黃柏醇提物與氨芐青霉素聯(lián)用對(duì)大腸桿菌的體外抑菌作用

王 敬，田 蓓

(1．武漢華夏理工學(xué)院生物制藥工程系，湖北 武漢 430223；2.浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

自1940年青霉素用于臨床治療各種感染性疾病，70多年來(lái)，它挽救了無(wú)數(shù)人的生命，為維護(hù)人類(lèi)的健康立下汗馬功勞。但由于抗生素的不合理使用，導(dǎo)致許多細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。為應(yīng)對(duì)細(xì)菌耐藥性引發(fā)的不良后果，除了致力于篩選對(duì)耐藥菌有效且具有新抗菌譜、新作用機(jī)制的抗生素外，人們開(kāi)始尋找能提高抗生素效能、拮抗細(xì)菌耐藥性的物質(zhì)。黃柏中的小檗堿抗菌譜廣，體外對(duì)多種細(xì)菌具有抑菌作用，關(guān)于小檗堿的抑菌機(jī)制，目前主要有以下幾方面的報(bào)道：①抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性[1]。拓?fù)洚悩?gòu)酶能夠催化DNA鏈的斷裂和結(jié)合，從而抑制細(xì)菌DNA的合成。目前針對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶這一作用位點(diǎn)設(shè)計(jì)具有殺傷腫瘤細(xì)胞的藥物已成為研究的熱點(diǎn)。②拮抗細(xì)菌產(chǎn)生的腸毒素[2]。③降低細(xì)菌對(duì)細(xì)胞的粘附性[3]。④與細(xì)菌核糖體30S亞基結(jié)合影響蛋白質(zhì)的合成[4]。同時(shí)小檗堿還能增強(qiáng)白細(xì)胞及肝網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬能力。本論文主要研究黃柏70%乙醇粗提物與氨芐青霉素聯(lián)合使用時(shí)對(duì)大腸桿菌的體外抑菌效果，旨在為臨床合理利用中草藥、中西醫(yī)結(jié)合治療細(xì)菌感染提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

大腸桿菌(由武漢華夏理工學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供)。

1.1.2 藥物

黃柏(購(gòu)自武漢三九藥店)。

1.1.3 培養(yǎng)基

MHA培養(yǎng)基(購(gòu)自青島海博生物公司)，用于測(cè)定藥物的MIC值；牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，用于制備大腸桿菌菌液；牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基，用于活化大腸桿菌。

1.2 方法

1.2.1 黃柏70%乙醇粗提物的制備

量筒量取378 mL無(wú)水乙醇，加入42 mL蒸餾水，配制成70%的乙醇溶液420 mL。取黃柏藥材適量，粉碎，過(guò)20目篩，稱(chēng)取藥粉20g，用70%乙醇水浴回流提取三次[5]，每次用溶劑140 mL，提取1 h，過(guò)濾，合并三次提取濾液，將濾液置離心機(jī)中，于3000 r/min離心2 min，取上清液加熱濃縮，回收乙醇，直至濃縮液體積為20 mL，相當(dāng)于原黃柏的濃度為1000 mg/mL，將濃縮液裝入試管，塞好棉塞，放入高壓蒸汽滅菌鍋，121 ℃滅菌20 min后，4 ℃冰箱冷藏備用。

1.2.2 大腸桿菌菌液制備

取新鮮培養(yǎng)的大腸桿菌斜面菌種一支，接入含牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置37 ℃搖床200 r/min恒溫培養(yǎng)18 h，加入無(wú)菌蒸餾水調(diào)整大腸桿菌菌液濃度，使其在600 nm處的吸光度為0.4左右，稀釋好的菌液備用。

1.2.3 黃柏70%乙醇粗提物的MIC值測(cè)定

取十支大試管，先各加入8 mL溶化的MHA培養(yǎng)基，然后吸取黃柏70%乙醇粗提物8 mL加入第一支試管，混合均勻后吸出8 mL液體放入第二支試管，依次類(lèi)推，梯度稀釋?zhuān)钡降诎酥г嚬?。第八支試管吸? mL液體丟棄。八支試管所含溶液相當(dāng)于原黃柏質(zhì)量濃度分別為500 g/L,250 g/L,125 g/L,62.5 g/L,31.3 g/L,15.7 g/L,7.8 g/L,3.9 g/L。第九支、第十支試管里只裝8 mLMHA培養(yǎng)基用于制作對(duì)照。十支試管滅菌后，分別倒入已干燥好的無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)凝固使用。在培養(yǎng)皿底部標(biāo)記接種的位置和藥液濃度，接種制備好的大腸桿菌稀釋液。其中第九個(gè)培養(yǎng)皿不接菌作為陰性對(duì)照，第十個(gè)培養(yǎng)皿接菌作為陽(yáng)性對(duì)照。將所有平板倒置放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。

1.2.4 氨芐青霉素的MIC值測(cè)定

用無(wú)菌生理鹽水將氨芐青霉素鈉粉針配制成質(zhì)量濃度為50 g/L的溶液，微孔濾膜過(guò)濾備用。準(zhǔn)備十支已滅菌的裝有9 mLMHA培養(yǎng)基的試管，吸取1 mL 50 g/L的氨芐青霉素加入第一支試管，混合均勻后，從中吸取1 mL溶液加入第二支試管中，以此類(lèi)推，梯度稀釋?zhuān)钡降诎酥г嚬?。第八支試管吸? mL液體丟棄。八支試管中氨芐青霉素的質(zhì)量濃度分別為5 g/L,5×10-1g/L,5×10-2g/L，5×10-3g/L，5×10-4g/L，5×10-5g/L,5×10-6g/L,5×10-7g/L。第九支、第十支試管里只裝9 mLMHA培養(yǎng)基用于制作對(duì)照。將十支試管內(nèi)含物分別倒入已干燥好的無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)凝固使用。在培養(yǎng)皿底部標(biāo)記接種的位置和藥液濃度，接種制備好的大腸桿菌稀釋液。其中第九個(gè)培養(yǎng)皿不接菌作為陰性對(duì)照，第十個(gè)培養(yǎng)皿接菌作為陽(yáng)性對(duì)照。將所有平板倒置放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。

1.2.5 黃柏70%乙醇粗提物與氨芐青霉素聯(lián)用的FIC指數(shù)測(cè)定

取含有黃柏70%乙醇粗提物1/16MIC,1/8MIC,1/4MIC,1/2MIC,MIC，2MIC的MHA培養(yǎng)基，分別與含有氨芐青霉素10-4MIC,10-3MIC,10-2MIC,10-1MIC,MIC,10MIC的MHA培養(yǎng)基，兩兩等量混合，制成36個(gè)聯(lián)合含藥平板。混合后黃柏70%乙醇粗提物相當(dāng)于原黃柏的質(zhì)量濃度為31.3 g/L，15.7 g/L，7.8 g/L，3.9 g/L，1.95 g/L，0.975 g/L,氨芐青霉素終濃度為2.5×10-5g/L，2.5×10-6g/L，2.5×10-7g/L，2.5×10-8g/L，2.5×10-9g/L，2.5×10-10g/L。另制備兩份空白培養(yǎng)基作為陰、陽(yáng)性對(duì)照。接種，待菌液完全吸收后，將38個(gè)培養(yǎng)皿倒置放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，以不能產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的菌落為標(biāo)準(zhǔn)，記錄兩種藥物聯(lián)合使用時(shí)的MIC,根據(jù)公式計(jì)算FIC。當(dāng)FIC指數(shù)小于0.5時(shí)，兩種藥物聯(lián)用表現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)；指數(shù)在0.5～1時(shí)，為累加效應(yīng)；指數(shù)大于1小于2時(shí)，為無(wú)關(guān)效應(yīng)，大于2時(shí)為拮抗效應(yīng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 MIC值測(cè)定結(jié)果

取出平行的一組培養(yǎng)皿及陰陽(yáng)性對(duì)照，觀察有無(wú)肉眼可見(jiàn)菌落。黃柏70%乙醇粗提物的MIC值測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1，質(zhì)量濃度為500 g/L,250 g/L,125 g/L,62.5 g/L,31.3 g/L,15.7 g/L的含藥平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)，表明黃柏70%乙醇粗提物的MIC值為15.7 g/L。氨芐青霉素的MIC值測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2，質(zhì)量濃度為5 g/L,5×10-1g/L,5×10-2g/L，5×10-3g/L，5×10-4g/L，5×10-5g/L的含藥平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)，表明氨芐青霉素的MIC值為5×10-5g/L。

表1 黃柏70%乙醇粗提物的MIC Table 1 The MIC of 70% ethanol crude extract of Cortex Phellodendri

表2 氨芐青霉素的MIC Table 2 The MIC of ampicillin

注："-"代表無(wú)菌落，"+"代表有菌落。Note:"-"means no colony,"+"means colony

2.2 FIC值測(cè)定結(jié)果

取出38個(gè)含藥培養(yǎng)皿，觀察有無(wú)肉眼可見(jiàn)菌落。由表3可知，兩藥聯(lián)用后，黃柏70%乙醇粗提物的MIC為7.8 g/L，為單藥用量的1/2；氨芐青霉素的MIC為2.5×10-8g/L，為單藥用量的1/2000。根據(jù)分級(jí)抑菌濃度計(jì)算公式，F(xiàn)IC指數(shù)=MIC(A組聯(lián)合)/MIC(A組單用)+ MIC(B組聯(lián)合)/MIC(B組單用)，得到FIC指數(shù)約為0.5005，在0.5～1之間，所以黃柏70%乙醇提取物和氨芐青霉素聯(lián)用表現(xiàn)為累加效應(yīng)[6]。

表3 黃柏70%乙醇粗提物和氨芐青霉素的聯(lián)合抑菌結(jié)果 Table 3 Combined inhibition results of 70% ethanol crude extract from cortex phellodendri and ampicillain

注:A藥為黃柏70%乙醇粗提物；B藥為氨芐青霉素。Note:"A" means the 70% ethanol crude extract of cortex phellodendri; "B" means ampicillain.

2.3 討論

黃柏70%乙醇粗提物與氨芐青霉素聯(lián)合使用時(shí)表現(xiàn)累加效應(yīng)，氨芐青霉素的MIC值下降到聯(lián)合用藥之前的1/2000，用量顯著減少?？茖W(xué)選擇中藥與西藥具有藥效互補(bǔ)、療效增強(qiáng)，降低細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生等優(yōu)點(diǎn)。

感染性疾病的發(fā)展進(jìn)程與病原菌、宿主、藥物三者密不可分。藥物對(duì)癥，宿主免疫力強(qiáng)，則病原菌清除的速度就快。部分中草藥中的某些活性成分對(duì)病原微生物有直接抑制作用，如黃柏中的小檗堿已被證明在體外對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性及陰性菌均具有抑菌作用[7]。本試驗(yàn)采用70%乙醇回流提取法制備黃柏粗提液，主要目的是增加粗提液中小檗堿的含量。體外抗菌試驗(yàn)在相對(duì)靜止條件下進(jìn)行的，不受體內(nèi)復(fù)雜因素的影響，結(jié)果只能說(shuō)明藥物對(duì)試驗(yàn)菌的直接抑菌作用，因此MIC值對(duì)指導(dǎo)臨床用藥劑量有一定的參考價(jià)值。另外，部分中藥中的一些活性成分能調(diào)節(jié)機(jī)體平衡，增強(qiáng)免疫力，利于疾病治療。如果要全面評(píng)價(jià)中藥的治療效果，對(duì)動(dòng)物免疫機(jī)能的影響也應(yīng)成為重要考察指標(biāo)。