短小芽孢桿菌抗菌代謝物對斑馬魚的毒性研究

■毛林靜 王 瑩 田佳慧 劉可春 王 慧 楚 杰*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院,山東泰安271018；2.齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）生物研究所，山東濟南250014）

短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）屬于芽孢桿菌屬，為革蘭氏陽性菌，是一類重要的生防菌，可以分泌多種抗菌素、抗菌肽和抗菌蛋白等多種抗菌物質(zhì)[1]，并且這些抗菌物質(zhì)的抑菌范圍非常廣[2]，對多種致病病原菌都有明顯的抑制作用。且其繁殖速度很快，可以產(chǎn)生穩(wěn)定芽孢[3]，可以產(chǎn)生極大的抗性[4]，抵抗惡劣的生存環(huán)境[5]。因此，芽孢桿菌在各個方面的實際應用都具有優(yōu)勢。我國畜牧業(yè)發(fā)展趨勢鮮明，已經(jīng)進入了新的發(fā)展階段。農(nóng)場飼養(yǎng)的各種動物，產(chǎn)生的糞便中存在著各種致病菌，不僅使畜禽患病，而且污染環(huán)境。疫病主要由致病菌造成，抑制致病菌已成為從源頭治理畜禽患病的重要舉措。化學殺菌劑對畜禽本身危害頗大，不宜長期使用，排入下水道也會對水體造成污染，進而威脅人類健康，而芽孢桿菌具有廣譜抗菌、高效、安全、不易產(chǎn)生耐藥性、易降解等特點，可以實現(xiàn)廢棄物（糞便）無害化和資源化，有利于衛(wèi)生防疫。

斑馬魚，又名藍條魚、花條魚、斑馬丹尼魚，原產(chǎn)于印度、孟加拉國。由于斑馬魚基因與人類基因的相似度達到87%[6]，這使得斑馬魚成為一種可以模擬人體的絕佳模式生物，可以用于多數(shù)的人體藥物實驗，目前已經(jīng)成為遺傳學和毒理學研究的重要模式生物[7-8]，斑馬魚胚胎透明，便于觀察藥物對其體內(nèi)器官的影響。此外，其具有發(fā)育快、易于實驗室飼養(yǎng)、繁殖量大、適應環(huán)境能力強等優(yōu)點，在不喂食情況下96 h 死亡率不超過5%，以排除自然死亡的干擾，實驗更具真實性，故適合用于96 h 凈水實驗[9]。

前期試驗得出，短小芽孢桿菌發(fā)酵液對豬大腸桿菌、雞沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌等多種致病菌均具有明顯的抑制作用；但對其活性成分結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，該短小芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)屬于脂醇類小分子化合物，目前，關(guān)于短小芽孢桿菌抗菌代謝物的急性毒性研究鮮有報道，本研究基于斑馬魚的諸多優(yōu)點，依據(jù)《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》進行魚類急性毒性試驗[10]。通過觀察其存活情況、行為學特征及相關(guān)抗氧化酶活性指標的測定，研究該短小芽孢桿菌抗菌代謝物的急性毒性，為在畜牧業(yè)中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙酸乙酯分析純；LB肉湯培養(yǎng)基，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶試劑盒、丙二醛試劑盒、乙酰膽堿酯酶試劑盒、超微量Na+K+-ATP酶試劑盒，南京建成有限公司；斑馬魚實驗用水，山東省科學院生物研究所藥物篩選平臺提供。

全波長酶標儀，美國DYNEX Spectra MR(用于測定吸光度)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；氮吹儀，上海精密儀器儀表公司；壓力蒸汽滅菌筒GB 150.1-4-2011 型，上海東亞壓力容器制造有限公司；振蕩培養(yǎng)箱ZQZY-AFB 型，上海知楚儀器有限公司；低速大容量離心機，上海安亭科學儀器廠；數(shù)顯恒溫水浴鍋。

1.2 受試菌株

短小芽孢桿菌（由白俄羅斯國家科學院微生物研究所引進）。

1.3 受試生物

本研究中選用斑馬魚為AB 野生品系（由山東省科學院生物研究所藥物篩選平臺提供），體態(tài)正常，行為活躍，平均每條體重0.8～1.0 g，雌雄隨機。采用凈水實驗法[11]，試驗前將試驗用魚先在實驗室環(huán)境下飼養(yǎng)7 d，每日正常飼喂飼料，更換新鮮魚水，并及時清除糞便和食物殘渣。試驗前24 h停止喂食，以96 h為一個周期，觀察周期內(nèi)魚的行為變化。試驗期間及時去除死亡魚體，防止腐爛污染水體。

1.4 短小芽孢桿菌抗菌物質(zhì)粗提物制備

短小芽孢桿菌發(fā)酵液，離心取上清液，旋蒸濃縮10 倍，根據(jù)實驗室之前萃取試驗條件，選擇乙酸乙酯與發(fā)酵濃縮液按1∶1 萃取，萃取三次，合并萃取液，旋蒸濃縮至2～3 ml，使用氮吹儀將殘留乙酸乙酯吹干，過硅膠柱，用不同梯度有機溶劑洗脫，含活性成分部分洗脫液濃縮，干燥，最后用無菌水稀釋50倍制成母液，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 梯度設(shè)計

根據(jù)預試驗結(jié)果，斑馬魚對短小芽孢桿菌抗菌代謝物的耐受濃度為6 mg/l，因此試驗設(shè)計8 個梯度（0.3、0.6、0.9、1.5、3.0、6.0 mg/l）和空白對照，每濃度組放入8尾魚，設(shè)三個平行[12]，每組添加的魚水和藥劑總量為800 ml。

1.6 斑馬魚相關(guān)生化指標測定

暴露處理96 h后，將斑馬魚活體解剖，取頭部（去除心臟）、軀干組織，在冰浴條件下按1∶9（魚體質(zhì)量分數(shù)0.9%生理鹽水體積）的比例加入預冷的生理鹽水，在勻漿器中勻漿，制備成10%勻漿液。勻漿液在4 ℃、15 000 r/min條件下離心20 min，上清液采用南京建成試劑盒測定超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、乙酰膽堿酯酶（AchE）和Na+K+-ATP酶的活性。

1.7 數(shù)據(jù)處理

本試驗所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 20 進行統(tǒng)計學顯著性分析，采用單因素t 檢驗，認為當P＜0.05 時，具有顯著性。

2 結(jié)果與結(jié)論

2.1 短小芽孢桿菌抗菌代謝物對斑馬魚形態(tài)學和死亡現(xiàn)象觀察

試驗觀察，將斑馬魚放入含6 mg/l代謝物的魚水中時，立即出現(xiàn)呼吸急促，魚鰭張開并充血，且游速加快并上浮，1 h 內(nèi)開始出現(xiàn)斑馬魚死亡，7 h 后斑馬魚全部死亡；經(jīng)解剖觀察，肝臟損傷嚴重，腸道積存黃色液體。濃度組1.5 mg/l和3 mg/l亦出現(xiàn)魚的死亡，12～24 h是斑馬魚死亡的集中時間段，不同時間條件下，各濃度組斑馬魚的死亡率(死亡率=死亡試驗魚數(shù)/試驗魚總數(shù)×100%)見表1。在1.5 mg/l濃度下存活的斑馬魚經(jīng)過死亡高峰期，適應環(huán)境后無異樣發(fā)生，解剖得部分斑馬魚出現(xiàn)肝臟缺失、心包水腫等現(xiàn)象。在低濃度0.3、0.6 mg/l 和0.9 mg/l 下沒有斑馬魚死亡。總之，代謝物中毒現(xiàn)象表現(xiàn)為呼吸急促，鰓外翻充血，并上下反復竄游，也有浮頭現(xiàn)象出現(xiàn)。以上現(xiàn)象均說明，代謝物濃度越高，對機體損傷越大，機體應激反應越激烈。

表1 不同試驗時間斑馬魚死亡情況（%）

2.2 半致死濃度（LC50）

斑馬魚急性毒性試驗96 h 的LC50值以及95%的置信限由統(tǒng)計軟件SPSS 20計算而得。計算得代謝物半致死濃度LC50為1.606 mg/l，95%置信區(qū)間為1.207～2.199 mg/l（見表2），參照國家環(huán)保局制訂的《生物技術(shù)監(jiān)測規(guī)范（水環(huán)境部分）》中對毒物的分類（見表3），代謝物對斑馬魚的毒性屬于中毒[13]。對照組中斑馬魚的死亡率為0。

表2 短小芽孢桿菌代謝物對斑馬魚96 h的半致死濃度

表3 毒物對魚類的毒性標準

2.3 短小芽孢桿菌抗菌代謝物對斑馬魚不同組織相關(guān)酶活力的影響

2.3.1 短小芽孢桿菌抗菌代謝物對斑馬魚軀干組織丙二醛（MDA）含量的影響

利用硫代苯巴比妥法（TBA 法）測得各濃度組代謝物中軀干MDA含量如圖1所示。與對照組相比，短小芽孢桿菌代謝物濃度在低于0.9 mg/l 的情況下，對MDA 的含量沒有顯著的影響。但是，當短小芽孢桿菌代謝物濃度達到1.5 mg/l濃度以上時，MDA的含量顯著性增加。

丙二醛(MDA)是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，生物機體在受到外界不良因素刺激時，會通過酶或非酶系統(tǒng)產(chǎn)生自由基，自由基會攻擊生物膜產(chǎn)生丙二醛等脂質(zhì)過氧化物，丙二醛含量間接反映了機體受到損傷的程度。它的產(chǎn)生會加劇膜的損傷，因此可通過檢測MDA 的含量來了解膜脂過氧化的程度[14]。圖1 結(jié)果表明短小芽孢桿菌代謝物濃度達到1.5 mg/l 時，機體內(nèi)MDA 積累量出現(xiàn)顯著性增加。當代謝物濃度在0.3、0.6、0.9 mg/l 時，均未對MDA 的含量產(chǎn)生影響。所以，我們得出短小芽孢桿菌代謝物超過一定濃度時會對機體造成損傷。

圖1 斑馬魚96 h軀干MDA含量的影響

2.3.2 短小芽孢桿菌抗菌代謝物對斑馬魚軀干組織超氧化物歧化酶（SOD）酶活力的影響

利用SOD 試劑盒（WST-1 法）測各濃度組軀干總SOD酶活力如圖2。

圖2 斑馬魚96 h軀干SOD酶活力的影響

機體在外界環(huán)境變化時會產(chǎn)生應激反應，產(chǎn)生超氧陰離子自由基(O2-·)[15]，SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，是一類敏感的分子生態(tài)毒理學指標，它可催化超氧陰離子與氮離子反應生成過氧化氨，從而解除活性氧對機體的損傷作用，當環(huán)境脅迫達到一定程度時生物體內(nèi)SOD活性通常會降低，從而導致活性氧產(chǎn)生細胞毒性，及脂質(zhì)過氧化，損傷細胞膜，引起炎癥，腫瘤和自身免疫性疾病，并可能促使機體衰老；由圖2可知，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著代謝物濃度（0.3、0.6、0.9 mg/l）的增加，SOD的酶活力呈增加趨勢（P＞0.05），可以清除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，對機體具有一定的保護作用；但當代謝物濃度達到1.5 mg/l以上時，與對照組相比，SOD的酶活力顯著或極顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），機體修復能力下降。因此，當代謝物濃度達到一定時，造成機體損傷，從而產(chǎn)生魚體死亡。

2.3.3 短小芽孢桿菌抗菌代謝物對斑馬魚頭部組織乙酰膽堿酯酶AchE酶活力的影響

利用乙酰膽堿酯酶試劑盒測試各濃度組頭部AchE酶活力如圖3所示。

圖3 斑馬魚96 h頭部AchE酶活力的影響

由圖3 可知，代謝物在低濃度時，AchE 酶活力呈增加趨勢（P＞0.05），但隨著代謝物濃度的升高，AchE 酶 活 力 顯 著 或 極 顯 著 降 低（P＜0.05 或P＜0.01）。乙酰膽堿酯酶可參與神經(jīng)調(diào)節(jié)、肌肉運動、大腦思維記憶等功能[16]，測試斑馬魚頭部乙酰膽堿酯酶活力，可以評價該代謝物的神經(jīng)毒性。圖3 表明隨著藥劑濃度增大，抑制乙酰膽堿酯酶活力的能力隨之增加，機體受損程度隨濃度加大而加重。這干擾了斑馬魚體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的作用，從而表現(xiàn)出試驗中的S 型扭曲游動，游速加快，并出現(xiàn)撞壁現(xiàn)象等神經(jīng)中毒現(xiàn)象。由于肝臟是合成AchE 的唯一器官，這與解剖中看到的肝臟受損嚴重是一致的。

2.4 短小芽孢桿菌抗菌活性物質(zhì)對斑馬魚頭部組織Na+K+-ATPase酶活力的影響

利用Na+K+-ATPase 試劑盒測試各濃度組頭部Na+K+-ATPase酶活力見圖4。

圖4 結(jié)果顯示，0.3、0.6、0.9 mg/l 的代謝物濃度對Na+K+-ATPase 的酶活力無顯著影響（P＞0.05）。但隨著代謝物濃度增加（1.5、3、6 mg/l），Na+K+-ATPase 的酶活力極顯著增加（P＜0.01）。Na+K+-ATPase 是存在于組織細胞及細胞器的膜上的一種蛋白，在物質(zhì)運送、能量轉(zhuǎn)換及信息傳遞方面具有重要的作用，魚類的氯細胞主要分布于腮絲上皮內(nèi)，氯細胞中含有大量的線粒體，而膜上有豐富的Na+K+-ATPase，這是細胞內(nèi)外離子轉(zhuǎn)運的結(jié)構(gòu)。代謝物達到一定濃度時，對機體產(chǎn)生生理毒性（如圖1），使SOD 的酶活力降低（如圖2），從而造成氧化損傷，導致生物膜的脂質(zhì)過氧化（如圖3），生物膜損傷會導致細胞滲透壓的紊亂，因此Na+K+-ATPase 酶活力增加來維持細胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)（如圖4）。

圖4 斑馬魚96 h頭部Na+K+-ATPase酶活力的影響

3 討論

根據(jù)本試驗結(jié)果，斑馬魚在短小芽孢桿菌抗菌代謝物濃度為0、0.3、0.6、0.9、1.5、3、6 mg/l 條件下，96 h 死亡率依次為0%、0%、0%、0%、62.5%、87.5%、100%。從表1 可以看出，在96 h 內(nèi)，在一定的濃度范圍內(nèi)，抗菌代謝物對機體并沒有造成損傷，這與抗菌代謝物在環(huán)境中對致病菌具有一定抑制作用，從而間接的凈化魚體腸道健康，增加魚體抵抗力，維持正常代謝與生命活動。這從圖2、圖3 的結(jié)果中可以看到。但隨著時間及濃度的增加，抗菌代謝物對斑馬魚的毒性作用開始明顯，并有明顯的時間效應、濃度效應關(guān)系，這是因為代謝物濃度過高，不但對致病菌產(chǎn)生抑制作用，并且對一般環(huán)境及魚體腸道內(nèi)的正常菌群也起到一定抑制作用，從而破壞了腸道整體菌群失衡，造成抵抗力下降，機體內(nèi)各種生物酶活力受代謝物影響，MDA 含量、Na+K+-ATP 酶活力上升，SOD、乙酰膽堿酯酶活力下降，說明機體應激反應以自我保護的能力下降，不足以維持自身正常穩(wěn)態(tài)而受到不同程度的損傷。神經(jīng)系統(tǒng)、腦組織、肌肉組織等許多器官功能發(fā)生改變，甚至受損，從而影響改變了斑馬魚的行為變化，導致魚呼吸急促、運動機能減弱，最終導致窒息死亡[17]。