SIRT3、FOXO3a和E-cadherin在非小細(xì)胞肺癌中的相關(guān)性研究

田亮，郭楠，苗志剛，孔彥，李鯤鵬，張楠

（河北醫(yī)科大學(xué)附屬滄州市中心醫(yī)院，河北 滄州 0 6 1 0 0 0）

0 引言

肺癌是威脅全球人類健康的主要疾病之一，發(fā)病率和死亡率高，預(yù)后差。非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）在肺癌中占比約85%～90%，與其它類型相比，對(duì)治療不敏感[1]。腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是NSCLC主要的致死原因，然而，肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制還沒有定論[2]。很多研究認(rèn)為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。

去乙?；讣易宄蓡T（IRT3）與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。SIRT3可通過調(diào)節(jié)FOXO3a和E-cadherin蛋白表達(dá)，來控制癌細(xì)胞EMT過程。叉頭框蛋白家族成員（FOXO3a）可抑制相關(guān)通路蛋白調(diào)節(jié)EMT。E-cadherin主要介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附反應(yīng)，是EMT過程中的關(guān)鍵因子[3]。本研究結(jié)合臨床病理資料，分別檢測(cè)SIRT3、FOXO3a和E-cadherin蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況，探討在非小細(xì)胞肺癌中的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 患者與組織標(biāo)本

從2012年8月至2016年3月，收集130例滄州市中心醫(yī)院根治術(shù)標(biāo)本，男性79例，女性51例，術(shù)前均未行任何放化療及靶向治療。所有切片按WHO肺癌分型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行復(fù)診[4]，其中鱗狀細(xì)胞癌38例、腺癌92例，高分化68例、中分化38例、低分化24例。TNM分期參照第8版國(guó)際抗癌聯(lián)盟[5]，Ⅰ/Ⅱ期46例、Ⅲ/Ⅳ期84例。每例患者包括腫瘤組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織（距離＞5cm）。所有病人均有完整的隨訪資料。

1.2 免疫組化方法

采用SP方法，組織標(biāo)本先經(jīng)10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋切片，厚度4μm。使用抗體如下：多克隆抗體FOXO3a（兔抗，英國(guó)Abcam），多克隆抗體E-cadherin（鼠抗，中杉金橋），多克隆抗體SIRT3（鼠抗，美國(guó)Genetex）。

1.3 結(jié)果

SIRT3陽(yáng)性定位于細(xì)胞漿/核，F(xiàn)OXO3a陽(yáng)性定位于細(xì)胞核，E-cadherin陽(yáng)性定位于細(xì)胞膜/漿。結(jié)果由兩位高年資病理醫(yī)師雙盲判定，參照標(biāo)準(zhǔn)：按陽(yáng)性率，＜25%=0分、25%～75%=1分、＞75%=2分；按著強(qiáng)度，不著色=0分、弱=1分、中度=2分，強(qiáng)=3分；通過兩種評(píng)分之積來判定，值≥4判定為高表達(dá)，值＜3判定為低表達(dá)[6]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，用Pearson方法分析不同指標(biāo)變量的相關(guān)性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三者在非小細(xì)胞肺癌和癌旁組織中的表達(dá)

SIRT3蛋白在細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)不一，主要位于胞漿，SIRT3在NSCLC中高表達(dá)，腺癌和鱗狀細(xì)胞癌陽(yáng)性率均為100.0%（圖1、圖2），其中鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)尤為明顯，NSCLC陽(yáng)性率顯著高于癌旁組織（P＜0.05）。FOXO3a在非小細(xì)胞肺癌中呈低表達(dá)，其中，鱗狀細(xì)胞癌表達(dá)率為10.5%（4/38），腺癌表達(dá)率為13.0%（12/92）（圖3）。而癌旁正常組織呈陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)率為100.0%（130/130），F(xiàn)OXO3a蛋白在肺癌中明顯低于癌旁組織表達(dá)（P＜0.05）。E-cadherin在支氣管及肺泡上皮細(xì)胞中呈高表達(dá)（圖4），而在NSCLC中表達(dá)明顯呈低表達(dá)，腫瘤組織分化越低，陽(yáng)性率越低。在癌旁正常組織中，E-cadherin表達(dá)率為88.5%（115/130），然而在NSCLC中呈低表達(dá)，其中，鱗狀細(xì)胞癌表達(dá)率為36.8%（14/38），腺癌表達(dá)率為59.8%（55/92），結(jié)果顯示，E-cadherin在肺癌中表達(dá)明顯低于癌旁組織（P＜0.05）。

2.2 三者與臨床病理特征的關(guān)系

分析三者陽(yáng)性率與NSCLC臨床病理資料間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)：三者均與大小、分化級(jí)別、淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期具有相關(guān)性（P＜0.05），而與性別、年齡和組織學(xué)類型無(wú)關(guān)（P＞0.05）

2.3 NSCLC組織中三者蛋白表達(dá)的相關(guān)性

免疫組化法檢測(cè)130例NSCLC腫瘤組織三者蛋白表達(dá)情況：同一NSCLC患者腫瘤組織SIRT3蛋白低表達(dá)，而FOXO3a和E-cadherin蛋白高表達(dá)。SIRT3與FOXO3a蛋白呈負(fù)相關(guān)（r=-0.682，P＜0.05），SIRT3與 E-cadherin蛋白呈負(fù)相關(guān)（r=-0.754，P＜0.05），F(xiàn)OXO3a與E-cadherin表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.561，P＜0.05）。

2.4 NSCLC組織中三者蛋白表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性

對(duì)所有患者進(jìn)行術(shù)后隨訪，SIRT3高表達(dá)患者生存率為38.15%，顯著低于低表達(dá)患者術(shù)后生存率69.81%，SIRT3表達(dá)越高，生存率越低。FOXO3a和E-cadherin在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)則相反，其表達(dá)越低，生存率越高。

圖1 鱗狀細(xì)胞癌組織中SIRT3細(xì)胞漿呈陽(yáng)性表達(dá)（SP X10）

圖2 腺癌組織中SIRT3呈陽(yáng)性表達(dá)（SP X10）

圖3 FOXO3a在腺癌組織中細(xì)胞核呈陽(yáng)性表達(dá)（SP X10）

圖4 E-cadherin在癌旁正常組織中細(xì)胞膜呈陽(yáng)性表達(dá)（SP X10）

3 討論

腫瘤發(fā)生和發(fā)展涉及多種生物學(xué)過程，腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因，其中，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要作用，也與化療藥物耐藥相關(guān)，可以作為臨床判定治療后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的一個(gè)指標(biāo)。

SIRT3又稱線粒體去乙酰酶，定位于11號(hào)染色體，廣泛存在于各種生物體內(nèi)，與機(jī)體腫瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，也參與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移過程。近年來，SIRT3與腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移相關(guān)性研究逐漸受到重視，王峰等[7]在乳腺癌組織中，采用免疫組織化學(xué)方法，并結(jié)合臨床病理資料及預(yù)后分析，得出SIRT3蛋白與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，SIRT3的高表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲。高立明等[8]在胃癌組織中得出SIRT3在胃癌組織中的表達(dá)低于正常胃粘膜組織，提示SIRT3在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能起抑制作用。孫軍等[9]在非小細(xì)胞肺癌組織中得出SIRT3表達(dá)與病理組織分級(jí)有關(guān)，其表達(dá)與腫瘤分化呈負(fù)相關(guān)，而且與腫瘤分期有關(guān)。本文研究結(jié)果顯示，SIRT3蛋白在NSCLC組織中表達(dá)增高，而在癌旁正常組織中表達(dá)降低或陰性表達(dá)。與癌旁組織相比，SIRT3在癌組織的表達(dá)明顯增高，提示SIRT3可能促進(jìn)NSCLC的發(fā)生。SIRT3表達(dá)與臨床分期和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，SIRT3表達(dá)越高，預(yù)后越差，提示SIRT3具有臨床預(yù)后意義。

FOXO3a是一個(gè)抑癌基因，在許多腫瘤中表達(dá)降低。近幾年，F(xiàn)OXO3a與腫瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的相關(guān)研究逐年增多。NiD等[10]在透明細(xì)胞癌細(xì)胞株中，研究發(fā)現(xiàn)FOXO3a丟失，通過SNAIL1上調(diào)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞EMT，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。Cheng CW等[11]在肺癌細(xì)胞株中研究認(rèn)為缺氧誘導(dǎo)因子通過激活EMT增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性，F(xiàn)OXO3a相關(guān)通路失活抑制HIF-1α，間接抑制EMT，從而阻礙腫瘤轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)FOXO3a蛋白在癌旁正常組織高表達(dá)，而在NSCLC組織中表達(dá)明顯降低，因此，F(xiàn)OXO3a在NSCLC中可能扮演了抑癌基因的角色，促進(jìn)了NSCLC浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。

E-cadherin基因位于16q22.1，主要介導(dǎo)同種細(xì)胞間的黏附反應(yīng)，其表達(dá)下降，能促進(jìn)EMT進(jìn)展，與肺腺癌浸潤(rùn)性行為和不良預(yù)后相關(guān)[12]。陳鵬等[13]采用免疫組織化學(xué)方法，得出E-cadherin可能在非小細(xì)胞肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC癌組織中E-cadherin呈低表達(dá)，在癌旁正常組織中高表達(dá)，E-cadherin缺失可能參與了NSCLC浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過程。

三者在其他腫瘤中的相關(guān)性研究也在進(jìn)行，Li等[14]在前列腺癌細(xì)胞株中，通過體內(nèi)和體外研究發(fā)現(xiàn)FOXO3a與SIRT3形成相互作用，SIRT3促進(jìn)FOXO3a依賴基因轉(zhuǎn)錄，認(rèn)為兩者共同參與了EMT，從而促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。SIRT3可使上皮鈣粘素/連環(huán)素復(fù)合體表達(dá)減弱，在分解EMT過程中發(fā)揮了重要作用。郭存存等[15]在結(jié)直腸癌中研究認(rèn)為FOX03a蛋白表達(dá)與wnt信號(hào)通路負(fù)性調(diào)節(jié)因子E-cadherin的表達(dá)呈正相關(guān)。提示FOX03a和E-cadherin可能共同參與了結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)在NSCLC組織中，SIRT3表達(dá)與FOXO3a及E-cadherin表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)OXO3a和E-cadherin表達(dá)越低，SIRT3表達(dá)越高。因而在非小細(xì)胞肺癌中，三者可能共同參與了腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。

總之，腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移可能通過SIRT3介導(dǎo)Wnt信號(hào)通路，并通過FOX03a協(xié)同，三者共同促進(jìn)NCSCLC腫瘤細(xì)胞發(fā)生和發(fā)展，因而檢測(cè)三者的表達(dá)有助于臨床判定預(yù)后，也有望成為非小細(xì)胞肺癌靶向治療新的靶點(diǎn)。