“葉綠體色素的提取和分離”實驗縮時改進(jìn)的探討

應(yīng)學(xué)超（上海市金山中學(xué) 上海 201599）

葉綠體色素的構(gòu)成、比例和含量水平，直接反映了光合植物的光合作用水平、環(huán)境響應(yīng)方式等。葉綠體色素的質(zhì)、量，在分析與葉綠體色素變化相關(guān)的生理機(jī)制［1］，探討光系統(tǒng)中能量轉(zhuǎn)移等規(guī)律，以及研究環(huán)境因素對植物生長發(fā)育的影響［2-3］等工作中都很重要。在“葉綠體色素的提取和分離” 實驗教學(xué)過程中，經(jīng)常遇到一些問題，致使無法如期完成教學(xué)內(nèi)容、達(dá)成教學(xué)目標(biāo)，實驗效果也不甚理想。因此，筆者利用研磨過濾器（北京川布蘭生物技術(shù)開發(fā)有限公司）對本實驗進(jìn)行了一定的改進(jìn)。

1 實驗教學(xué)過程中存在的問題

1.1 操作步驟多，完成實驗時間長 在常規(guī)“葉綠體中色素的提取和分離”實驗中，學(xué)生根據(jù)教材中的實驗步驟進(jìn)行操作。由于實驗步驟多，學(xué)生實驗操作時間一般需要20～25 min；即使提前充分預(yù)習(xí)，最快至少需要15 min 以上才能完成。因此根據(jù)教材常規(guī)情況下教學(xué)，時間比較緊張，留給學(xué)生進(jìn)行實驗現(xiàn)象觀察、分析和拓展延伸的時間并不多。

1.2 操作要求高，實驗效果不穩(wěn)定 常規(guī)實驗對整個實驗操作要求比較高，任何操作步驟有問題，都容易導(dǎo)致實驗效果不穩(wěn)定。例如，研磨操作要求迅速充分研磨，但很多情況下學(xué)生不擅長使用研缽，導(dǎo)致研磨速度慢，研磨不充分，色素提取含量低；過濾操作時，學(xué)生不易把握脫脂棉的用量，或碳酸鈣、石英砂的加入量過大，導(dǎo)致過濾速度慢、濾液含量少和濾液雜質(zhì)多等問題；畫濾液細(xì)線時，用毛細(xì)吸管會使得濾液出現(xiàn)印染現(xiàn)象，導(dǎo)致色素分離不明顯；層析操作要求根據(jù)試管底部層析液的量，調(diào)整濾紙長度并掛到試管軟木塞的鉤子上，學(xué)生很難估計準(zhǔn)確，導(dǎo)致濾液細(xì)線浸入層析液或接觸不到層析液的情況，需要較多時間進(jìn)行調(diào)整。

2 相關(guān)研究進(jìn)展

目前已有的研究中對于“葉綠體色素的提取和分離”實驗的改進(jìn)，主要集中在以提升實驗效果為主要目的的步驟改良。例如，左小龍等［4］提出可使用薄層層析等方法替換原有步驟，并進(jìn)一步分離、收集4 種色素，測定吸收光譜，強(qiáng)化學(xué)生的理解；楊建勝等［5］提出可增加乙酸乙酯溶解胡蘿卜素和色素萃取步驟，提高實驗成功率；陳琳［6］提出石油醚+丙酮（20∶2）層析效果較好；周臻華［7］提出選取龍葵或烏蘞莓提取的色素效果較好；朱靜［8］提出“推血涂片方法”畫濾液細(xì)線會“直、細(xì)、均、齊”等。根據(jù)這些改進(jìn)，實驗效果確有提高，但是實驗的操作時間并沒有縮短，甚至用時更長，對實際教學(xué)的幫助并不大。

3 實驗改進(jìn)措施

3.1 實驗材料的選擇 教材建議使用新鮮的菠菜或青菜作為實驗材料。菠菜或青菜的主葉脈明顯，準(zhǔn)備材料時需要學(xué)生去除大量葉脈，花費時間較多。韭菜為平行葉脈，無明顯主葉脈，本實驗將實驗材料替換為韭菜，避免了去除葉脈的步驟，節(jié)約了時間，且韭菜提取到的葉綠體色素最終層析結(jié)果與菠菜、青菜沒有明顯差異。

3.2 實驗材料的處理 教材中需要對實驗材料進(jìn)行去主葉脈、剪碎、稱量，但該實驗是定性實驗，準(zhǔn)確稱量意義不大。因此將此步驟改為“用剪刀切取稍經(jīng)風(fēng)干脫水處理的韭菜葉，剪碎，加入研磨過濾器中至約1／3 容量（圖1）”。教師預(yù)估實驗中的韭菜葉用量，學(xué)生根據(jù)估算方式進(jìn)行操作與最理想狀態(tài)并無明顯差異，縮短操作用時至約1 min。

圖1 實驗材料的處理

3.3 研磨過濾步驟合并 教材中研磨過濾分為2步，操作較多，耗時較長，容易出現(xiàn)操作問題。因此，在本實驗中改為“在研磨過濾器中加入少量石英砂和碳酸鈣，一次性加入3 mL 無水乙醇，進(jìn)行迅速、充分的研磨后，用移液器吸取濾液，并收集到一個小指管中（圖2）”。研磨過濾器集成了研磨和過濾2 種功能，可在極短時間內(nèi)（約2 min）就完成研磨與過濾步驟，研磨更為便捷、快速、充分，且在研磨同時完成過濾，省時高效、效果較好［9］。改進(jìn)后實驗藥品的用量進(jìn)一步減少。為了避免研磨時乙醇揮發(fā)導(dǎo)致的損失，原本需要分次加入總量5 mL 的無水乙醇進(jìn)行提取，現(xiàn)在只需要3 mL 即可保證提取樣品的效果，同時石英砂與碳酸鈣的用量也明顯減少。

圖2 研磨過濾

3.4 濾液的處理 教材中過濾后的濾液未做任何處理，故常出現(xiàn)渾濁狀態(tài)。因此，在此增加步驟“將小指管放于迷你離心機(jī)中，5 000 rpm，離心15 s，靜置備用（圖3）”。離心后的濾液更澄清，觀察效果更好，減少了雜質(zhì)存在對劃濾液細(xì)線步驟的影響，本步驟操作需要約1 min。

圖3 濾液的離心

3.5 濾紙條的制備 將教材中的濾紙條尺寸由18 cm×2 cm 改為8 cm×1 cm，濾紙條的一端剪角標(biāo)記操作不變。本步驟的改變主要為適應(yīng)展層瓶的容積，操作需要約1 min。

3.6 畫濾液細(xì)線 教材中所用的毛細(xì)吸管畫濾液細(xì)線的方式極容易出現(xiàn)印染現(xiàn)象。因此，將毛細(xì)吸管替換為加樣板（圖4）能很好的控制加樣量，最大程度避免出現(xiàn)印染現(xiàn)象，并且能保證在較短時間內(nèi)將濾液細(xì)線畫的又細(xì)又直，也保證了最終的實驗效果相對更好更清晰，實驗成功率更高。本步驟操作需要約3 min。

圖4 畫濾液細(xì)線

3.7 色素的層析 教材中用塞子上加小鉤的大試管進(jìn)行層析，需要根據(jù)試管底部層析液的量調(diào)整濾紙長度。因此，本實驗改為“將2 mL 層析液置于展層瓶中，將加好樣的濾紙條點端向下放入展層瓶中，蓋好瓶蓋進(jìn)行分離（圖5）”。改進(jìn)后的操作避免了學(xué)生根據(jù)試管層析液調(diào)整濾紙的長度，進(jìn)一步縮短操作時間至約2 min。

圖5 色素的層析

4 總結(jié)

實驗改進(jìn)后，在保證整體成功率的前提下，操作時間大幅度縮短，由原本的20～25 min 縮短至約10 min，并且實驗的材料用量減少約一半，避免了實驗材料的浪費。確保實驗后學(xué)生有充分的時間進(jìn)行實驗結(jié)果的觀察、分析和拓展，有效提高了實驗教學(xué)的效果。