吡格列酮對(duì)A549肺癌細(xì)胞及RAW264.7巨噬細(xì)胞18F-FDG攝取影響的實(shí)驗(yàn)研究

秦露平 呂杰 李建芳 謝良駿 蔣永濼 程木華

【摘要】目的 探討吡格列酮對(duì)A549肺癌細(xì)胞及RAW264.7巨噬細(xì)胞氟代脫氧葡萄糖（18F-FDG）攝取的影響。方法 用不同濃度（0、10、20、50、100、200 μg/ml）的吡格列酮溶液分別作用于A549肺癌細(xì)胞及RAW264.7巨噬細(xì)胞1 h，加入18F-FDG孵育0.5 h后，用γ計(jì)數(shù)儀分別檢測(cè)細(xì)胞18F-FDG攝取變化情況。用100 μg/ml的吡格列酮作用細(xì)胞1 h，加入18F-FDG分別孵育0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，并以0 μg/ml吡格列酮溶液作用細(xì)胞作為對(duì)照組，用γ計(jì)數(shù)儀分別檢測(cè)以上6個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞18F-FDG攝取變化情況，獲得每分鐘放射性計(jì)數(shù)（CMP）百分比。結(jié)果 吡格列酮濃度為10、20、50、100、200 μg/ml組A549肺癌細(xì)胞CMP百分比均高于0 μg/ml組（P均< 0.05）。吡格列酮濃度為10、20、50 μg/ml組巨噬細(xì)胞CMP百分比與0 μg/ml組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05），吡格列酮濃度為100、200 μg/ml組RAW264.7巨噬細(xì)胞的CMP百分比均低于0 μg/ml組（P均< 0.05）。在6個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)，經(jīng)吡格列酮作用后，肺癌細(xì)胞CMP百分比均高于對(duì)照組（P均< 0.001），而巨噬細(xì)胞CMP百分比均低于對(duì)照組（P均< 0.05）。結(jié)論 較大劑量吡格列酮短期內(nèi)能使A549肺癌細(xì)胞18F-FDG攝取增高，而使RAW264.7巨噬細(xì)胞的18F-FDG攝取減低。

【關(guān)鍵詞】吡格列酮;肺癌細(xì)胞;巨噬細(xì)胞;氟代脫氧葡萄糖

【Abstract】Objective To evaluate the effect of pioglitazone on the 18F-fluorodeoxyglucose （18F-FDG） uptake in the A549 lung cancer cells and RAW264.7 macrophages.? Methods The A549 lung cancer cells and RAW264.7 macrophages were treated with different concentrations of pioglitazone solutions （0， 10， 20， 50， 100 and 200 μg/ml） for 1 h. After incubation with 18F-FDG for 0.5 h， the uptake of 18F-FDG was detected by a γ counter. The cells were treated with 100 μg/ml pioglitazone for 1 h and incubated with 18F-FDG for 0.5， 1.0， 1.5， 2.0， 2.5 and 3.0 h， respectively. The cells untreated with pioglitazone were assigned into the control group. The changes of the 18F-FDG uptake at 6 time points were detected by a γ counter. The percentage of radioactive count per minute （CMP） was calculated.? Results The percentage of CMP in the A549 lung cancer cells treated with 10， 20， 50， 100 and 200 μg/ml of pioglitazone was significantly higher than that in the cells without pioglitazone treatment （all P< 0.05）. The percentage of CMP did not significantly differ between the RAW264.7 macrophages treated with 10， 20 and 50 μg/ml of pioglitazone and those untreated with pioglitazone （all P> 0.05）. The percentage of CMP in the RAW264.7 macrophages treated with 100 and 200 μg/ml of pioglitazone was significantly lower than that in those without pioglitazone treatment （both P< 0.05）. At 6 time points， the percentage of CMP in the lung cancer cells treated with pioglitazone was considerably higher than that in the control group （all P< 0.001）， whereas the percentage of CMP in the macrophages treated with pioglitazone was significantly lower compared with that in the control group （all P< 0.05）.? Conclusion Treatment with a large dose of pioglitazone can increase the short-term 18F-FDG uptake in the A549 lung cancer cells， whereas decrease the 18F-FDG uptake in the RAW264.7 macrophages.

【Key words】Pioglitazone;Lung cancer cell;Macrophage;18F-fluorodeoxyglucose

正電子發(fā)射斷層顯像/X線計(jì)算機(jī)體層成像（PET/CT）自問(wèn)世之后，在肺癌的診斷、鑒別診斷、臨床分期、療效監(jiān)測(cè)等應(yīng)用多年。目前臨床應(yīng)用廣泛的腫瘤示蹤劑是氟代脫氧葡萄糖（18F-FDG），但18F-FDG 在炎性病變也能被明顯攝取，因此其對(duì)于肺癌的鑒別診斷存在一定困難。炎性病變的病理生理機(jī)制非常復(fù)雜，不同病理階段有許多中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。這些炎性細(xì)胞往往與腫瘤細(xì)胞在糖代謝途徑方面存在相類似的多重機(jī)制，導(dǎo)致炎性細(xì)胞能像腫瘤細(xì)胞一樣高度攝取葡萄糖[1]。吡格列酮是臨床較常用的抗2型糖尿病藥物，作為一種過(guò)氧化物酶增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）激動(dòng)劑，能通過(guò)激動(dòng)PPAR-γ增強(qiáng)胰島素敏感性以提高機(jī)體對(duì)葡萄糖的攝取，同時(shí)能抑制炎癥反應(yīng)[2-5]。本研究以此為出發(fā)點(diǎn)，在體外細(xì)胞試驗(yàn)角度，研究吡格列酮對(duì)A549肺癌細(xì)胞及RAW264.7巨噬細(xì)胞葡萄糖代謝的影響，觀察吡格列酮介入后2種細(xì)胞的糖代謝是否發(fā)生不同反應(yīng)，從而對(duì)兩者進(jìn)行鑒別。

材料與方法

一、材 料

A549肺癌細(xì)胞株來(lái)源于上?？茖W(xué)院細(xì)胞庫(kù)，RAW264.7 小鼠巨噬細(xì)胞株來(lái)源于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。DEME高糖培養(yǎng)基、DEME無(wú)糖培養(yǎng)基、新生胎牛血清、0.25%胰酶+依地酸二鈉（EDTA）、磷酸鹽緩沖液（PBS）均由廣州杰特韋公司提供，二甲亞砜溶劑由凱基生物公司提供。吡格列酮粉劑（純度≥98%）由佑佰生物公司提供。18F-FDG由廣州原子高科同位素有限公司提供。24孔板由Corning有限公司提供。Galaxy48R CO2培養(yǎng)箱由美國(guó)Eppendorf公司提供。γ放射性計(jì)數(shù)儀（型號(hào)GC-1200）由北京華瑞森科技發(fā)展有限公司提供。

二、方 法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)與種板

A549肺癌細(xì)胞及RAW264.7巨噬細(xì)胞均用含10%胎牛血清的DEME高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 ～ 3 d傳代1次。將密度約2×105/ml的細(xì)胞懸液接種于24孔板，每孔接種的細(xì)胞懸液體積為0.5 ml，每種細(xì)胞分為若干組，每組均為6孔。經(jīng)過(guò)約2 d的培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿80%視野時(shí)，可以開(kāi)始進(jìn)行相關(guān)處理。

2. 不同濃度吡格列酮對(duì)細(xì)胞18F-FDG攝取的影響試驗(yàn)

先用0、10、20、50、100、200 μg/ml吡格列酮溶液分別作用于A549肺癌細(xì)胞及RAW264.7巨噬細(xì)胞30 min，然后加入放射性活度為37 MBq的18F-FDG放入培養(yǎng)箱孵化30 min。迅速吸掉上述培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次，向清洗干凈的培養(yǎng)板中加入胰酶消化獲取細(xì)胞懸浮液。將細(xì)胞懸浮液置于γ計(jì)數(shù)儀進(jìn)行放射性計(jì)數(shù)，記錄校正后的細(xì)胞每分鐘放射性計(jì)數(shù)（CMP）。

3. 不同時(shí)間點(diǎn)100 μg/ml吡格列酮對(duì)細(xì)胞 18F-FDG攝取的影響實(shí)驗(yàn)

將A549肺癌細(xì)胞及RAW264.7巨噬細(xì)胞加入0 μg/ml吡格列酮溶液（對(duì)照組）作用1.0 h，同時(shí)加入18F-FDG分別孵育0.5、1.0、1.5、2.0、2.5及3.0 h，分別檢測(cè)6個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)2種細(xì)胞的CMP。將上述2種細(xì)胞加入100 μg/ml吡格列酮溶液（吡格列酮組）作用1.0 h，同時(shí)加入18F-FDG孵育0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，分別檢測(cè)6個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)2種細(xì)胞的 CMP。

三、CMP百分比

本研究中，細(xì)胞對(duì)18F-FDG的攝取以CMP百分比表示。CMP百分比（%）=細(xì)胞CMP/18F-FDG孵育0.5 h時(shí)吡格列酮濃度為0 μg/ml組的細(xì)胞平均CMP×100%，即CMP百分比（%）=CMP/平均CMP0×100%。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prism進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用表示;不同濃度吡格列酮對(duì)細(xì)胞18F-FDG攝取的影響采用單因素方差分析，多重比較方法采用Dunnett-t檢驗(yàn);不同時(shí)間點(diǎn)100 μg/ml吡格列酮對(duì)細(xì)胞18F-FDG攝取的影響實(shí)驗(yàn)采用重復(fù)測(cè)量資料方差分析，因時(shí)間因素與組間因素存在交互作用，因此采用t檢驗(yàn)分析單獨(dú)效應(yīng)。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、不同濃度吡格列酮對(duì)細(xì)胞18F-FDG攝取的影響

不同濃度吡格列酮作用于A549肺癌細(xì)胞的CMP百分比比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=32.76，P < 0.001），其中吡格列酮濃度為10、20、50、100、200 μg/ml組A549肺癌細(xì)胞的CMP百分比均高于0 μg/ml組（P均< 0.05）。

不同濃度吡格列酮作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞的CMP百分比比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.84，P< 0.05），其中吡格列酮10 μg/ml組、20 μg/ml組、50 μg/ml組RAW264.7巨噬細(xì)胞的CMP百分比與0 μg/ml組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05），吡格列酮濃度為100 μg/ml、200 μg/ml組巨噬細(xì)胞的CMP百分比均低于0 μg/ml組（P均< 0.05）。

二、不同時(shí)間點(diǎn)100 μg/ml吡格列酮對(duì)細(xì)胞 18F-FDG攝取的影響

吡格列酮與時(shí)間的交互作用對(duì)A549肺癌細(xì)胞CMP百分比的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.73，P < 0.001）;單獨(dú)效應(yīng)顯示：各時(shí)間點(diǎn)吡格列酮組A549肺癌細(xì)胞的18F-FDG攝取均高于對(duì)照組（t為10.92～20.43，P均< 0.001）。吡格列酮與時(shí)間的交互作用對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞CMP百分比的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.46，P < 0.001）;單獨(dú)效應(yīng)顯示：各時(shí)間點(diǎn)吡格列酮組RAW264.7巨噬細(xì)胞的CMP百分比均高于對(duì)照組（t為3.22～10.28，P均< 0.05）。

討論

PET/CT對(duì)于肺癌與肺炎性病變的鑒別診斷一直是臨床的一大難題。目前，無(wú)論是應(yīng)用不同類型PET顯像劑，還是PET目測(cè)法或半定量分析，又或者是PET延遲顯像的應(yīng)用，均不能較好地鑒別肺癌與肺炎性病變[6]。吡格列酮不僅具有抗2型糖尿病效應(yīng)，還具有抗炎效應(yīng)。其介入后是否能使肺癌及肺炎性病變糖代謝發(fā)生不同改變，從而通過(guò)PET/CT鑒別兩者？國(guó)內(nèi)外有較多關(guān)于吡格列酮在糖尿病及脂質(zhì)代謝等方面的研究，但關(guān)于PET/CT吡格列酮介入鑒別腫瘤與炎性病變方面的研究有限。因此，本研究從細(xì)胞學(xué)角度，探究肺癌細(xì)胞及巨噬細(xì)胞經(jīng)吡格列酮介入后各自糖代謝發(fā)生的改變，嘗試通過(guò)不同的糖代謝改變鑒別2種細(xì)胞。

本研究首先探索了不同濃度的吡格列酮溶液對(duì)2種細(xì)胞18F-FDG攝取的影響，研究結(jié)果與Cheong等[7]研究基本一致，顯示吡格列酮短期內(nèi)能使肺癌細(xì)胞CMP百分比增高，而較大劑量吡格列酮能使巨噬細(xì)胞CMP百分比減低，因此較大劑量吡格列酮能使肺癌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞糖代謝產(chǎn)生不同效應(yīng)。在研究肺癌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞動(dòng)態(tài)18F-FDG攝取中，2種細(xì)胞放射性攝取-時(shí)間曲線呈先增高后降低的拋物線趨勢(shì)，兩者在體外18F-FDG攝取的高峰時(shí)間約為1.5～2 h;而文獻(xiàn)顯示人巨噬細(xì)胞在3 h內(nèi)18F-FDG攝取呈線性增高趨勢(shì)，這種細(xì)胞動(dòng)態(tài)18F-FDG攝取的差異可能與選取不同的細(xì)胞株類型相關(guān)[8]。本研究中，對(duì)照組肺癌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞動(dòng)態(tài)CMP百分比的變化情況相差不大，僅利用細(xì)胞動(dòng)態(tài)18F-FDG 攝取的變化可能無(wú)法鑒別肺癌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞，這可能是臨床PET/CT多時(shí)相或延遲顯像無(wú)法鑒別部分肺癌與肺炎性病變的重要原因之一。通過(guò)濃度為100 μg/ml吡格列酮的介入后，2種細(xì)胞18F-FDG攝取-時(shí)間曲線仍呈拋物線趨勢(shì)，18F-FDG 攝取高峰時(shí)間基本相同，但吡格列酮組的肺癌細(xì)胞CMP百分比均高于對(duì)照組，吡格列酮組的巨噬細(xì)胞CMP百分比卻均低于對(duì)照組。有文獻(xiàn)顯示，吡格列酮具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及促進(jìn)其凋亡的作用，生長(zhǎng)受抑制的腫瘤細(xì)胞糖代謝將減低[9-10]。本研究顯示，吡格列酮介入后肺癌細(xì)胞18F-FDG攝取增高或糖代謝增高。其主要原因可能與吡格列酮作用時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)，本研究中的吡格列酮作用時(shí)間只有1 h，而使腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制至少需要1 d以上時(shí)間。因此，本研究在體外細(xì)胞試驗(yàn)證實(shí)吡格列酮短期介入后可使肺癌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞糖代謝發(fā)生不同改變，通過(guò)這種變化可以將肺癌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞鑒別開(kāi)來(lái)。盡管如此，本研究?jī)H立足于體外細(xì)胞試驗(yàn)，而且肺癌及炎性細(xì)胞類型有限，是否其他種類肺癌細(xì)胞及炎性細(xì)胞經(jīng)吡格列酮介入后糖代謝會(huì)發(fā)生不同改變，活體動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果是否與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，以及吡格列酮所致細(xì)胞糖代謝改變的分子機(jī)制等問(wèn)題將值得進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，體外細(xì)胞試驗(yàn)顯示較大劑量吡格列酮短期介入后，A549肺癌細(xì)胞18F-FDG攝取增高，而RAW264.7巨噬細(xì)胞的18F-FDG攝取減低。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2018-10-18）

（本文編輯：林燕薇）