探討“利用淀粉酶探究溫度對酶活性的影響”實(shí)驗(yàn)檢測試劑的選擇

福建省石獅市第三中學(xué)(362700) 謝仁榮

四川省綿竹市南軒中學(xué)(618200) 申定健

安徽省蕪湖市第十二中學(xué)(241002) 吳志強(qiáng)

人教版生物教材關(guān)于“酶的特性”相關(guān)內(nèi)容的教學(xué)中，設(shè)置了探究實(shí)驗(yàn)“影響酶活性的條件”，建議“用淀粉酶探究溫度對酶活性的影響”，所提供的材料用具中有碘液和斐林試劑。在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中經(jīng)常運(yùn)用碘液檢測底物淀粉的水解程度，但是能否用斐林試劑檢測產(chǎn)物還原糖的生成在中學(xué)教學(xué)中產(chǎn)生了很大爭議。大部分教師對此持反對意見，認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)需要嚴(yán)格控制溫度，而斐林試劑檢測還原糖時(shí)需要加熱，在加熱過程中，酶的活性可能發(fā)生變化，原來設(shè)置的低溫條件(如2～4℃)酶活性很低，淀粉水解速度很慢，產(chǎn)生的還原糖很少，幾乎無法與斐林試劑生成磚紅色沉淀，加熱升高溫度，酶活性可能隨之升高，反應(yīng)生成較多還原糖，因而可能出現(xiàn)磚紅色沉淀，從而影響實(shí)驗(yàn)效果。

1 經(jīng)典例題分析

例題：為探究NaCl和CuSO4對唾液淀粉酶活性的影響，某同學(xué)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)步驟和結(jié)果見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)步驟和結(jié)果1

分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：對酶活性有影響的離子是Cl－和Cu2＋，其中對酶活性有抑制作用的離子是Cu2＋，對酶活性有促進(jìn)作用的離子是Cl－。

上述實(shí)驗(yàn)中若用斐林試劑代替碘溶液進(jìn)行檢測，1～4號(hào)試管中的顏色依次是深磚紅色、無磚紅色(或藍(lán)色)、淺磚紅色、淺磚紅色。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在操作過程中，保溫之前不能加入斐林試劑，其原因是斐林試劑中有Cu2＋，其可抑制唾液淀粉酶的活性。

對試題中所描述的結(jié)果，有學(xué)生提出一些自己的看法，設(shè)計(jì)以下實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法與步驟如上所述，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與試題內(nèi)容一致。另增加5、6、7組實(shí)驗(yàn)，5號(hào)試管中加入0.05g/mL的 CuSO4溶液1mL，6號(hào)試管中加入0.1g/mL的NaOH溶液1mL，7加入1mL新配置的斐林試劑，其他步驟如試題所述步驟進(jìn)行。在保溫時(shí)間長達(dá)1h后，在6、7號(hào)試管中先加入適量鹽酸，中和NaOH至溶液pH為6或7，再加入數(shù)滴碘液，5、6、7組實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象均為深藍(lán)色。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了0.05g/mL的CuSO4溶液、0.1g/mL的NaOH溶液和斐林試劑均能抑制唾液淀粉酶活性。

2 利用唾液淀粉酶探究溫度對酶活性的影響，用碘液檢測底物淀粉

利用唾液淀粉酶探究溫度對酶活性的影響，用碘液檢測淀粉的實(shí)驗(yàn)步驟及結(jié)果見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)步驟和結(jié)果2

37℃條件下，唾液淀粉酶活性較高，經(jīng)過5min保溫后，淀粉被分解，無法與碘液發(fā)生顯色反應(yīng)。冰水浴唾液淀粉酶活性雖較低，但恢復(fù)到37℃后仍能恢復(fù)活性，水解淀粉(甲組)；而96℃沸水浴后(恒溫水浴鍋只能達(dá)到96℃)唾液淀粉酶沒有活性，迅速降到37℃后再保溫5min后(戊組)，加入碘液仍呈深藍(lán)色，與丁組一致，驗(yàn)證了唾液淀粉酶在高溫(96℃)下空間結(jié)構(gòu)被破壞，酶活性不能恢復(fù)。需要注意的是，丁組和戊組加入碘液后都變藍(lán)色，但藍(lán)色馬上消失，這與淀粉在較高溫度下，因結(jié)構(gòu)伸展不與碘結(jié)合，顯色較淺甚至不顯色有關(guān)，在冷卻到常溫時(shí)又可恢復(fù)到藍(lán)色。

延長乙組冰水浴和丁組沸水浴時(shí)間，乙組藍(lán)色逐漸變淺，說明冰水浴低溫條件下，唾液淀粉酶的活性雖受抑制，但仍有一定活性，淀粉仍能緩慢水解；而丁組長時(shí)間保溫后冷卻再加入碘依然是深藍(lán)色，說明96℃條件下唾液淀粉酶的活性已完全喪失。

3 利用唾液淀粉酶探究溫度對酶活性的影響，用斐林試劑檢測產(chǎn)物還原糖

用斐林試劑(0.1g/mL的 NaOH 溶液與0.05g/mL的CuSO4溶液等量混合，現(xiàn)配現(xiàn)用)檢測產(chǎn)物還原糖的生成，實(shí)驗(yàn)步驟及結(jié)果見表3。

各實(shí)驗(yàn)組與斐林試劑96℃水浴數(shù)分鐘后，丙組出現(xiàn)磚紅色沉淀，而乙、丁組都不出現(xiàn)磚紅色沉淀，說明2～4℃冰水浴組及96℃沸水浴組唾液淀粉酶活性都很低，在反應(yīng)時(shí)間內(nèi)(45min)都沒有產(chǎn)生足量的還原糖。將乙組冰水浴保溫時(shí)間延長到3h后，與斐林試劑96℃沸水浴數(shù)分鐘后，乙組也出現(xiàn)了微量的磚紅色沉淀；而將冰水浴時(shí)間延長到20h，則可以出現(xiàn)明顯的磚紅色沉淀。說明在2～4℃冰水浴條件下，酶仍有活性，能緩慢水解淀粉，生成還原糖。甲組和戊組實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說明2～4℃低溫條件下唾液淀粉酶活性較低，但溫度恢復(fù)到合適溫度時(shí)酶活性仍能升高，而96℃高溫作用下唾液淀粉酶活性喪失，并且降低溫度到合適溫度酶活性也不能恢復(fù)。值得注意的是，甲組的磚紅色沉淀較丙組少，這可能說明冰水浴對唾液淀粉酶活性還是有一定程度的影響。

表3 實(shí)驗(yàn)步驟和結(jié)果3

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步分析

本實(shí)驗(yàn)在37℃溫水浴中保溫5～20min，利用斐林試劑檢測還原糖，沒有觀察到磚紅色沉淀，當(dāng)將保溫時(shí)間延長到30min以上時(shí)，才在實(shí)驗(yàn)中觀察到磚紅色沉淀(量很少)。筆者驗(yàn)證過斐林試劑與還原糖(葡萄糖)反應(yīng)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的葡萄糖溶液都可較快地出現(xiàn)明顯的磚紅色沉淀，其靈敏性是很高的。

分析其原因可能與唾液淀粉酶的作用機(jī)制有關(guān)。唾液中所含的淀粉酶屬于α－淀粉酶，α－淀粉酶能作用于直鏈淀粉和支鏈淀粉，以及糖原、其他多聚糖和寡聚糖，隨機(jī)地從底物分子內(nèi)部切斷α－1，4糖苷鍵，但不能切斷α－1，6糖苷鍵及α－1，6糖苷鍵附近的α－1，4糖苷鍵。因而α－淀粉酶作用于淀粉首先產(chǎn)生分子大小不一的中間產(chǎn)物糊精，引起底物溶液粘度的急劇下降和碘反應(yīng)的消失，但還原糖的生成是需要較長時(shí)間的。隨作用的時(shí)間延長，糊精進(jìn)一步分解，聚合度逐漸降低，還原性的葡萄糖末端逐漸增多，最終產(chǎn)生含有寡糖和帶有支鏈的寡糖、麥芽糖、α－1，4葡萄糖等。

用碘液檢測淀粉的分解和用斐林試劑檢測淀粉的水解產(chǎn)物還原糖的生成，兩者的衡量指標(biāo)是不同的，前者隨著唾液淀粉酶或α－淀粉酶作用，很快就喪失與碘的呈色作用，而且反應(yīng)靈敏，可用于定性及定量測定淀粉的水解情況；而淀粉初步水解的產(chǎn)物糊精基本沒有還原性，需要作用更長的時(shí)間，直至有足夠量的還原糖生成，才能檢測出磚紅色的沉淀。在本實(shí)驗(yàn)條件下將作用時(shí)間延長到45min以上，效果才較為明顯。

5 與斐林試劑反應(yīng)的水浴溫度影響

斐林試劑檢測還原糖時(shí)需要加熱，人教版必修1教材給出的水浴加熱溫度是50～65℃，而人教新課標(biāo)版教材必修3和人教大綱版教材是沸水浴或用酒精燈直接加熱，上述試題也是用沸水浴加熱，唾液淀粉酶在50～65℃依然有一定活性，加熱溫度對此實(shí)驗(yàn)是否有影響?

再設(shè)置一組實(shí)驗(yàn)：將與斐林試劑混合后的沸水浴改為60℃水浴，其他條件與步驟同表3中乙組步驟，在相應(yīng)溫度下保溫45min，乙組未出現(xiàn)磚紅色沉淀；將保溫時(shí)間延長到3h，再與斐林試劑混合，60℃水浴30min也未出現(xiàn)磚紅色沉淀。分析其原因可能是冰水浴條件下，淀粉水解的速度很慢，生成的還原糖太少，而60℃水浴時(shí)斐林試劑與還原糖反應(yīng)生成磚紅色氧化亞銅沉淀的速度也較慢，而很難觀察到沉淀。這點(diǎn)在斐林試劑與葡萄糖的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中也有體現(xiàn)，在60℃水浴加熱條件下，0.05%的葡萄糖組幾乎觀察不到磚紅色沉淀，0.1%的葡萄糖組才能觀察到微量的磚紅色沉淀，而且生成沉淀的速度比沸水浴組明顯慢得多，沉淀的量也較少，需要加熱較長時(shí)間。

6 結(jié)論與展望

“利用淀粉酶探究溫度對酶活性的影響”實(shí)驗(yàn)中用斐林試劑檢測產(chǎn)物還原糖的生成是可行的。其原因是加入斐林試劑時(shí)，酶活性就被抑制了，不管是在沸水浴還是60℃水浴條件下。而在合適的反應(yīng)時(shí)間(如30～45min)內(nèi)，加熱時(shí)間30min以上也未出現(xiàn)磚紅色沉淀。但該反應(yīng)需要較長時(shí)間(30min以上)，與斐林試劑混合后的水浴溫度也以沸水浴為佳，反應(yīng)較快，效果較好。上述高考試題的設(shè)置十分嚴(yán)謹(jǐn)，并沒有科學(xué)問題。而在實(shí)際操作中，仍建議以碘液來檢測底物淀粉的水解，更簡單易行，效果也更好。下一步將摸索合適的反應(yīng)條件，將反應(yīng)時(shí)間縮短到合理范圍，以便在教學(xué)中運(yùn)用。