多指標(biāo)正交試驗(yàn)法考察金匱薯蕷膏提取工藝△

趙斌斌，周小雅*，賴飛娥，常雪松，黃敏，梁國成，陳壯

1.廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011

薯蕷丸為漢代名醫(yī)張仲景醫(yī)著《金匱要略》中收載的扶正袪邪經(jīng)典名方，由山藥、甘草等21味藥組成，其市場前景廣闊、開發(fā)政策環(huán)境良好與其開發(fā)的深度與廣度不足的矛盾非常突出。目前市場無薯蕷膏成藥產(chǎn)品供應(yīng)，且已批準(zhǔn)生產(chǎn)的薯蕷丸成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與現(xiàn)代藥品監(jiān)測技術(shù)的發(fā)展不相適應(yīng)，難以滿足需求、控制質(zhì)量[1]。因此，本課題組將薯蕷膏制備作為研究課題。提取是將薯蕷丸改型為金匱薯蕷膏的關(guān)鍵過程。本研究以薯蕷皂苷、甘草酸、甘草苷等有效成分為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法對(duì)其提取工藝進(jìn)行考察，為控制金匱薯蕷膏質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

快速水分測定儀[奧豪斯儀器(上海)有限公司]；安捷倫高效液相色譜儀(1260)；TU-1901雙光束紫外分光光度儀(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；Practum612-1CN電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；EL104型電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；銅水浴鍋；電爐；PS-20A潔康牌超聲波清洗器(東莞市潔康超聲波設(shè)備有限公司)；高速離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司)；SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

1.2 試藥

藥材購于貴港市百草坊中藥飲片有限公司；甘草苷、甘草酸銨、薯蕷皂苷(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為：111610-201106、110731-201116、111707-201402)；金匱薯蕷膏(課題組自制，批號(hào)分別為：20170702B、20170702B、20170703A、20170703B、20170704A、20170704B、20170704C、20170704D、20170705A、20170705B)；甲醇、乙腈(德國默克公司，色譜醇)；磷酸(廣東光華科技股份有限公司，批號(hào)：20140929，分析純)；娃哈哈純凈水；乙醇(廣東光華科技股份有限公司，批號(hào)：20141008，分析純)。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量檢測方法

2.1.1 對(duì)照品溶液制備 取甘草苷對(duì)照品、甘草酸銨對(duì)照品、薯蕷皂苷對(duì)照品適量，精密稱定，加70%乙醇分別制成每1 mL含甘草苷992 μg、甘草酸銨1200 μg、薯蕷皂苷720 μg的溶液，稀釋成不同濃度。

2.1.2 色譜條件 色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動(dòng)相A，0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相B，流速為1.0 mL·min-1進(jìn)行梯度洗脫，甘草酸、甘草苷洗脫條件見表1，檢測波長為237 nm；薯蕷皂苷洗脫條件見表2，檢測波長為202 nm，進(jìn)樣量20 μL。

注：1.薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)品；2.樣品；3.陰性對(duì)照品。圖1 薯蕷皂苷色譜圖

2.1.3 線性關(guān)系考察 分別吸取甘草苷、甘草酸對(duì)照品溶液，加70%乙醇稀成釋質(zhì)量濃度分別為992、1200、720 μg·mL-1的甘草苷、甘草酸、薯蕷皂苷對(duì)照品溶液，再稀釋成6個(gè)不同濃度的對(duì)照品溶液，分別精密吸取上述7種不同濃度的對(duì)照品溶液20 μL，注入高效液相色譜議中，按2.1.2色譜條件分析測定其峰面積，以對(duì)照品溶液濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，其色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，甘草苷：Y=9.441X+47.88，r=0.999 8；甘草酸：Y=2.641X+13.86，r=0.999 8；薯蕷皂苷：Y=3.431X+38.043，r=0.999 4。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取甘草苷、甘草酸、薯蕷皂苷對(duì)照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計(jì)算RSD分別為0.79%、0.46%、1.42%(見表1)，表明精密度良好，符合含量測定的要求。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6份，每份1 g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備，測定含量，計(jì)算測定結(jié)果甘草苷、甘草酸和薯蕷皂苷RSD分別為0.47%、0.23%、0.96%，表明重復(fù)性良好，符合含量測定的要求。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液20 μL，分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣，測定其含量，計(jì)算在24 h內(nèi)甘草苷、甘草酸和薯蕷皂苷的RSD分別為1.14%、1.06%、1.97%，表明穩(wěn)定性良好，符合含量測定的要求。

2.1.7 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的薯蕷膏樣品6份，每份1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，每份精密加入質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1甘草苷對(duì)照品溶液1 mL，質(zhì)量濃度為3.6 mg·mL-1甘草酸銨對(duì)照品溶液1 mL，質(zhì)量濃度為2.1 mg·mL-1薯蕷皂苷對(duì)照品溶液1 mL，加入70%乙醇47 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，精密移取20 mL，水浴蒸干，用4 mL70%乙醇溶解，微孔濾膜過濾后既得樣品，進(jìn)樣20 μL，計(jì)算回收率和RSD值。結(jié)果見表1～3。

表1 甘草苷加樣回收率(n=6)

表2 甘草酸加樣回收率(n=6)

表3 薯蕷皂苷加樣回收率(n=6)

2.2 提取工藝考察

2.2.1 供試品溶液制備 精密移取待檢測薯蕷膏提取液20 mL，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，放置24 h，再稱定質(zhì)量，用乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，精密移取濾液20 mL，置蒸發(fā)皿中蒸干，用4 mL 70%乙醇溶解，經(jīng)微孔濾膜過濾即得。

2.2.2 單因素考察 取3份處方量的藥材，其中一份打成細(xì)粉，第二份打成粗粉，第三份以飲片提取；加水1000 mL，煎煮30 min制成樣品。按2.2.1的方法制成供試品溶液，按2.1.2的色譜條件，分別測定薯蕷皂苷含量和甘草苷、甘草酸含量。同樣方法分別考察不同浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)、用水量等條件下制備的樣品中甘草苷、甘草酸和薯蕷皂苷含量。結(jié)果細(xì)粉提取容易煮糊，故不考慮細(xì)粉提取，其他結(jié)果以飲片投料、浸溶時(shí)間40 min時(shí)3種成分含量測定結(jié)果較好，且煎煮時(shí)間超過120 min以后成分含量沒有明顯增加，煎煮3次與煎煮2次的煎液成分含量相當(dāng)(表4～8)。

表4 粉碎度的影響 μg

表5 不同浸泡時(shí)間的影響 μg

表6 不同煎煮時(shí)間的影響 μg

表7 不同煎煮次數(shù)的影響 μg

表8 不同用水量的影響 μg

2.2.3 正交試驗(yàn) 選擇影響提取效果的4個(gè)主要因素：頭煎水量(A)、頭煎時(shí)間(B)、二煎水量(C)、二煎時(shí)間(D)進(jìn)行考察。各因素選擇三個(gè)水平(表9)按L9(34)正交設(shè)計(jì)進(jìn)行9次實(shí)驗(yàn)(表10)，分別檢測不同條件下薯蕷皂苷、甘草苷和甘草酸含量，并進(jìn)行方差分析。

根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表11)可知，各因素薯蕷皂苷影響依次為B>A>C>D，最佳組合因素為A2B3C3D2；對(duì)甘草苷的影響依次為B>D>C>A，最佳組合因素為A2B3C3D3；對(duì)甘草酸的影響依次為B>A>C>D，最佳組合因素為A2B3C3D3。綜合考慮確定最佳工藝條件為A2B3C3D3，即頭煎水量6倍，頭煎90 min，二煎水量6倍，二煎時(shí)間60 min。

表9 因素水平表

表10 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表11 不同煎煮條件對(duì)成分含量的影響

2.2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為了確保該提取工藝的可行性與合理性，按照上述提取方案，進(jìn)行了6次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見表12。

表12 金匱薯蕷膏樣品含量測定(n=6) μg·g-1

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道薯蕷丸在臨床上對(duì)慢性疲勞綜合征、圍絕經(jīng)期女性慢性蕁麻疹以及輔助治療肝癌惡病質(zhì)、腫瘤相關(guān)性厭食均有顯著療效[3-7]，應(yīng)用中既有用蜜丸也有用湯劑。依據(jù)原方改制成煎膏劑金匱薯蕷膏，融湯劑、蜜丸的優(yōu)點(diǎn)于一體，能夠最大限度保留原方湯劑和蜜丸劑的共同特點(diǎn)，更加契合養(yǎng)生、保健的用藥習(xí)慣與消費(fèi)需求。原方中重用薯蕷(山藥)、甘草各為君、臣[8]，用藥劑量遠(yuǎn)大于其他藥味。而薯蕷皂苷、甘草酸和甘草苷分別是山藥和甘草的重要特征有效成分[9-13]，處方中含山藥、甘草的復(fù)方制劑也多以這些成分建立制劑定量標(biāo)準(zhǔn)[14-15]。故本研究以之為定量指標(biāo)建立質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)對(duì)生產(chǎn)工藝進(jìn)行考察，有一定的理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

在劑型改制過程中，提取工藝是其技術(shù)關(guān)鍵。本研究參考文獻(xiàn)報(bào)道[16-18]，以薯蕷皂苷、甘草酸、甘草苷等有效成分為檢測指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)金匱薯蕷膏的提取工藝因素進(jìn)行篩選。研究結(jié)果表明，以中藥飲片形式投料，加6倍水量煎煮90 min，過濾后再加6倍水量煎煮時(shí)間60 min，即可最大限度保留有效成分。根據(jù)此工藝制備的金匱薯蕷膏中薯蕷皂苷、甘草酸、甘草苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為160～316、1440～1792、363～766 μg·g-1?？紤]到中藥材的來源、加工方法以及大生產(chǎn)與小批量實(shí)驗(yàn)的差異，金匱薯蕷膏的質(zhì)量定量標(biāo)準(zhǔn)以薯蕷皂苷、甘草酸、甘草質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于160、1440、363 μg·g-1為宜，該工藝可為大規(guī)模生產(chǎn)金匱薯蕷膏建立生產(chǎn)操作規(guī)程提供參考。在單因素試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，煎煮120 min所測得的甘草酸和甘草苷含量增加比例并不高，薯蕷皂苷含量還稍有下降。繼續(xù)延長煎煮時(shí)間還會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加。故綜合考慮，在優(yōu)化工藝考察時(shí)排除了煎煮時(shí)間120 min這個(gè)考察條件。

文獻(xiàn)報(bào)道了以甘草酸為檢測目標(biāo)建立的薯蕷丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[19]，高效液相色譜法檢測薯蕷皂苷元含量建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)在其他制劑中有較多報(bào)道[20]。但以高效液相色譜法同時(shí)檢測甘草酸、甘草苷和薯蕷皂苷3種組分含量尚未見報(bào)道。就金匱薯蕷膏而言，處方組分多、成分復(fù)雜是建立質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的主要難點(diǎn)。研究結(jié)果表明，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動(dòng)相A，以0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相B，進(jìn)樣量20 μL，以1.0 mL·min-1流速進(jìn)行梯度洗脫，甘草苷、甘草酸和薯蕷皂苷分別在49.5～992、30～1200、36～720 μg·mL-1具有良好的線性關(guān)系。滿足一次進(jìn)樣同時(shí)檢測3種有效成分含量的要求，操作方法較為簡便，可為建立金匱薯蕷膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樣品中3種檢測成分的含量差距較大，同等取樣量時(shí)甘草酸峰值高而薯蕷皂苷峰值偏低，是否可以通過改變?nèi)恿糠謩e檢測不同成分含量，亦或是以參考薯蕷皂苷元為檢測目標(biāo)建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)更為理想，還有待進(jìn)一步研究。