鯽魚細(xì)菌性出血病致病菌的分離鑒定及藥敏研究

祭仲石 韋 艷 厲成新 王中清 吳秀林

鯽魚出血病，一般認(rèn)為由嗜水氣單胞菌引起，嗜水氣單胞菌感染鯽魚后，在魚體質(zhì)變差和水質(zhì)惡化時，在魚體內(nèi)快速增殖，引起全身出血的癥狀。目前治療出血病主要還是依靠投喂抗生素，但生產(chǎn)中多數(shù)養(yǎng)殖戶根據(jù)以往經(jīng)驗使用抗生素，往往效果較差，疾病難以快速治愈，不僅造成養(yǎng)殖戶的損失，還導(dǎo)致鯽魚抗生素超標(biāo)，影響食品安全。

江蘇大豐某鯽魚精養(yǎng)塘口2018年8月初開始發(fā)病，我們?nèi)臃蛛x病原菌并鑒定，對分離的病原菌進行藥敏試驗，以指導(dǎo)養(yǎng)殖戶科學(xué)用藥，得到良好的治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料

發(fā)病鯽魚2018年8月取自大豐鯽魚精養(yǎng)塘口，200g左右，發(fā)病期間出現(xiàn)鯽魚持續(xù)死亡，死亡鯽魚體表充血，腹腔內(nèi)有腹水，初步診斷為鯽魚出血病。試驗用藥敏紙片采購自杭州微生物試劑有限公司；PCRMix、溴化乙錠（EB）、Marker 2000、細(xì)菌基因組提取試劑盒采購自北京艾德萊；用于擴增嗜水氣單胞菌的引物由上海生工合成；微生物培養(yǎng)基為腦心浸液培養(yǎng)基（BHI），pH7.4±0.2，采購自O(shè)XOID。

1.2 致病菌的分離

在超凈工作臺中，用酒精燈灼燒后的接種環(huán)從患病魚肝、腎、腦等組織處取樣，涂布在培養(yǎng)基平皿上，30℃培養(yǎng)24小時。挑選優(yōu)勢菌落接種于斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24 小時，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 回歸攻毒實驗

將分離到的致病菌接種到BHI液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24小時，用生理鹽水將菌液稀釋至108cfu/mL備用。取健康鯽魚60尾，隨機分為兩組，每組30尾。試驗組每尾注射0.2mL菌液，對照組每尾注射0.2mL生理鹽水，飼養(yǎng)10天，每天撈出死亡鯽魚，記錄死亡數(shù)量，并對死亡魚進行細(xì)菌分離。

1.4 致病菌鑒定

按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書，提取從患病鯽魚和攻毒死亡鯽魚上分離到的致病菌DNA，使用嗜水氣單胞菌16S rDNA引物擴增致病菌DNA，正向引物F:GCGGGTACGACGCACCTTGC、逆向引物R:CAGCGTCCAATACCTGGTGTTA，目的片段長度為1091bp，擴增條件為: 94 ℃預(yù)變性4 min， 94 ℃變性50 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s， 30 個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增后，用添加EB的瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳電壓120V、電泳15分鐘。電泳后使用紫外分析儀觀察結(jié)果。

1.5 藥敏試驗

采用紙片瓊脂擴散法（K-B法），在超凈工作臺中，將分離到的致病菌用生理鹽水制備成濃度約107～108cfu/mL細(xì)菌懸濁液，取100μL均勻涂布于BHI平板上，等待15分鐘左右，使細(xì)菌在培養(yǎng)基上定植，然后將不同的藥敏紙片均勻的貼在BHI平板上，30℃培養(yǎng)24小時后，觀察結(jié)果，量取抑菌圈直徑，確定致病菌對各藥物的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 鯽魚出血病的發(fā)病情況

發(fā)病塘口位于江蘇大豐，塘口面積90畝，東西朝向，魚塘四周水泥護坡，水深2～2.5m，進排水配套設(shè)施完善。2018年8月4日開始，開始每天有十幾尾死魚，三天后突然增加到一百多尾，死魚呈典型的出血病狀況，患病魚腹部，鰭條基部等多處充血，魚眼球突出，解剖后腹腔內(nèi)有紅色腹水，腸道充血，腸內(nèi)無食。

2.2 回歸攻毒結(jié)果

將分離到的致病菌編號為HFJY-1，注射到鯽魚體內(nèi)后，第2天開始出現(xiàn)死魚，第5天鯽魚全部死亡，死亡率100%，對照組養(yǎng)殖10天未見死亡，攻毒情況見表1。死亡鯽魚表現(xiàn)出與患病鯽魚相同的癥狀，體表、鰭條基部不同程度出血，解剖可見肝臟腫脹充血，有大量腹水。從攻毒死亡鯽魚肝臟分離的致病菌，與HFJY-1的菌落形態(tài)一致，編號為HFGD-1。

表1 攻毒感染實驗

2.3 致病菌的鑒定

從鯽魚的腎和肝上分離到致病菌，其在BHI培養(yǎng)基上生長較快，24小時后可見明顯菌落，菌落呈圓形，邊緣光滑，淡白色?；疾■a魚和攻毒鯽魚致病菌的PCR電泳圖譜中可以看出，HFJY-1和HFGD-1使用嗜水氣單胞菌引物做PCR，在1000bp位置左右出現(xiàn)明顯亮帶，陰性對照未出現(xiàn)條帶，說明這兩株致病菌是嗜水氣單胞菌。

2.4 致病菌的藥敏分析

使用水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的氟苯尼考、恩諾沙星、強力霉素、硫酸新霉素、土霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明和復(fù)方磺胺嘧啶等8種抗生素對分離到的兩株致病菌進行藥敏實驗，藥敏實驗結(jié)果見表2，結(jié)果表明，分離的嗜水氣單胞菌對恩諾沙星、氟苯尼考敏感，紅霉素、強力霉素、硫酸新霉素和復(fù)方磺胺嘧啶中度敏感，對復(fù)方新諾明和氨芐青霉素耐藥。

3 討論

隨著塘租、飼料、漁藥和人工等成本的逐年增加，養(yǎng)殖戶放養(yǎng)密度越來越高，加上缺少科學(xué)的疾病防控理念，細(xì)菌性疾病暴發(fā)越來越頻繁。我國水產(chǎn)養(yǎng)殖從業(yè)門檻低，多數(shù)的養(yǎng)殖戶缺乏科學(xué)的用藥理念，甚至一些漁藥廠家的業(yè)務(wù)員都不是水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)，簡單培訓(xùn)幾天就指導(dǎo)養(yǎng)殖戶，往往為了利益胡亂指導(dǎo)。甚至還有養(yǎng)殖戶使用抗生素進行細(xì)菌性疾病的預(yù)防，導(dǎo)致各類致病菌產(chǎn)生耐藥性。

鯽魚出血病是危害鯽魚的主要病害之一，隨著多年的抗生素使用，嗜水氣單胞菌已對多種抗生素產(chǎn)生耐藥性。目前，水產(chǎn)上治療細(xì)菌性疾病，主要還是通過投喂抗生素外加潑灑，但如何選擇正確的抗生素成為治療成敗的關(guān)鍵因素。本文結(jié)果表明，嗜水氣單胞菌已對多種抗生素產(chǎn)生不同程度的耐藥性，導(dǎo)致我國水產(chǎn)品抗生素頻頻超標(biāo)，影響我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的健康發(fā)展，這是多年來抗生素的亂用濫用造成的。

表2 各抗生素藥敏結(jié)果

水產(chǎn)從業(yè)者在治療細(xì)菌性疾病時，應(yīng)當(dāng)科學(xué)地選擇抗生素，通過藥敏實驗，選擇最優(yōu)的治療藥物，避免盲目用藥導(dǎo)致疾病無法有效控制。本文發(fā)病塘口在藥敏實驗后，外用潑灑復(fù)合碘兩次，每次間隔一天，并選擇恩諾沙星作為治療藥物，拌服抗生素后，死亡量大大降低，從每天死亡兩百多條到后來幾條，5天后沒有死魚，沒有死魚后繼續(xù)投喂藥餌兩天鞏固治療。在發(fā)生細(xì)菌性疾病時，不能盲目地使用抗生素，要尊重科學(xué)，用科學(xué)的理念指導(dǎo)養(yǎng)殖用藥，真正做到科學(xué)用藥，減緩致病菌耐藥性的產(chǎn)生。