HLPC法測(cè)定中草藥紅茶菌制劑中中草藥主效成分

陽(yáng) 勇,蔣盛軍,董志超,何際嬋,符乃方

（1.重慶市中藥研究院，重慶市南岸區(qū)南山街道南山路34 號(hào)400065；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所,海南省儋州市兩院571737 ）

中草藥紅茶菌制劑是基于蔣盛軍博士提出的中草藥益生菌制劑理論，利用復(fù)合益生菌群紅茶菌發(fā)酵甘草、菊花和羅漢果提取液而成，它對(duì)于人體和動(dòng)物消化道和呼吸道疾病的治療和預(yù)防都有很好的效果，尤其是在人體塵肺病的治療和預(yù)防和動(dòng)物口蹄疫和豬高熱病的治療方面，成效顯著[1-3]。

定性和定量的檢測(cè)物質(zhì)的含量是確定中草藥配方功效的重要指標(biāo)。 為了定性和定量確定中草藥紅茶菌制劑中的中草藥成分，我們利用高效液相色譜法

檢測(cè)了中草藥紅茶菌制劑中所用中草藥甘草、菊花和羅漢果的主效成分。 甘草中的主效成分是甘草苷或甘草銨；菊花中的主效成分是綠原酸和3.5-O- 雙咖啡?；幔?羅漢果的主效成分是羅漢果皂苷。 所以，我們以甘草苷、甘草銨、綠原酸和3.5-O- 雙咖啡?；岷土_漢果皂苷為主要參考對(duì)照成分，通過(guò)高壓液相色譜法檢測(cè)包含上述中草藥提取液的中草藥紅茶菌制劑。

1 材料

1.1 儀器 DGU-20 型高效液相色譜 （HPLC）儀（包括SPD-M20A 型二極管陣列檢測(cè)器）、AUW220D 型十萬(wàn)分之一電子天平 （日本島津公司）；KQ250DB 型數(shù)控超聲波清洗器（鞏義市華儀器有限責(zé)任）；Anke TGL-160G 型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 藥品與試劑 中草藥紅茶菌制劑，由蔣盛軍博士制備和提供，每瓶400 毫升。 甘草苷、甘草酸銨、綠原酸、3.5-O- 雙咖啡?；?、羅漢果皂苷的分析純標(biāo)準(zhǔn)品全部購(gòu)買自SIGMA 公司。甲醇為色譜純，其余試劑為分析純；水為超純水。

2 方法和結(jié)果

2.1 液相色譜法定性檢測(cè)中草藥主效成分 對(duì)中草藥紅茶菌制劑中菊花、甘草、羅漢果三種藥食兩用藥材中主效的指標(biāo)性化成成分進(jìn)行了定性研究，主效包括綠原酸、甘草苷、3.5-O- 雙咖啡?；帷⒘_漢果皂苷、甘草酸銨。

(1) 樣品制備方法考察 中草藥紅茶菌制劑為水溶液，制劑中三種藥材用量較低，所測(cè)成分均較有一定的水溶性， 且有其他成分的存在，嚴(yán)重影響樣品的處理，不利于含量測(cè)定，難度較大。最終確定樣品的制備為液液萃取后樣品。 制備方法為：精密量取本品200ml，用正丁醇振搖提取4次，每次50ml，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，并轉(zhuǎn)移至10ml 容量瓶中，加甲醇至刻度，濾過(guò)，即得供試品溶液。

(2) 色譜條件研究與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Welch Ultimate AQ-C18(250mmx4.6mm,5μm)；流動(dòng)相：甲醇（A）- 磷酸鹽緩沖液（B，含0.02mol/l的磷酸二氫鉀溶液，用磷酸調(diào)pH 值至3.0），梯度洗 脫 （0--25min,10.0% →25.0% A；25--28min,25.0%→75.0%A）； 流速：1.0ml/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量：10μl.

本研究依據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版中菊花、甘草、羅漢果三種藥材的含量測(cè)定方法為依據(jù)進(jìn)行色譜條件考察，經(jīng)研究確定流動(dòng)相條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，按上述梯度進(jìn)行洗脫。

(3) 檢測(cè)波長(zhǎng)研究 測(cè)定各對(duì)照品的紫外吸收波長(zhǎng)，根據(jù)不同對(duì)照品的最大吸收，選定不同的紫外檢測(cè)波長(zhǎng)。 檢測(cè)結(jié)果如圖1- 圖5 所示。

圖1 綠原酸紫外吸收?qǐng)D

圖2 甘草苷紫外吸收?qǐng)D

圖3 3.5-O- 雙咖啡?；?

圖4 羅漢果皂苷紫外吸收?qǐng)D酸紫外吸收?qǐng)D

圖5 甘草酸銨紫外吸收?qǐng)D

(4)檢測(cè)圖譜

圖6 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖

圖7 甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖

圖8 3.5-O- 雙咖啡?；針?biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖

圖9 羅漢果皂苷標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖

圖10 甘草酸銨標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖

圖11 混合對(duì)照品的液相色譜圖

圖12 樣品液相色譜圖（210nm）

圖13 對(duì)照品各峰紫外吸收

圖14 樣品各峰紫外吸收

結(jié)果表明：利用高效液相色譜法可以快速檢測(cè)到中草藥紅茶菌制劑中中草藥菊花、 甘草、羅漢果三中藥材中綠原酸、 甘草苷、3.5-O- 雙咖啡?；?、羅漢果皂苷、甘草酸銨等指標(biāo)性成分。

2.2 液相色譜法定量檢測(cè)中草藥主效成分

(1) 定量成分的確定 通過(guò)上述定性研究結(jié)果，結(jié)合本產(chǎn)品特征，確定綠原酸、3.5-O- 雙咖啡?；釣楸井a(chǎn)品定量測(cè)定指標(biāo)性成分。

(2) 波長(zhǎng)的選擇 根據(jù)圖譜雜質(zhì)干擾情況及綠原酸、3.5-O- 雙咖啡酰基奎酸最大紫外吸收選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為326nm。

圖15 樣品液相色譜圖（326nm）

(3) 液相色譜條件 在定性研究的基礎(chǔ)上確定液相條件為：

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫； 檢測(cè)波長(zhǎng)為326nm。理論板數(shù)按3，5-0- 二咖啡?；鼘幩岱逵?jì)算應(yīng)不低于8000。

(4) 對(duì)照品及供試品溶液制備方法 對(duì)照品溶液制備方法： 取綠原酸對(duì)照品、3，5-0- 雙咖啡?；鼘幩釋?duì)照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中， 加70%甲醇制成毎l(fā)ml 含綠原酸35μg，3，5-0- 二咖啡酰基奎寧酸80μg 的混合溶液，即得（10°C 以下保存）

供試品制備方法：精密量取本品200ml，用正丁醇振搖提取4 次，每次50ml，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，并轉(zhuǎn)移至10ml 容量瓶中，加甲醇至刻度，濾過(guò)，即得供試品溶液。

(5)樣品含量測(cè)定結(jié)果

含量測(cè)定結(jié)果見下表1。

表1 樣品的綠原酸和3.5-O- 雙咖啡?；岷繙y(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論和討論

3.1 結(jié)論

3.1.1 樣品溶液制備方法：精密量取本品200ml，用正丁醇振搖提取4 次，每次50ml，合并正丁醇液，蒸干， 殘?jiān)蛹状既芙猓?并轉(zhuǎn)移至10ml 容量瓶中，加甲醇至刻度，濾過(guò)，即得供試品溶液。

3.1.2 甘草、菊花、羅漢果三種藥材在《中國(guó)藥典》2015年版藥典中共有6 種對(duì)照品進(jìn)行了含量測(cè)定，本研究共使用了其中的5 種，具體結(jié)果如下。

（1）經(jīng)過(guò)色譜條件建立，對(duì)照品中綠原酸、甘草苷、3.5-O- 雙咖啡酰基奎酸、羅漢果皂苷、甘草酸銨5 個(gè)色譜峰能夠有效的完全分離，且色譜峰峰型較好；

（2） 經(jīng)過(guò)對(duì)照品對(duì)比研究， 樣品中綠原酸、3.5-O- 雙咖啡酰基奎酸兩個(gè)峰可以作為含量測(cè)定用，甘草苷分離效果不好，且峰較小，羅漢果皂苷與甘草酸銨峰面積均較小，含量太低不適合含量測(cè)定用；

（3）本研究所建立的含量測(cè)定方法，能夠?qū)Ρ酒分芯G原酸、3.5-O- 雙咖啡?；徇M(jìn)行含量測(cè)定。

3.2 討論

高效液相色譜法是檢測(cè)中草藥中主效主效成分的有效方法[4]。 利用高效液相色譜法檢測(cè)中草藥紅茶菌制劑中中草藥甘草、菊花和羅漢果的主效成分，我們發(fā)現(xiàn)對(duì)于甘草苷、甘草酸銨、綠原酸、3.5-O- 雙咖啡酰基奎酸和羅漢果皂甙， 都可以快速定性檢測(cè)出來(lái)。 這說(shuō)明高效液相色譜法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)中草藥紅茶菌制劑中中草藥成分的快速定性檢測(cè)。 但是，在定量檢測(cè)方法，我們發(fā)現(xiàn)我們無(wú)法對(duì)甘草苷、甘草酸銨、羅漢果皂甙進(jìn)行定量檢測(cè)。 這可能的原因，我們推測(cè)有四個(gè)：

（1）在中草藥紅茶菌制劑中，中草藥作為一種添加成分，為了不影響益生菌的發(fā)酵，所以中草藥添加量比較少，一般每種中草藥的添加量控制在1-3g。

（2）其次，這些中草藥在熬煮提取過(guò)程中，僅有部分水溶性成分析出。

（3）在發(fā)酵過(guò)程中，這些中草藥主效成分被益生菌發(fā)酵降解成次生代謝產(chǎn)物或其他中間體。

（4）在發(fā)酵過(guò)程中，微生物發(fā)酵成分等其他成分嚴(yán)重影響樣品的處理，干擾檢測(cè)。

綜合上述四個(gè)原因，雖然高壓液相色譜是一種非常靈敏的檢測(cè)設(shè)備，但是對(duì)于中草藥的一些主效成分也是難以做到定量檢測(cè)。 不過(guò)，我們也發(fā)現(xiàn)菊花中的兩種主效成分綠原酸、3.5-O- 雙咖啡?；峥梢詫?shí)現(xiàn)定量檢測(cè)，這其中的原因可能是這兩種主效成分含量比較高，容易熬煮提取出來(lái)，最后在發(fā)酵中降解量比較少。 因此，我們可以對(duì)綠原酸、3.5-O- 雙咖啡酰基奎酸實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。