順鉑聯(lián)合黃芪甲苷對C6膠質(zhì)瘤小鼠凋亡基因的影響

常笑語 黃可欣 李蘊潛

(1吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長春 130021；2吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室)

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)腫瘤中最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率占顱內(nèi)腫瘤首位，預(yù)后差、存活率低〔1，2〕。目前治療膠質(zhì)瘤的主要手段是手術(shù)治療，但因為膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長，手術(shù)根除率差，故術(shù)后常配合放療和化療。順鉑是人工合成的一種含鉑類物質(zhì)的常用化療藥物，能與細(xì)胞內(nèi)的微管蛋白結(jié)合，抑制細(xì)胞有絲分裂，從而達到抑制癌細(xì)胞發(fā)展的作用〔3，4〕；黃芪甲苷能抑制腫瘤增殖、侵襲，促進腫瘤細(xì)胞凋亡，增強機體免疫功能〔5〕。因此，本研究將順鉑和黃芪甲苷聯(lián)合用藥，觀察聯(lián)合用藥治療膠質(zhì)瘤相比順鉑、黃芪甲苷單獨用藥是否具有優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1實驗儀器與試劑 Epoch酶標(biāo)儀(美國)、PCR擴增儀(美國)、實時熒光定量儀(美國)。順鉑，山東齊魯制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20073652；小牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)；DMEM營養(yǎng)液(美國Gibco公司)；黃芪甲苷，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號ZL1303325YY；BALB/c 小鼠Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3酶聯(lián)免疫試劑盒由長春鼎國生物有限公司提供；Trizol、引物、RT-PCR試劑盒由上海生物工程有限公司提供。

1.2動物分組和模型制備 BALB/c小鼠40只，體重20～22 g。隨機分為腫瘤對照組、順鉑組、黃芪甲苷組、聯(lián)合用藥組(聯(lián)合應(yīng)用順鉑及黃芪甲苷)，每組10只。制備2×106個/20 μl的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞懸液，接種于小鼠右前肢腋窩皮下，約7 d待腫瘤長至50～70 mm3時，給予治療。

1.3藥物配制和給藥方法 順鉑2 mg/kg(配制成2 ml/200 g)，腹腔注射1次/3 d；黃芪甲苷12 g/kg(配制成1 ml/200 g)，灌胃1次/d；連續(xù)治療21 d。

1.4標(biāo)本采集 實驗結(jié)束次日處死動物，眼球取血分離血清(3 000 r/min，10 min)，剪下腫瘤組織，-80℃保存待測。

1.5檢測指標(biāo)

1.5.1各組Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3蛋白含量檢測 腫瘤組織懸液制備，按重量(g)∶體積(ml)=1∶9的比例，2 500 r/min離心10 min取上清液。血清和腫瘤組織上清液檢測均采用雙抗體夾心法，設(shè)定空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測樣品孔，嚴(yán)格按照試劑盒流程操作。

1.5.2各組Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3 mRNA水平檢測 Trizol提取血清和腫瘤組織RNA，每個樣本基因擴增3次，行實時熒光定量PCR檢測Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3 mRNA水平，取Ct值均值，采用2-ΔΔCt表示目的基因相對表達水平。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組血清中Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3蛋白含量和mRNA水平比較 與腫瘤對照組比較，黃芪甲苷組、順鉑組、聯(lián)合用藥組血清中Bcl-2、Survivin蛋白含量和mRNA水平均明顯依次降低，Bax、Caspase-3蛋白含量和mRNA水平均明顯依次升高，組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，聯(lián)合用藥組作用尤為顯著，見表1。

2.2各組腫瘤組織中Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3蛋白含量和mRNA水平比較 與腫瘤對照組比較，黃芪甲苷組、順鉑組、聯(lián)合用藥組腫瘤組織中Bcl-2、Survivin蛋白含量和mRNA水平均明顯依次降低，Bax、Caspase-3蛋白含量和mRNA水平均明顯依次升高，組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，聯(lián)合用藥組作用尤為顯著，見表2。

表1 各組血清中Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3蛋白含量和mRNA水平比較

與腫瘤對照組比較：1)P<0.05；與聯(lián)合用藥組比較：2)P<0.05；與順鉑組比較：3)P<0.05；下表同

表2 各組腫瘤組織中Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3蛋白含量和mRNA水平比較

3 討 論

腫瘤是大量腫瘤細(xì)胞聚集形成的異物腫塊，其中惡性腫瘤因其復(fù)雜難治愈被列為世界五大疑難雜癥之一，目前治療惡性腫瘤的主要手段是手術(shù)治療及術(shù)后配合放療和化療〔2，5〕。膠質(zhì)瘤對放療的敏感度低，多數(shù)術(shù)后采用化療輔助，化療藥物有多種，如阿霉素、紫杉醇、替莫唑胺及順鉑等。長期或者大量使用化療藥物會對機體產(chǎn)生心臟、肝臟、腎臟等方面的毒性作用。因此，尋找抗耐藥性、提高抗腫瘤作用及降低臟器毒性損傷的藥物尤為重要〔2，6〕。

Bcl-2、Survivin是抑制凋亡基因，Bcl-2參與組織發(fā)育，細(xì)胞自噬、遷移、凋亡及骨架形成等，通過調(diào)節(jié)線粒體外膜通透性和鈣信號調(diào)控凋亡〔7,8〕；Survivin是目前發(fā)現(xiàn)分子量最小的抑凋亡基因，它能促進細(xì)胞有絲分裂，在細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、染色體移動中發(fā)揮重要作用，在胚胎組織外的正常組織中基本不表達〔9,10〕。Bax、Caspase-3都是促進凋亡基因，Bax定位于人染色體19q13上，當(dāng)受凋亡信號刺激時Bax從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體，和Bcl-2結(jié)合發(fā)揮促凋亡作用〔11,12〕；Caspase-3能降解多種蛋白底物、阻滯細(xì)胞周期、裂解細(xì)胞結(jié)構(gòu)、破壞機體平衡狀態(tài)和修復(fù)機制，受Survivin的直接或間接抑制，還能降解Bcl-2發(fā)揮促凋亡作用〔11～13〕。

以往研究〔1，4〕表明，納米載藥、化療藥物聯(lián)合用藥提高抗腫瘤作用和抗耐藥性作用顯著，其作用機制是靶向治療和藥物互補。順鉑是人工合成的一類金屬化療藥物，它與細(xì)胞內(nèi)的微管蛋白結(jié)合，抑制腫瘤細(xì)胞的有絲分裂，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖〔2〕；黃芪甲苷具有增效減毒的作用，被廣泛應(yīng)用于癌癥的術(shù)后治療及康復(fù)〔5，14,15〕。本研究結(jié)果顯示，黃芪甲苷與順鉑聯(lián)合用藥作用明顯優(yōu)于單獨用藥，為黃芪甲苷在腫瘤化療中的推廣奠定了實驗基礎(chǔ)。