類志賀鄰單胞菌的檢測(cè)方法概述

陳美群，扎西拉姆，潘瑛子

(西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)研究所,西藏 拉薩 850032)

類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides))是一種革蘭氏陰性、氧化酶陽(yáng)性的運(yùn)動(dòng)性桿菌，隸屬腸桿菌科(Enterobacteriaceae)鄰單胞菌屬(PlesiomonasHabs and Schubert,1962)內(nèi)唯一的一個(gè)種[1]。該菌是一種全球性分布細(xì)菌，池塘、淡水，地表水等水體是其主要生活環(huán)境，而水生動(dòng)物尤其魚(yú)類是其主要宿主[2-12]。同時(shí)，該菌是一種人-獸共患病原菌[13]，被認(rèn)為是通過(guò)水和食物傳播的胃腸道感染暴發(fā)的病原體[14-15]，該菌可引起急性腸胃炎、腹瀉等癥狀，還可以引起腦膜炎、敗血癥、蜂窩組織炎、肺炎等腸外感染癥狀[16-24]，為此受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。引起魚(yú)類患病的致病菌種類繁多，而且有些患病魚(yú)類發(fā)病的相似癥狀是由不同病原菌引起的，此外同種致病性類志賀鄰單胞菌在不同魚(yú)種中發(fā)病的癥狀也會(huì)有差異，加之類志賀鄰單胞菌引起魚(yú)類發(fā)病愈加頻繁，往往由于不能及時(shí)鑒定病原菌而延誤治療，不僅給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失，而且也給消費(fèi)者帶來(lái)了一定的健康安全隱患。為此快速、準(zhǔn)確的鑒別出病原菌，并有針對(duì)性的選擇對(duì)癥藥物進(jìn)行防治顯得尤為重要。目前，對(duì)類志賀鄰單胞菌的常用檢測(cè)診斷方法主要分為以下三大類。

1 傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)

1.1 選擇性培養(yǎng)基法

Miller[25]和Levin[26]比較了2種固體培養(yǎng)基(PL和IBB)對(duì)水生樣品中類志賀鄰單胞菌的分離和恢復(fù)效果，研究發(fā)現(xiàn)在競(jìng)爭(zhēng)微生物水平較低的樣品或已受到低溫、高溫等損傷的樣品中，使用PL培養(yǎng)基回收類志賀鄰單胞菌效果較好；而對(duì)于雜菌高度污染的樣品，使用IBB培養(yǎng)基對(duì)類志賀鄰單胞菌的回收率會(huì)更高。Freund 等[27]對(duì)5種不同的富集方法(革蘭氏陰性肉湯、堿性蛋白胨水、無(wú)碘四硫酸鹽肉湯和兩種單胞菌肉湯)與淡水樣品直接涂布法進(jìn)行了比較，結(jié)果表明四硫酸鹽肉湯對(duì)類志賀鄰單胞菌的回收率明顯高于其他四種肉湯(P<0.05)，且也明顯高于直接涂布法，建議在常規(guī)檢測(cè)類志賀鄰單胞菌時(shí)，在直接涂布前使用四硫酸鹽肉湯在40 ℃進(jìn)行富集培養(yǎng)。Huq等[28]比較了3種培養(yǎng)基(PDA、IBB、MSS)在不同溫度下對(duì)類志賀鄰單胞菌和氣單胞菌屬細(xì)菌的分離效果，研究發(fā)現(xiàn)有氣單胞菌存在的情況下，選擇PDA培養(yǎng)基于44 ℃孵育24 h后類志賀鄰單胞菌分離效果較好。由于類志賀鄰單胞菌與氣單胞菌具有一些共同的特性，并且此二菌在一些腸道培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)相似，難以區(qū)別，為了篩選出一種制作簡(jiǎn)單，便于觀察，可提高類志賀鄰單胞菌分離率及準(zhǔn)確率的培養(yǎng)基，李槿年[29]比較了類志賀鄰單胞菌和嗜水氣單胞菌在5種不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況及菌落特性，發(fā)現(xiàn)改良去氧膽酸鈉瓊脂(改良DC)分離效果最好。為了提高類志賀鄰單胞菌的檢出率，王素秋等[30]選擇了幾種常用的增菌液和4種選擇性分離用培養(yǎng)基，對(duì)該菌的檢出效果進(jìn)行了比較，結(jié)果表明使用雙倍堿性胨水和氯化鍶胨水兩次增菌后，再用改良DC平板分離效果最佳，比常規(guī)檢測(cè)法的檢出率提高了幾十倍，具有顯著性意義。

表1 類志賀鄰單胞菌的部分選擇性分離培養(yǎng)基

1.2 生理生化鑒定技術(shù)

傳統(tǒng)生理生化鑒定技術(shù)是依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)手冊(cè)》或《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)學(xué)鑒定手冊(cè)》等，結(jié)合形態(tài)及一些生理生化反應(yīng)特征來(lái)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定[31]。傳統(tǒng)生理生化鑒定技術(shù)結(jié)果準(zhǔn)確、可信度較高，但是檢測(cè)項(xiàng)目多、耗時(shí)長(zhǎng)，不利于細(xì)菌性疾病的快速診斷與防治。為此，一些依賴于全部或部分測(cè)定生化反應(yīng)指標(biāo)的編碼鑒定法以及自動(dòng)化鑒定系統(tǒng)被逐漸開(kāi)發(fā)出來(lái)。李槿年[32]采用國(guó)產(chǎn)革蘭氏陰性桿菌編碼鑒定系列培養(yǎng)基對(duì)28 株分離自安徽省內(nèi)養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病魚(yú)、鱉、蟹等水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)的致病細(xì)菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示2株細(xì)菌未能得到鑒定外，其余26株細(xì)菌均可鑒定到屬或種水平，可鑒定率為92.86 %，該編碼鑒定法比傳統(tǒng)生理生化鑒定法操作更為簡(jiǎn)便、快速(24～48 h)和準(zhǔn)確，同時(shí)又克服了自動(dòng)化鑒定系統(tǒng)需要昂貴儀器的缺點(diǎn)，因此具有較高的實(shí)用價(jià)值。根據(jù)相關(guān)報(bào)道，目前主要應(yīng)用API細(xì)菌鑒定系統(tǒng)[33]、ID32E微量多項(xiàng)試驗(yàn)鑒定系統(tǒng)[34]、BD PhoenixTM-100 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)[35]、ATB 細(xì)菌鑒定儀[36]、GYZ-15eV 生化檢測(cè)試劑盒和BIOLOG 自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)[37]等自動(dòng)化鑒定系統(tǒng)對(duì)類志賀鄰單胞菌進(jìn)行生化鑒定，自動(dòng)化鑒定系統(tǒng)具有快捷、準(zhǔn)確、靈敏、高效等優(yōu)點(diǎn)，但自動(dòng)化鑒定儀價(jià)格昂貴，一般基層單位難以推廣應(yīng)用。

2 免疫學(xué)診斷技術(shù)

免疫學(xué)診斷技術(shù)主要是通過(guò)利用抗原抗體間的特異性反應(yīng)而開(kāi)發(fā)的一系列病原檢測(cè)技術(shù)，由于該技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、可快速檢測(cè)病原等特點(diǎn)，在魚(yú)類疾病診斷中得到廣泛應(yīng)用。張新艷[38]研究制備了兔抗類志賀鄰單胞菌血清，效價(jià)為1∶1.28×105，并建立了間接ELISA(酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn))檢測(cè)方法，檢測(cè)靈敏度為1.0×104CFU·mL-1，制備的多克隆抗體具有良好的檢測(cè)特異性，與其它弧菌科水產(chǎn)常見(jiàn)病原菌均無(wú)交叉反應(yīng)，可用于特異性檢測(cè)類志賀鄰單胞菌，為該菌的快速檢測(cè)和疾病的早期診斷與治療提供了研究基礎(chǔ)。

3 分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

分子生物學(xué)技術(shù)是通過(guò)鑒定病原核酸來(lái)確認(rèn)病原體，該方法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，而傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性和重復(fù)性較差，因此分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)可以起到很好的補(bǔ)充作用。隨著DNA提取技術(shù)的完善、PCR技術(shù)的日益成熟以及各種分子探針標(biāo)記的發(fā)展，由此建立起的以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR技術(shù))、核酸雜交技術(shù)、序列對(duì)比技術(shù)及熒光定量PCR技術(shù)等為代表的多種分子生物學(xué)檢測(cè)方法的應(yīng)用越發(fā)廣泛。

DNA酶和蛋白酶會(huì)降低DNA的擴(kuò)增水平，據(jù)有關(guān)報(bào)道甲醛能破壞組織樣本中的DNA酶和蛋白酶[39-42]。在PCR反應(yīng)中添加牛血清白蛋白(BSA)可提高PCR反應(yīng)產(chǎn)物的擴(kuò)增[43-44]，BSA和DNA純化均略有降低PCR抑制，但是，每個(gè)PCR反應(yīng)中添加的BSA的量應(yīng)該優(yōu)化。 Levin等[45]研究了不同的處理方法(添加甲醛、添加BSA和DNA純化)對(duì)PCR定量檢測(cè)蛤蚌和牡蠣中類志賀鄰單胞菌的影響，研究表明在未富集的蛤蚌組織中檢測(cè)到類志賀鄰單胞菌的水平為200 CFU/g，而在PCR反應(yīng)或DNA純化體系中加入0.1 %牛血清白蛋白(BSA)，檢測(cè)水平降低到60 CFU/g；未富集的牡蠣組織樣本對(duì)PCR反應(yīng)有明顯抑制作用，類志賀鄰單胞菌的檢測(cè)水平為6×105CFU/g，在牡蠣組織勻漿中加入4.0 %甲醛后，大大降低了PCR抑制，檢測(cè)水平下降到6×102CFU/g；DNA純化或BSA均略微提高了PCR的靈敏度，檢測(cè)水平下降到2×105CFU/g；甲醛+ BSA、甲醛+ DNA純化、甲醛+ BSA + DNA純化處理組合，牡蠣組織中類志賀鄰單胞菌的檢測(cè)水平均為2×102CFU/g。Levin等[46]又研究了通過(guò)甲醛處理牡蠣組織勻漿、差速離心和包埋有熒光假單胞菌的活性炭處理樣品去除PCR抑制劑的創(chuàng)新方法，用于實(shí)時(shí)PCR定量檢測(cè)牡蠣中類志賀鄰單胞菌，結(jié)果表明甲醛或涂層炭處理牡蠣組織樣品均可顯著降低PCR抑制，先用甲醛處理樣品，再用覆膜炭處理牡蠣樣品，可進(jìn)一步降低了PCR抑制，使每克樣品的最低檢測(cè)水平為1×103個(gè)基因組目標(biāo)，相當(dāng)于每RT-PCR檢測(cè)水平為25個(gè)基因組目標(biāo)。

Gonzalez-Rey等[47]研究發(fā)現(xiàn)類志賀鄰單胞菌23S rRNA基因(C-906, G-1189)具有較高的變異性，針對(duì)該區(qū)域設(shè)計(jì)得兩條引物能夠區(qū)分類志賀鄰單胞菌和變形桿菌、弧菌、氣單胞菌等在基因上密切相關(guān)的細(xì)菌種類，利用該引物對(duì)水生環(huán)境、動(dòng)物和人類腹瀉病例中的類志賀鄰單胞菌進(jìn)行特異性檢測(cè)效果較好。張新艷等[48]通過(guò)比對(duì)已知類志賀鄰單胞菌與弧菌屬、氣單胞菌屬的23S rRNA序列，設(shè)計(jì)了類志賀鄰單胞菌特異引物PS23F(5’-CTCCGAATACCGTAGAGTGCTATCC-3’)，PS23R(5’-CTCCCCTAGCCCAATAACACCTAAA-3’)，對(duì)類志賀鄰單胞菌和弧菌科水產(chǎn)常見(jiàn)致病菌進(jìn)行特異性擴(kuò)增，只有類志賀鄰單胞菌擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性、其他菌株擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。Herrera等[49]針對(duì)類志賀鄰單胞菌 hugA 基因設(shè)計(jì)了一組特異性引物，研究表明該特異性引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度435 bp，對(duì)魚(yú)肉中類志賀鄰單胞菌檢測(cè)效果較好。孟雙等[50-51]以類志賀鄰單胞菌hugA基因?yàn)榘悬c(diǎn)，設(shè)計(jì)了環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)方法，該方法可快速、特異、靈敏地檢測(cè)類志賀鄰單胞菌，對(duì)33株非類志賀鄰單胞菌菌株均未檢出，同時(shí)該方法的靈敏度比普通聚合酶鏈反應(yīng)高100倍，是一種快速、靈敏的類志賀鄰單胞菌檢測(cè)方法。

熒光定量PCR是通過(guò)熒光標(biāo)記的特異性探針或熒光染料，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度。孟雙等[52]于2011年將熒光探針運(yùn)用到類志賀鄰單胞菌的檢測(cè)，根據(jù)類志賀鄰單胞菌特異性較高的23S rRNA基因5’端序列設(shè)計(jì)了TaqMan探針，建立了類志賀鄰單胞菌實(shí)時(shí)熒光TaqMan PCR快速檢測(cè)方法，該方法對(duì)類志賀鄰單胞菌基因組的檢測(cè)靈敏度為3×10-2pg/反應(yīng)體系，該檢測(cè)體系在檢測(cè)30 種其他腸道致病菌時(shí)均未產(chǎn)生特異性擴(kuò)增，該實(shí)時(shí)熒光TaqMan PCR檢測(cè)體系具有靈敏度高、特異性好、快速等優(yōu)點(diǎn)。陳智瑾等[53]采用高靈敏度、低PCR抑制性的EVAGreen染料代替?zhèn)鹘y(tǒng)的SYBR Green I熒光染料，通過(guò)采用自制的選擇性增菌液(煌綠肌醇膽鹽肉湯)對(duì)樣品進(jìn)行短時(shí)間前增菌處理后，大大提高了檢測(cè)靈敏度(達(dá)到25 cfu/10 mL)，該方法具有快速、高靈敏度和高特異性以及可應(yīng)用于復(fù)雜樣品的優(yōu)點(diǎn)。嚴(yán)寒秋等[54]對(duì)31株經(jīng)傳統(tǒng)生化鑒定為類志賀鄰單胞菌的菌株，利用特異性引物和探針對(duì)這31株菌株的23S rRNA基因進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)只有28株為類志賀鄰單胞菌，研究表明通過(guò)生化鑒定和熒光定量PCR分子水平鑒定兩者的有機(jī)結(jié)合，不僅能提高類志賀鄰單胞菌鑒定的準(zhǔn)確性，還能提高其檢出率。

4 小 結(jié)

由于病原菌種類繁多，形態(tài)結(jié)構(gòu)(如有無(wú)莢膜和鞭毛)和生理生化特性(如產(chǎn)酸產(chǎn)氣等特性)變化較大，因此難以建立一套能針對(duì)所有病原菌的檢測(cè)方法。普遍做法是在分離純化出病原菌之后，首先對(duì)其進(jìn)行生理生化特征鑒定，隨后再根據(jù)之前的結(jié)果進(jìn)行微生物系統(tǒng)和分子生物學(xué)檢測(cè)，綜合各項(xiàng)結(jié)果才能給出比較信服的結(jié)論。筆者于2017年從在西藏拉薩國(guó)家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地(水溫12 ℃)人工馴養(yǎng)的患病異齒裂腹魚(yú)中也分離到類志賀鄰單胞菌。目前對(duì)從魚(yú)源類志賀鄰單胞菌致病機(jī)理的研究較少，但近年來(lái)由該菌引起的養(yǎng)殖魚(yú)類患病愈加頻繁[55]，給消費(fèi)者帶來(lái)了重大的安全隱患，因此在今后有必要在患病魚(yú)類中快速準(zhǔn)確鑒定出致病性類志賀鄰單胞菌的基礎(chǔ)上，還要深入開(kāi)展該菌致病機(jī)理等方面的后續(xù)研究，這對(duì)明確該菌對(duì)魚(yú)類的致病性并控制其傳播具有重要意義。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，目前抗生素經(jīng)常被用來(lái)控制微生物性傳染病，但抗生素長(zhǎng)期大量反復(fù)使用，容易造成微生物產(chǎn)生耐藥性[56]。筆者從西藏土著魚(yú)中還分離出Micrococcussp.、Microbacteriumsp.、Penicilliumsp.、Exiguobacteriumsp.、Arthrobactersp.、Rhizopussp.、Leptosphaeriasp.、Microsphaeropsissp.、Acremoniumsp.等益生菌[57]，計(jì)劃后期開(kāi)展這些菌株對(duì)類志賀鄰單胞菌的拮抗作用，提取上述分離微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物并開(kāi)展其抑菌活性分析，以期找到對(duì)類志賀鄰單胞菌具有較好抑制作用的新型活性物質(zhì)，為傳統(tǒng)魚(yú)類抗生素藥物的替代及該菌的防治提供研究基礎(chǔ)。