云南核桃無融合生殖率和果實生長量研究

熊利權(quán) 寧德魯 石卓功 肖良俊 吳 濤 楊從華

( 1. 西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南 昆明 650233；2. 云南省林業(yè)科學(xué)院，云南 昆明 650201)

核桃（Juglans regia）又名胡桃、羌桃，是我國重要的栽培經(jīng)濟林樹種，屬胡桃科（Juglandaceae）胡桃屬（Juglans）多年生高大落葉喬木[1-2]。云南核桃以深紋核桃為主，因有得天獨厚的自然條件和悠久的栽培歷史，云南核桃種類多、品種雜，構(gòu)成了多樣、復(fù)雜的核桃種質(zhì)資源體系[3-4]。

核桃具有一定的無融合生殖能力，在不經(jīng)過精卵受精結(jié)合的情況下就能繁殖后代，也叫孤雌生殖[5-6]。核桃的無融合生殖，能有效利用其雜種優(yōu)勢，使子代的遺傳特性得以純化，保持母本的優(yōu)良性狀，對現(xiàn)有品種復(fù)壯、選育矮化砧、減少配置授粉樹等具有很大作用，且能協(xié)助有性生殖，提高坐果率，增加產(chǎn)量[7-8]。國內(nèi)外許多學(xué)者對核桃的無融合生殖都做過研究，Bekir等[9]用9年的時間觀察表明中歐38個核桃品種中18.5%的品種具有孤雌生殖能力；1963年，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)對核桃進(jìn)行去雄套帶隔離的方法，觀察到坐果率為1.2%，1983年，在河北省涉縣觀察到核桃孤雌生殖率為4.08%～43.7%[10-11]；杜蕊等[12]、寧萬軍等[13]、李迎超[14]、高紹棠等[15]采用去雄套袋、聚乙烯醇封柱頭、藥劑處理柱頭、切除柱頭等方法，都表明核桃具有無融合生殖能力，且采用不同的處理方法其無融合生殖坐果率也不同。目前，對云南核桃無融合生殖的研究甚少。本研究通過對云南核桃實施不同的無融合生殖處理，測定其無融合生殖率和果實生長量，為云南核桃優(yōu)良品種遺傳特性純化提供基礎(chǔ)，同時為提高坐果率、增加產(chǎn)量、選育矮化砧等生產(chǎn)實踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

漾濞泡核桃和娘青核桃為云南傳統(tǒng)栽培深紋核桃品種，采自云南省大理州漾濞縣平坡鎮(zhèn)高發(fā)村（北緯 25°32′，東經(jīng) 99°57′），海拔 2 010 m，年平均氣溫14.2 ℃，年降水量935.1 mm，土壤類型黃棕壤。云新301和云新303，為深紋核桃與普通核桃雜交種，采自云南省林業(yè)科學(xué)院昆明樹木園（北緯 25°08′，東經(jīng) 102°45′），海拔 1 970 m，年平均氣溫14.7 ℃，年降水量1 100 mm，土壤類型紅壤[16]。樹體生長健壯，15年生，常規(guī)管理。

1.2 試驗方法

1.2.1 預(yù)處理

于2018年2月，雌花柱頭顯露時，去掉雄花序，采取套硫酸紙袋的方法，以自然授粉為CK，每個品種套150個紙袋，每個紙袋套2～5個雌花。掛牌標(biāo)記。雌花柱頭顯露時，切除柱頭，每個品種切除150個結(jié)果枝的雌花柱頭，每個結(jié)果枝2～5個雌花，掛牌標(biāo)記。

1.2.2 坐果數(shù)、無融合生殖率計算方法

統(tǒng)計各品種的去雄套袋組、切柱頭組、CK的原始雌花數(shù)。去雄套袋組雌花柱頭萎蔫后去除紙袋。在第1次生理落果后統(tǒng)計各品種各個組的雌花坐果數(shù)；果實成熟時統(tǒng)計各品種各個組的果實數(shù)量。按公式（1）～（2）計算坐果率和無融合生殖率。

1.2.3 花粉管生長情況觀測方法

從試驗處理開始，每個處理組每天采樣1次，每次采樣3～4個雌花，直至雄花凋落完畢、雌花柱頭萎蔫。3個處理組都將整個雌花作為觀測材料，其中CK和去雄套袋組帶柱頭一起觀測，切柱頭組觀測子房部分。將所選材料經(jīng)過FPA70固定液固定，置于沖洗瓶中沖洗8 h，加入8 mol/L NaOH浸泡15 h，苯胺藍(lán)染色10 h，在載玻片上壓制材料后放在ZLDF-KY2倒置熒光顯微鏡（上海奮業(yè)光電儀器設(shè)備有限公司，中國）下觀察子房內(nèi)是否有花粉管生長或柱頭上是否有花粉萌發(fā)[17]。

1.2.4 無融合生殖果實生長量測定方法

在幼果生長期，每6 d采樣1次；在坐果穩(wěn)定后，每15～20 d采樣1次。每個品種的每個處理每次采6～8個幼果，測其縱徑、橫徑、棱徑和質(zhì)量，觀察果實生長情況。在果實生長過程中，對坐果時期進(jìn)行統(tǒng)計，觀測物候期。有20%的雄花序基部小花開始分裂時為雄花始期；有20%的雌花顯現(xiàn)時為雌花始期；雌花柱頭剛綻放時為雌花柱頭顯露期，此時進(jìn)行無融合生殖處理（去雄套袋、切柱頭）；幼果在非病蟲害等外界破壞下大量脫落時為生理落果期；果實生長穩(wěn)定時為穩(wěn)果期。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2007對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理統(tǒng)計，Origin軟件作圖，SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 云南核桃無融合生殖果實坐果時期

由表1可知，4個核桃品種均為雄先型植株。云新301的花期最早，3月3日就有雄花出現(xiàn)，3月5日雌花也逐漸出現(xiàn)；其次是云新303，較云新301晚1周左右；漾濞泡核桃3月16日雄花出現(xiàn)，3月25日雌花出現(xiàn)；娘青核桃的物候期最晚，到3月底才有雌、雄花出現(xiàn)，較漾濞泡核桃晚6～7 d。4個品種的無融合生殖處理時間規(guī)律基本相同，在雌花出現(xiàn)1周左右（雌花柱頭剛剛顯露時）進(jìn)行去雄套袋和切柱頭的無融合生殖處理，套袋組在套袋后20 d左右去袋（此時柱頭萎蔫）；去雄套袋和切柱頭處理后25～30 d出現(xiàn)生理大落果，再經(jīng)過4～6 d進(jìn)入穩(wěn)果期，其中套袋組比切柱頭組要晚1～2 d，CK較無融合生殖處理組早2～4 d。

表 1 云南核桃2018年無融合生殖物候期Table 1 Apomixis phenology of J. regia in 2018

可見，云南核桃無融合生殖處理后，其果實發(fā)育各個時期均晚于CK。在去雄套袋和切除柱頭處理后，切除柱頭處理的物候期稍早于去雄套袋處理1～2 d，說明切除柱頭處理的坐果期更早，有利于無融合生殖果實的發(fā)育。

2.2 云南核桃無融合生殖率測定

由表2可知，在4個供試品種中，漾濞泡核桃、娘青核桃的自然坐果率為58.85%、57.67%，雜交品種云新301、云新303的自然坐果率為64.67%、72.89%；漾濞泡核桃、娘青核桃、云新301和云新303的無融合生殖率分別為2.77%～37.11%、4.63%～44.89%、6.8%～10.04%和3.79%～7.28%。從整體看，傳統(tǒng)栽培品種漾濞泡核桃、娘青核桃的無融合生殖率高于雜交品種云新301、云新303?？梢?，雜交核桃品種云新301、云新303的自然坐果率高于傳統(tǒng)栽培品種漾濞泡核桃、娘青核桃，無融合生殖率卻低于傳統(tǒng)栽培品種漾濞泡核桃、娘青核桃，其中，娘青核桃的無融合生殖率最高，云新303的無融合生殖率最低。

從4個供試品種來看，切柱頭的無融合生殖處理組的無融合生殖率高于去雄套袋組。漾濞泡核桃切柱頭組的無融合生殖率為37.11%，而去雄套袋組僅為2.77%；娘青核桃切柱頭組的無融合生殖率為44.89%，去雄套袋組僅為4.63%；云新303切柱頭組的無融合生殖率為7.28%，去雄套袋組為3.79%；云新301去雄套袋組的無融合生殖率為6.8%，是4個供試品種中最高的，但其切柱頭組的無融合生殖率為10.04%，還是高于去雄套袋組。4個供試品種中，無融合生殖坐果率與自然授粉坐果率差異顯著（P＜0.05），無融合生殖處理中去雄套袋處理的無融合生殖率與切柱頭處理的無融合生殖率差異顯著（P＜0.05）。

綜合上述分析表明，云南核桃的無融合生殖率為2.77%～44.89%，其中云南傳統(tǒng)栽培品種的無融合生殖率高于雜交品種的無融合生殖率，分別為2.77%～44.89%和3.79%～10.04%。針對云南核桃不同的無融合生殖處理其無融合生殖率有顯著差異（P＜0.05），切除柱頭的無融合生殖率可達(dá)7.28%～44.89%，而去雄套袋的無融合生殖率僅為2.77%～6.8%，切柱頭處理的無融合生殖率高于去雄套袋處理。

表 2 云南核桃無融合生殖率差異分析Table 2 Difference analysis of apomictic rate of J. regia

2.3 授粉情況及花粉管檢測結(jié)果

為了驗證無融合生殖的準(zhǔn)確性，對所試品種不同無融合生殖處理的授粉情況及花粉管生長情況進(jìn)行了檢測。如圖1所示，圖1a為CK的熒光觀測情況，在圖中箭頭所指為花粉管和花粉粒，可明顯觀測到柱頭上的花粉粒和花粉管生長；圖1b和圖1c為無融合生殖處理組的熒光觀測情況，其中圖1b為去雄套袋組，圖1c為切柱頭組，在圖中均未觀察到花粉粒和花粉管。

圖 1 不同處理子房或柱頭內(nèi)花粉粒和花粉管分布情況Fig. 1 Distribution of pollen grains and pollen tubes in different treatment ovaries or stigma

CK的雌花在經(jīng)過授粉受精后，花粉粒在柱頭頂端萌發(fā)，從而在柱頭和子房內(nèi)有花粉管生長；無融合生殖處理的雌花通過去雄套袋、切柱頭后，不經(jīng)過授粉受精，因此柱頭和子房內(nèi)無花粉管分布。

2.4 云南核桃無融合生殖果實生長量測定結(jié)果

2.4.1 云南核桃無融合生殖果實大小

由圖2可知，在去雄套袋、切除柱頭和自然授粉3個處理中，果實大小的生長有一定的差異，其中自然授粉的果實生長最快，切除柱頭處理與自然授粉接近，而去雄套袋的果實生長最慢。從圖中折線走勢看，到穩(wěn)果后果實大小生長開始加速，直到硬果期，各個處理的果實大小逐漸接近，趨于穩(wěn)定。

2.4.2 云南核桃無融合生殖果實質(zhì)量

由圖3可知，在去雄套袋、切除柱頭和自然授粉3個處理中，果實質(zhì)量的增長有一定的差異，其中自然授粉的果實重量增長最快，切除柱頭處理次之，去雄套袋處理的果實增長最慢。從圖中折線走勢看，在坐果穩(wěn)定后，果實質(zhì)量增長加快，呈加速上升趨勢，說明此階段為核桃內(nèi)含物增長的關(guān)鍵時期。

圖 2 云南核桃2018年無融合生殖果實大小生長情況Fig. 2 Apomictic fruit size growth of J. regia， 2018

圖 3 云南核桃無融合生殖果實質(zhì)量增長情況Fig. 3 Apomictic fruit weight growth of J. regia

綜合圖2、圖3可知，不同處理的云南核桃無融合生殖果實生長量有很大差異。其中，切除柱頭處理的無融合生殖果實生長較快，與自然授粉組基本一致，而去雄套袋處理果實生長相對緩慢。說明無融合生殖處理對果實生長有一定的影響，尤其是去雄套袋處理，果實生長遲緩。因此，選擇合適的無融合生殖處理方法對果實正常生長很重要。

3 結(jié)論與討論

云南核桃的無融合生殖率為2.77%～44.89%，其中云南傳統(tǒng)栽培品種的無融合生殖率高于雜交品種的無融合生殖率，分別為2.77%～44.89%和3.79%～10.04%。不同的無融合生殖處理其無融合生殖率有顯著差異，切除柱頭的無融合生殖率可達(dá)7.28%～44.89%，而去雄套袋的無融合生殖率僅為2.77%～6.8%。無融合生殖的果實發(fā)育晚于自然授粉，無融合生殖處理方式不同，其果實生長規(guī)律也有所差異。

云南核桃無融合生殖率受無融合生殖處理方式的影響，切柱頭處理的無融合生殖率高于去雄套袋處理，這與寧萬軍等[13]的研究結(jié)果一致。去雄套袋處理在套袋期間阻隔了雌花與外界的接觸，減少了陽光、空氣等對雌花發(fā)育、枝梢生長的作用，在一定程度上對樹體的正常生長發(fā)育有影響；而切柱頭處理除了隔絕雌花柱頭授粉受精外，對外界環(huán)境與樹體之間的相互作用毫無影響，相對是一種理想的無融合生殖處理方式。

本研究根據(jù)核桃品種特性，針對不同的品種選擇最佳的適宜區(qū)域進(jìn)行實驗，其中娘青核桃為云南傳統(tǒng)栽培品種中的一種農(nóng)家品種，適宜于高海拔地區(qū)，在漾濞縣海拔2 000 m左右的山區(qū)表現(xiàn)良好[18]；而云新301和云新303是云南省培育的早實新品種，是云南大姚三臺核桃為母本、新疆核桃新早13號為父本的種間雜交品種，在滇中一帶表現(xiàn)良好[19-20]。張強等[21]通過對新疆2個主栽核桃品種的無融合生殖研究，表明其無融合生殖率為17.8%～58.8%，王國安等[10]對新疆核桃進(jìn)行研究后報道，無融合生殖率達(dá)8.17%～69.44%，而本研究云新系列核桃的無融合生殖率僅為3.79%～10.04%，出現(xiàn)這一差異的原因是否為雜交后生殖生理特性發(fā)生變化，或是環(huán)境因素造成，還有待進(jìn)一步研究。

無融合生殖處理方法很多，最常用的為去雄套袋隔離，也可以采取切除柱頭、藥劑處理、花粉蒙導(dǎo)等方法，目的就是隔絕授粉受精，產(chǎn)生無融合生殖純合體。對于無融合生殖率的計算，許多學(xué)者有不同的方法，王國安等[10]、張強等[21]用去雄套袋后的結(jié)果數(shù)與套袋雌花總數(shù)的比值作為無融合生殖率；張鵬飛[5]、張美勇等[22]先用去雄套袋后的結(jié)果數(shù)比上套袋雌花數(shù)，再用這個比值比上自然授粉坐果率，最終所得的比值作為無融合生殖率。核桃具有一定的無融合生殖能力，在自然授粉的果實中也包含了部分無融合生殖胚形成的果實，所以在計算無融合生殖率時應(yīng)理解為無融合生殖胚所形成的果實占自然授粉條件下形成的全部果實的百分率。因此，前者應(yīng)為核桃無融合生殖坐果率，后者為無融合生殖率。

云南核桃無融合生殖處理后，其果實發(fā)育晚于自然授粉，不同處理的無融合生殖果實生長量有很大差異。說明無融合生殖處理對果實生長發(fā)育有一定的影響，切除柱頭處理后的果實生長與自然授粉基本一致，去雄套袋處理的果實生長有所遲緩。選擇合適的無融合生殖處理方法對提高無融合生殖率、促進(jìn)果實正常生長發(fā)育具有實際應(yīng)用價值。