動(dòng)物疫病PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的污染與對(duì)策

翟偉 王秀東 曹凱捷

摘 要 隨著近年來大規(guī)模的集約化養(yǎng)殖，加強(qiáng)了動(dòng)物之間疾病的傳播率和擴(kuò)散率，因此也受到廣泛相關(guān)實(shí)驗(yàn)室科學(xué)家的關(guān)注，并發(fā)明了PCR檢測(cè)診斷技術(shù)并為檢驗(yàn)疫病提供了科學(xué)依據(jù)。這種技術(shù)操作簡(jiǎn)單、容易掌握、有極高的靈敏度并且結(jié)果可靠，但該方法較強(qiáng)的擴(kuò)增能力也帶來了一些令人頭疼的問題，也就是易污染，極其微量的污染可能造成假陽(yáng)性的產(chǎn)生。

關(guān)鍵詞 動(dòng)物疫病；PCR檢測(cè)；實(shí)驗(yàn)室；污染

PCR檢測(cè)也就是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)；它可看作是生物體外的特殊DNA的復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加。這種技術(shù)被用在動(dòng)物疫病的檢測(cè)當(dāng)中能夠?qū)?dòng)物的DNA片段無限放大，從而在動(dòng)物疫病的防治過程中起到很好的效果，未來隨著時(shí)代的進(jìn)步實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境會(huì)進(jìn)一步得到改善。

1 引起 PCR污染的原因

1.1 PCR試劑的污染

引起PCR污染的主要原因之一是PCR試劑的污染，做實(shí)驗(yàn)其基本的實(shí)驗(yàn)器材就是試劑，保護(hù)好相關(guān)的試劑器材，也就是直接減少了在實(shí)驗(yàn)中對(duì)污染物的接觸。具體表現(xiàn)在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。

1.2 樣本間的交叉污染

引起PCR污染的主要原因之二是樣本間的交叉污染，在實(shí)驗(yàn)的標(biāo)本儲(chǔ)存的過程中，由于密封方法不當(dāng)或是密封不夠嚴(yán)密導(dǎo)致樣本之間進(jìn)行交互交叉感染，這是其中的原因之一，屬于人為存儲(chǔ)不當(dāng)而導(dǎo)致的樣本感染。還有比較重要的原因是來自于客觀原因，或者也可以說是有人為所導(dǎo)致的，就是存儲(chǔ)的容器被污染，主要是樣本的容器外沾有標(biāo)本而造成的相互交叉感染。又或者樣本核酸模板在人為提取的過程中，由于移液槍的污染而導(dǎo)致樣本間的污染等等因素，這些在人為的實(shí)驗(yàn)過程中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)，如果要避免的話建議做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候要留心，多注意細(xì)節(jié)以防樣本交叉污染帶來的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有誤。

1.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染

引起PCR污染的主要原因之三是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染，這是PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題，也是最主要的污染原因之一。因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量是非常大的，其拷貝量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染很可能造成假陽(yáng)，就可形成假陽(yáng)性，形成污染源，對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境帶來極強(qiáng)的破壞性。

1.4 操作者的污染

在實(shí)驗(yàn)的過程中，由于操作者過于注重操作的結(jié)果和效益，往往在實(shí)驗(yàn)的過程中就會(huì)因?yàn)樾募痹斐烧`操作，或者自身的頭發(fā)、皮膚等當(dāng)中含有的細(xì)菌都會(huì)帶來PCR的污染。這不僅僅是個(gè)人的實(shí)驗(yàn)室防護(hù)措施沒有做好，更重要的是實(shí)驗(yàn)室的操作安全知識(shí)以及細(xì)節(jié)沒有從整體上有清晰的認(rèn)識(shí)，長(zhǎng)時(shí)間這樣開展實(shí)驗(yàn)肯定是對(duì)實(shí)驗(yàn)的不重視，其結(jié)果可想而知。

2 防止污染的措施

2.1 對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)室合理分區(qū)

防止污染的措施之一是對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)室合理進(jìn)行分區(qū)，這是最重要的防止污染的措施之一，能從根本上杜絕PCR實(shí)驗(yàn)室的污染。將實(shí)驗(yàn)室分為以下三個(gè)區(qū)域：第一，標(biāo)本處理區(qū)，包括擴(kuò)增摸板的制備；第二，PCR擴(kuò)增區(qū)，包括反應(yīng)液的配制和PCR擴(kuò)增；第三，產(chǎn)物分析區(qū)，凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備。在操作的過程中一定要將這些重要的工作區(qū)進(jìn)行有效的隔離，操作的時(shí)候使用專業(yè)的器械，以防出現(xiàn)交叉感染。

2.2 良好的實(shí)驗(yàn)室操作習(xí)慣

由于操作不當(dāng)引起的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和樣本交叉污染的案例在科學(xué)實(shí)驗(yàn)室當(dāng)中經(jīng)?？梢?，不良的操作習(xí)慣在實(shí)驗(yàn)室搞科研是實(shí)在對(duì)科學(xué)不尊重的一種行為舉動(dòng)，因此在進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室操作之前一定要注意對(duì)自身進(jìn)行全副的武裝。在開始操作的時(shí)候還要養(yǎng)成良好的操作習(xí)慣，該將本次實(shí)驗(yàn)的器具放在哪里就放在哪里，不把器具混合交叉使用。

2.3 合理的試劑分裝與貯存

其次，相對(duì)來說比較有效的措施是要合理的試劑分裝與貯存，在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的失敗，因此將所有的試劑進(jìn)行小量的包裝，而且將PCR反應(yīng)液先行配置好再進(jìn)行小量的分裝，放在零下負(fù)20攝氏度的環(huán)境下進(jìn)行保存，避免感染次數(shù)的增加。

2.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)盡量減少PCR循環(huán)次數(shù)

最后是要在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中盡量減少PCR循環(huán)次數(shù)，將PCR產(chǎn)物只要達(dá)到檢測(cè)水平就可以了，這樣就可以很好地避免高濃度大量的擴(kuò)增產(chǎn)物帶來的污染。但是一旦產(chǎn)生了污染就必須要立即追蹤污染物，盡快找到污染的源頭，從而盡快保證實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蝽樌_展。這個(gè)防治對(duì)策在經(jīng)過多次的驗(yàn)證后，多數(shù)實(shí)驗(yàn)科學(xué)家都表示十分有效，能夠很好的減少PCR的污染。

3 結(jié)束語(yǔ)

綜上所述，在動(dòng)物疫病PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的污染和對(duì)策當(dāng)中格外要注意到的是要注意操作的規(guī)范性和嚴(yán)格性，目前引起 PCR污染的原因的主要原因都有 PCR試劑的污染、樣本間的交叉污染、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染和操作者的污染，因此在實(shí)驗(yàn)的過程中一定要以嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)的態(tài)度來對(duì)待每一場(chǎng)PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，以防在實(shí)驗(yàn)當(dāng)中由于個(gè)人主觀上帶來的樣本交叉污染和實(shí)驗(yàn)室器具的混合使用，這些對(duì)于實(shí)驗(yàn)來說是毫無幫助的。所以在實(shí)驗(yàn)污染防治當(dāng)中要養(yǎng)成良好的操作習(xí)慣，改變不良的操作陋習(xí)。

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