注射，并伴有流淚和咳嗽。對(duì)有擴(kuò)張癥狀的牛進(jìn)行滴注和強(qiáng)化治療。注射3-5天的肌肉以防止其他肉牛。加強(qiáng)管理，增加多維微量元素，提高抗逆轉(zhuǎn)。八天后所有的牛接受了治療，疾病得到了控制，并且沒有發(fā)現(xiàn)新的疾病例子。

三、結(jié)語

這些樣品沒有進(jìn)行病毒檢測。本實(shí)驗(yàn)室分離的牛支原體和粘質(zhì)沙雷菌對(duì)大觀霉素、阿奇霉素、阿米卡星、慶大霉素和新霉素高度敏感。采用大觀霉素和地塞米松聯(lián)合治療該病，取得了良好的效果。最后，控制了疾病的發(fā)生，沒有出現(xiàn)新的病例。由此可見，引起B(yǎng)RDC的病原體是支原體和粘質(zhì)沙雷氏菌的混合感染。

參考文獻(xiàn)：

[1]牛呼吸道疾病綜合征病例的病原分析[J]. 中國畜牧獸醫(yī)， 2015， 42（9）：2481-2486.

[2]陳鳳芝. 牛呼吸道疾病綜合征病例的病原研究[J]. 獸醫(yī)導(dǎo)刊， 2017.

[3]曹伯才. 肉牛呼吸道疾病綜合征病理分析與防治[J]. 中國畜禽種業(yè)， 2017， 13（4）：127-127.

[4]徐勛彪. 腎病綜合征患者下呼吸道醫(yī)院感染病原菌分析[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志， 2010， 20（20）：3176-3176.

[5]劉志鵬， 董秀梅， 師東方， et al. 牛呼吸道疾病綜合征的主要病原[J]. 畜牧獸醫(yī)科技信息， 2012（12）：9-11.