四妙勇安湯活性部位配伍方薄層色譜鑒別及綠原酸和哈巴俄苷的含量測定△

楊會，宋珂，李慧，白云綺，王淑琪，吳圣賢，陳立新，聶波*

1.北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院/中醫(yī)內(nèi)科學教育部重點實驗室和北京市重點實驗室，北京 100700

四妙勇安湯由金銀花、玄參、當歸、甘草四味藥組成，最早見于華佗《神醫(yī)秘傳》，后收載于《驗方新編》，具有清熱解毒、活血通脈之功[1-4]。課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，四妙勇安湯可以通過抑制炎癥反應，減輕動脈粥樣硬化進展[5-7]。根據(jù)四妙勇安湯處方所含化學成分的理化性質(zhì)，課題組采用不同濃度乙醇提取，大孔吸收樹脂分離純化，結(jié)合細胞藥效學篩選，得到CS03、CS04、CS05 3個活性部位，通過體外藥效學和動物實驗篩選，確定CS03∶CS04∶CS05=345∶270∶258為最佳活性配比，組成該配伍方，已獲得專利授權(quán)[8]。

中藥成分的定性鑒別與定量測定是保證其安全、有效、質(zhì)量可控的基礎(chǔ)和前提[9]，是現(xiàn)代化中藥產(chǎn)業(yè)的重點內(nèi)容。目前還沒有該配伍方定性鑒別和含量測定的相關(guān)研究，薄層色譜法因能夠同時對多個樣品進行分離、樣品預處理簡單、經(jīng)濟高效、簡便直觀的優(yōu)勢在中藥的分析及鑒別中被廣泛應用；HPLC由于分離效率高、選擇性好、檢測靈敏度高、操作自動化、應用范圍廣等特點，目前廣泛應用于中成藥質(zhì)量控制[10-11]，為了更好地控制該配伍方的質(zhì)量，本實驗采用薄層色譜建立了該配伍方中玄參、甘草的定性鑒別方法，并采用HPLC技術(shù)，以綠原酸和哈巴俄苷為檢測指標建立了配伍方中金銀花、玄參兩味藥材的的含量測定方法，為該配伍方的新藥研發(fā)提供簡單、快速、有效的質(zhì)量控制方法。

1 材料

1.1 儀器

高效液相系統(tǒng)為Agilent1100 HPLC系統(tǒng)，包含DAD檢測器、二元泵、在線脫氣機、自動進樣器；AEG-40SM型電子天平(日本島津公司)；SSW-420-2S型電熱恒溫水槽(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；ZF-20D暗箱式紫外分析儀(上海寶山顧村電光儀器廠)；202-2AB型電熱恒溫干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；雙槽玻璃層析缸(規(guī)格：10 cm×10 cm)；玻璃點樣毛細管(華西醫(yī)科大學儀器廠，內(nèi)徑為0.5 mm，管長為100 mm，硬質(zhì)中性玻璃)；顯色噴霧瓶(華西醫(yī)科大學儀器廠)；硅膠G薄層板(青島海洋化工廠分廠，規(guī)格為10 cm×20 cm，厚度為0.20～0.25 mm)。

1.2 試藥

對照藥材金銀花、玄參、甘草(中國食品藥品檢定研究院，供薄層色譜用，批號分別為：121060-200906、121008-200906、120904-200512)；乙腈為色譜純(德國Merck公司)；對照品綠原酸、哈巴俄苷(中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號分別為110753-200413、111730-200605)；Milli-Q超純水；其他試劑均為分析純(北京化學試劑廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 玄參薄層色譜鑒別

取配伍方4 mg，加甲醇5 mL，振搖，使溶解，作為供試品溶液。另取玄參對照藥材粉末1 g，加甲醇10 mL，浸泡1 h，超聲處理30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加25 mL水溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，合并正丁醇，蒸干，殘渣加2 mL甲醇溶解，作為對照藥材溶液。哈巴俄苷配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的溶液。制備不含玄參的樣品，按前法同樣操作，作為陰性對照樣品溶液。鑒別方法參考2015版《中華人民共和國藥典》[12]。為保證實驗結(jié)果的準確性和重復性，樣品兩次重復點樣，供試品色譜中，與對照品、對照藥材相應的位置上，供試品溶液顯相同的斑點，見圖1。

注：1.玄參對照藥材；2.哈巴俄苷；3.樣品；4.樣品；5.陰性。圖1 玄參薄層鑒別色譜圖

2.2 甘草薄層鑒別

取甘草酸銨對照品加甲醇制成質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1的溶液，作為對照品溶液。參考2015版《中華人民共和國藥典》[13]制備甘草對照藥材溶液、樣品溶液和陰性對照樣品溶液并進行鑒別。為保證實驗結(jié)果的準確性和重復性，樣品兩次重復點樣，供試品色譜中，在與對照品、對照藥材相應的位置上，顯相同的斑點，見圖2。

注：1.甘草對照藥材；2.甘草酸銨；3.樣品；4.樣品；5.陰性。圖2 甘草薄層鑒別色譜圖

2.3 綠原酸、哈巴俄苷含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：ZorbaxSB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：A：0.1%甲酸水，B：乙腈，梯度洗脫(0～15 min，5%～10%B；5～15 min，10%～14%B；15～18 min，14%～17%B；18～25 min，17%～81%B；25～40 min，81%～65%B；70～80 min，65%～20%B)；流速：1.0 mL·min-1；DAD檢測器；檢測波長：365 nm；柱溫：30 ℃；進樣量5 μL。

2.3.2 樣品制備 對照品溶液制備：精密稱取綠原酸、哈巴俄苷對照品，加甲醇制成每mL含綠原酸、哈巴俄苷分別為0.2、0.02 mg的溶液，即得。

供試品溶液制備：取配伍方100 mg，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，超聲30 min，補足減失質(zhì)量，搖勻，過微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 方法學考察

2.3.3.1 系統(tǒng)適應性與專屬性 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-0.1%甲酸水(32∶68)為流動相；柱溫：30 ℃。理論塔板數(shù)按綠原酸、哈巴俄苷峰計算應不低于1000、5000。取供試品溶液連續(xù)進6針，進樣后HPLC圖，對照品和供試品中綠原酸、哈巴俄苷的保留時間一致，見圖3。

2.3.3.2 線性關(guān)系 精密稱取干燥的綠原酸、哈巴俄苷對照品，加甲醇分別制成質(zhì)量濃度為0.195、0.019 2 mg·mL-1的溶液，分別進樣1、2、4、6、8 μL和1、2、5、10、20 μL，按上述色譜條件測定峰面積。以綠原酸、哈巴俄苷對照品進樣量(μg)對數(shù)

注：A.對照品綠原酸；B.對照品哈巴俄苷；C.供試品。圖3 四妙勇安湯活性配伍方專屬性考察圖譜

值為橫坐標，峰面積對數(shù)值為縱坐標繪制標準曲線，其回歸方程分別為Y=0.000 8X+0.002 2，r=0.999 9；Y=0.000 4X+0.000 3，r=1.000 0，綠原酸和哈巴俄苷分別在0.195～1.560、0.019 2～0.384 0 μg·μL-1線性關(guān)系良好。

2.3.3.3 供試品溶液制備 取配伍方40 mg，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加50%的乙腈定容，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.3.3.4 精密度試驗 分別取質(zhì)量濃度為39.0 μg·μL-1的綠原酸對照品溶液和質(zhì)量濃度為19.2 μg·mL-1的哈巴俄苷對照品溶液重復進樣6次，峰面積RSD分別為0.2%、0.2%。

2.3.3.5 重復性試驗 取同一批號的配伍方，精密稱取40 mg，共6份，依法提取測定，供試品綠原酸及哈巴俄苷含量RSD分別為0.60%、0.25%。

2.3.3.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液分別在0、3、6、12、24 h進樣測定，綠原酸峰面積分別為1 233.6、1 231.6、1 235.3、1 225.8、1 240.7、1 233.4，RSD為0.4%，哈巴俄苷峰面積分別為128.5、129.2、129.1、124.4、125.8，RSD=1.5%，結(jié)果表明供試品溶液中綠原酸、哈巴俄苷24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3.7 回收率試驗 精密稱取配伍方20、100 mg(其中綠原酸及哈巴俄苷質(zhì)量分數(shù)分別為5.3%、0.25%)，各9份，置于10 mL容量瓶中，分別精密加含有綠原酸0.90、1.13、1.37 mg的對照品溶液，含有哈巴俄苷0.20、0.25、0.30 mg的對照品溶液，加50%乙腈定容，定容后搖勻，依法提取測定，結(jié)果見表1。

表1 綠原酸和哈巴俄苷加樣回收率試驗結(jié)果(n=9)

2.3.4 配伍方中綠原酸、哈巴俄苷的含量測定 取配伍方40 mg，精密稱定，依法提取制成供試品溶液，進樣二次測定，以外標兩點法對數(shù)方程計算，即得，結(jié)果見表2。

表2 配伍方中綠原酸、哈巴俄苷含量測定

3 討論

3.1 定量藥效成分的確定

已有數(shù)據(jù)表明，四妙勇安湯水煎液主要含有環(huán)烯醚萜類、黃酮類、苯丙素類、有機酸類等多種成分[14-15]。在該配伍方中，金銀花和玄參為君藥，金銀花主要含有奎寧酸類和黃酮類成分，玄參中主要成分為環(huán)烯醚萜類成分，《中華人民共和國藥典》2015版規(guī)定，金銀花藥材中主要檢測綠原酸和木犀草苷兩個成分；玄參藥材中主要檢測哈巴苷和哈巴俄苷兩個成分，因配伍方是采用提取并經(jīng)大孔樹脂富集獲得洗脫部位，經(jīng)活性篩選配伍而獲得，前期質(zhì)譜鑒定中發(fā)現(xiàn)木犀草苷含量較低，哈巴苷未能檢測到，不作為該配伍方的含量測定的指標性成分，因此選擇綠原酸和哈巴俄苷作為配伍方的含量測定成分。文獻報道，綠原酸和哈巴俄苷均可通過激活PPAR-γ受體，對動脈粥樣硬化炎癥反應具有較好的抑制作用，從而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的活性，因此選擇綠原酸和哈巴俄苷作為配伍方的藥效成分進行含量測定[16-18]。

3.2 樣品處理、色譜條件的優(yōu)化

在本實驗中供試品溶液制備方法，參照《中華人民共和國藥典》金銀花、玄參含量測定供試品溶液制備方法設(shè)計，考慮到本品為55%乙醇提取后大孔樹脂富集得到的配伍方，結(jié)合流動相采用的乙腈-甲酸水系統(tǒng)洗脫，所以筆者選擇用50%的乙腈水溶液來溶解樣品，溶解效果很好。對本品的含量測定，筆者采用乙腈和0.1%甲酸水為流動相進行梯度洗脫，考察了色譜條件，結(jié)果配伍方中綠原酸、哈巴俄苷分離度好，靈敏度高，方法合理可靠。

“鑒別”是鑒定中藥真假的檢測項目，“含量測定”是對中藥材中主要藥效成分或指標性成分的定量控制，是保障中藥材有效性的最重要的指標，也是評價中藥材質(zhì)量優(yōu)劣的重要指標。本研究基于藥效導向篩選四妙勇安湯活性部位，根據(jù)體外藥效和動物實驗確定療效最佳的配伍方，首次同時對該配伍方中玄參和甘草的化學成分進行薄層鑒別，采用HPLC的方法對配伍方中綠原酸和哈巴俄苷進行含量測定，為其配伍方的質(zhì)量評價研究提供參考。

4 結(jié)論

本實驗所建立的四妙勇安湯活性部位配伍方以哈巴俄苷和甘草酸銨為指標的薄層色譜鑒別方法專屬性強，準確度高，以綠原酸和哈巴俄苷為指標的HPLC含量測定方法具有較好的精密度、重復性和穩(wěn)定性，操作簡便，標準可行，為有效控制該配伍方的質(zhì)量提供準確、可靠的檢測方法，也為配伍方作為新藥的質(zhì)量標準制定提供參考。