參蓮提取物對ox-LDL誘導的巨噬細胞泡沫化和凋亡的藥效學研究及提取部位活性比較△

趙正，李琦，尹婕，孫立東，冉慶森，李玉潔，王婭杰，陳穎，楊慶，翁小剛，蔡維艷，朱曉新

1.安徽中醫(yī)藥大學，安徽 合肥 230038；2.中國中醫(yī)科學院 中藥研究所，北京 100700

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種內源性促炎和抗炎失衡所引起的慢性炎癥性疾病[1-2]。巨噬細胞跨膜蛋白B型清道夫受體-CD36可以無限制地攝取氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，形成膽固醇負載的泡沫細胞[3-4]，而巨噬細胞源性泡沫細胞的凋亡是被公認為形成AS壞死核心的關鍵步驟[5]。ox-LDL可促使巨噬細胞內質網(wǎng)功能紊亂，通過激活內質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)凋亡相關蛋白酶Caspase-12，誘導細胞凋亡[6-8]。而巨噬細胞的大量凋亡、炎癥消散功能的缺失、斑塊的不穩(wěn)定性均與ERS機制相關[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)[6，11]，通過緩解ox-LDL誘導的ERS，抑制巨噬細胞的凋亡，同時加強清除脂質和凋亡細胞的能力，可以達到抗炎與促炎癥消散平衡的過程。因此，從炎癥消散的角度，提高巨噬細胞對脂質過氧化物清除的有效性，有利于減緩AS的進展。

參蓮(SL)提取物是以丹參和穿心蓮不同有效部位按照臨床劑量5∶3進行配伍，在活血化瘀的基礎上引藥入心，清解血分毒熱[12]。前期研究結果表明，SL提取物能夠有效抑制AS模型小鼠斑塊的形成[13]，改善促炎介質和炎癥消散介質的失衡[14]，抑制LPS誘導的巨噬細胞的極化[15]。然而SL提取物能否以巨噬細胞為靶點，通過緩解脂質過氧化物誘導的內質網(wǎng)應激，抑制巨噬細胞源泡沫細胞的凋亡，促進炎癥消散，干預AS炎癥，是本實驗的研究重點。因此，本實驗以ox-LDL誘導的腹腔巨噬細胞炎癥損傷為模型，研究SL提取物對ox-LDL誘導的巨噬細胞泡沫化和凋亡的藥效以及不同提取部位之間的活性比較。

1 材料

HWS-350型細胞培養(yǎng)箱(寧波海曙賽福實驗儀器廠)，IX81倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，Centrifuge 5424R型低溫高速離心機(德國Eppendoff公司)，Centrifuge LEGEND RT+型超高速吊籃離心機(美國Thermo公司)，DYY-6D型電泳儀(北京市六一儀器廠)，spectra max plus 384連續(xù)光譜酶標儀(美國Molecular Device公司)。

氧化型低密度脂蛋白(北京欣盛澤科技有限公司)，衣霉素(美國Sigma公司，貨號：654380)，Brewer改良巰基乙醇酸鹽肉湯(美國BD公司，貨號：6091782)，二甲基亞砜(DMSO，美國amresco公司，貨號：2075C127)，油紅O染色液(北京雷根生物技術有限公司，貨號：DL0009A6)，鈣離子熒光染料Fluo-3 AM(北京索萊寶科技有限公司，貨號：F8841)，Pluronic F127(美國Sigma公司，貨號：P2443)，Hepes緩沖液(北京索萊寶科技有限公司，貨號：H1095)，Hanks平衡鹽溶液(Hank’s Balanced Salt Solution，HBSS，北京索萊寶科技有限公司，貨號：H1045)，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒(美國BD公司，貨號：556547)，Caspase-3活性檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所，貨號：C1116)，Caspase-12抗體(美國Cell Signaling Technology公司，貨號：2202)，TEMED(C6H16N2)(美國sigma公司，貨號：0761)，Tris(三羥甲基氨基甲烷，美國Amresco公司，貨號：77-86-1)，APS(過硫酸銨，美國Sigma公司，貨號：A3678)，BSA(牛血清白蛋白V，美國Amresco公司，貨號：9048-46-8)，RIPA裂解液(碧云天生物技術有限公司，貨號：P0013B)，PMSF(碧云天生物技術有限公司，貨號：090616161212)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京普利萊公司，貨號：PLL-2017-02)。SL提取物由中國中醫(yī)科學院中藥研究所化學室提供(2016年9月中試加工)。

SPF級6～8周齡C57BL/6J雌性小鼠12只，體質量(20±2)g，購于斯坦福北京生物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0002，批號：11401500043418；動物飼養(yǎng)于室溫(25±2)℃、濕度(55±5)%的12 h光暗交替的中國中醫(yī)科學院基礎研究所SPF級實驗動物中心。

2 方法

2.1 樣品制備

SL提取物和各提取部位的制備和質量控制詳細見參考文獻[14]，其中丹參水溶性提取物部位的得率為1.99%，丹參脂溶性提取部位的得率為1.15%，穿心蓮脂溶性提取物的得率為2.43%，按照丹參和穿心蓮臨床劑量5∶3的配伍比例，換算出在SL提取物中，含43.2%丹參水溶性提取物、25%丹參脂溶性提取物和31.8%穿心蓮脂溶性提取物。SL提取物(50 mg)、穿心蓮脂溶性浸膏(15.9 mg)、丹參脂溶性浸膏(12.5 mg)、丹參水溶性浸膏(21.6 mg)充分溶解于DMSO中，儲備液終濃度為50 mg·mL-1。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 腹腔巨噬細胞的提取及分組

3% Brewer改良巰基乙醇酸鹽肉湯1 mL腹腔注射C57BL/6J雌性小鼠，常規(guī)飼養(yǎng)3 d摘除眼球缺血處死，75%乙醇浸泡10 s后取出，無菌條件下將2 mL RPMI-1640培養(yǎng)基快速注入小鼠腹腔內，回抽腹腔灌洗液轉移至15 mL離心管內，此操作重復2次，合并灌洗液，1000 r·min-1離心5 min，棄上清液，用RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細胞，調整細胞密度為1×107個細胞/mL，加入培養(yǎng)板各孔中(每孔2.5 mL)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中貼壁45 min后，洗去未貼壁細胞，加入DMEM完全培養(yǎng)基(每孔2.5 mL)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后加藥。分為陰性對照組(Control)、模型組(Model，ox-LDL，20 mg·L-1)、丹參水溶性提取物組(DS，4.32 mg·L-1+20 mg·L-1ox-LDL)、丹參脂溶性提取物組(DZ，2.5 mg·L-1+20 mg·L-1ox-LDL)、穿心蓮脂溶性提取物組(C，3.18 mg·L-1+20 mg·L-1ox-LDL)、SL提取物組(10 mg·L-1+20 mg·L-1ox-LDL)、內質網(wǎng)應激誘導劑衣霉素組(TM，1 mg·L-1)，其中SL提取物的給藥濃度引用自參考文獻[15]，各提取部位的給藥濃度是以SL提取物10 mg·L-1的給藥濃度與各提取部位的含量相乘計算得到。

2.3 油紅O染色

腹腔巨噬細胞培養(yǎng)于放有細胞爬片的培養(yǎng)板中，細胞加藥24 h后，用1×PBS洗滌2次；放入ORO Fixative固定15 min；取出涂片，放于流通的空氣中15 min；放入新配置好的ORO Stain，浸染15 min；放入60%的異丙醇漂洗30 s，流水沖洗，放入蒸餾水稍微清洗；放入ORO Buffer 1 min；流水沖洗，晾干。置于倒置顯微鏡下觀察拍照。采用Image Pro-Plus 5.0軟件計算陽性細胞的平均分光密度(Integrated OD Average，IA)值(平均分光密度=積分光密度/圖片總面積)。

2.4 Annexin V-FITC/PI檢測細胞凋亡

藥物處理24 h后，用細胞刮刀收集細胞，用1×PBS洗滌兩次，加入300 μL的1×Binding Buffer懸浮細胞；加入2 μL的Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫孵育15 min；上機前5 min加入2 μL的PI染色。用流式細胞儀檢測其凋亡率，在雙變量流式細胞儀的二維散點圖上，左下象限顯示活細胞，為(FITC-/PI-)；右上象限是壞死細胞，為(FITC+/PI+)；而右下象限是凋亡細胞，為(FITC+/PI-)。

2.5 Caspase-3的活性檢測

在收集細胞中按照每200萬細胞加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min；17 000×g，4 ℃離心12 min；把上清液轉移至冰浴預冷的離心管中；蛋白定量后，按試劑盒說明書設置反應體系：檢測緩沖液40 μL，待測樣品40 μL，裂解液10 μL，Ac-DEVD-pNA(2 mmol·L-1)10 μL，總體積為100 μL。37 ℃孵育過夜，酶標儀在405 nm波長處檢測吸光度A值，計算Caspase-3酶的比活力。

2.6 鈣離子熒光染料Fluo-3 AM測細胞內鈣離子濃度

Fluo-3 AM溶解于無水DMSO溶液中，加入20% Pluronic F127的DMSO溶液助溶，制備成5 mmol·L-1的儲備液。用HBSS稀釋制備成5 μmol·L-1的Fluo-3 AM工作液。將Fluo-3 AM工作液加入培養(yǎng)體系中，在37 ℃下培養(yǎng)20 min。加入5倍體積的含有1%胎牛血清的HBSS，再繼續(xù)培養(yǎng)40 min。用1 mol·L-1Hepes溶液洗滌細胞3次，細胞重懸，制備成1×106個細胞/mL的單細胞混懸液。37 ℃下培養(yǎng)10 min，然后用美國BD Biosciences AccuriC6流式細胞儀進行鈣離子熒光檢測。激發(fā)波長506 nm，發(fā)射波長526 nm。

2.7 Western blot法檢測Caspase-12蛋白水平

加藥培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，用預冷的1×PBS洗滌兩次，加入100 μL混合好的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，然后10 000 r·min-1，4 ℃離心20 min，取25 μL上清液，BCA法蛋白定量，另一部分加入5×蛋白上樣緩沖液后煮沸滅活。12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳并恒流轉膜將蛋白轉移到用無水甲醇活化的PVDF膜上，脫脂牛奶封閉2 h，孵育目的蛋白抗體置于4 ℃冰箱過夜，TBST洗3次，每次10 min，室溫孵育二抗2 h，ECL化學發(fā)光于凝膠成像系統(tǒng)中顯影成像，Image J軟件對結果進行灰度掃描分析。

2.8 統(tǒng)計學分析

3 結果

3.1 SL提取物及其提取部位對ox-LDL誘導的腹腔巨噬細胞泡沫化的影響

通過油紅O染色，觀察SL提取物對巨噬細胞吞噬ox-LDL后脂質沉積的影響和比較提取部位的活性差異。與NC組比較，Model組和TM組油紅O染色陽性細胞遍布，細胞內脂滴大而多，其IA值顯著增加(P<0.01，P<0.05)。與Model組比較，C組、SL組細胞內脂滴明顯減少(P<0.01，P<0.01)；DS組和DZ組細胞內脂滴無明顯變化(P>0.05，P>0.05)；但C組和SL組之間的藥效差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。提示，SL整方能夠有效減少細胞內膽固醇蓄積，抑制腹腔巨噬細胞泡沫化，且與穿心蓮脂溶性提取部位藥效相同；而ERS可能進一步增加巨噬細胞內的膽固醇蓄積，促進泡沫細胞的形成。結果見表1、圖1。

表1 SL提取物及其提取部位對ox-LDL誘導的腹腔巨噬細胞脂質沉積的影響

注：與NC組比較，#P<0.05，##P<0.01；與Model組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 SL提取物及其提取部位對ox-LDL誘導的腹腔巨噬細胞凋亡的影響

通過Annexin V-FITC/PI雙染實驗檢測細胞凋亡率。與NC組相比，Model組和TM組顯著誘導腹腔巨噬細胞凋亡(P<0.01，P<0.01)；與Model組比較，DS組、DZ組、SL組均能顯著減少腹腔巨噬細胞凋亡(P<0.01，P<0.01，P<0.01)；C組并未有效減少腹腔巨噬細胞凋亡(P>0.05)；其中SL組的藥效優(yōu)于DS組和DZ組(P<0.01，P<0.05)，但DS組和DZ組之間的藥效差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。提示，SL整方能夠有效抑制巨噬細胞源性泡沫細胞凋亡，藥效優(yōu)于丹參各提取物部位；而ERS可引起巨噬細胞的凋亡。結果見圖2、表2。

圖1 SL提取物及其提取部位對ox-LDL誘導的腹腔巨噬細胞泡沫化的影響(400×)

圖2 SL提取物及其提取部位對ox-LDL誘導的腹腔巨噬細胞凋亡的影響

表2 SL提取物及其提取部位對腹腔巨噬細胞凋亡率的影響

注：與NC組比較，#P<0.05，##P<0.01；與Model組比較，*P<0.05，**P<0.01；DS組、DZ組與SL組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

3.3 SL提取物及其提取部位對ox-LDL誘導的腹腔巨噬細胞Caspase-3活化的影響

細胞凋亡主要通過死亡受體介導的途徑和線粒體途徑共同調控Caspase-3來實現(xiàn)。本實驗檢測了Caspase-3的活性，與NC組相比，Model組和TM組均能顯著上調Caspase-3的活性(P<0.01，P<0.01)。與Model組比較，DZ組、SL組均能降低Caspase-3的活性(P<0.01，P<0.05)；DS組和C組并未有效降低Caspase-3的活性(P>0.05，P>0.05)；其中DZ組的藥效優(yōu)于SL組(P<0.05)。提示，SL整方能夠有效降低Caspase-3的活性，抑制巨噬細胞源性泡沫細胞凋亡，丹參脂溶性提取部位藥效優(yōu)于整方；而ERS能增加Caspase-3的活性，誘導巨噬細胞源性泡沫細胞凋亡。結果見表3。

表3 SL提取物及其提取部位對ox-LDL誘導的腹腔巨噬細胞Caspase-3活性的影響

注：與NC組比較，#P<0.05，##P<0.01；與Model組比較，*P<0.05，**P<0.01；DZ組與SL組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

3.4 SL提取物及其提取部位對ox-LDL誘導的腹腔巨噬細胞內鈣離子濃度增加的影響

細胞內鈣離子濃度的增加是內質網(wǎng)功能紊亂的直接體現(xiàn)。本實驗通過檢測細胞內鈣離子水平，進一步研究SL對脂質吞噬引起的巨噬細胞內質網(wǎng)應激的影響和比較提取部位的活性差異。與NC組相比，Model組和TM組均能提高腹腔巨噬細胞內Ca2+水平(P<0.05，P<0.05)。與Model組相比，DZ組、C組、SL組均能顯著降低腹腔巨噬細胞內Ca2+水平(P<0.01，P<0.01，P<0.01)；DS組并未有效降低腹腔巨噬細胞內Ca2+水平(P>0.05)；其中DZ組的藥效優(yōu)于SL組和C組(P<0.01，P<0.01)，但SL組和C組之間的藥效差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。提示，SL整方能夠有效減少腹腔巨噬細胞中Ca2+水平，緩解內質網(wǎng)應激，且丹參脂溶性提取部位的藥效最優(yōu)；而ERS能促進腹腔巨噬細胞內Ca2+水平增加。結果見圖3、表4。

圖3 SL提取物及其提取部位對ox-LDL誘導的腹腔巨噬細胞內鈣離子濃度增加的影響

表4 SL提取物及其提取部位對ox-LDL誘導的腹腔巨噬細胞鈣離子濃度增加的影響

注：與NC組比較，#P<0.05，##P<0.01；與Model組比較，*P<0.05，**P<0.01；DZ組與SL組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

3.5 SL提取物及其提取部位對ox-LDL誘導的腹腔巨噬細胞casepase-12活化的影響

Caspase-12是一種直接介導ERS誘導凋亡機制的關鍵蛋白酶。本實驗檢測了Caspase-12的活化程度，與NC組相比，Model組和TM組剪切型的Caspase-12蛋白表達水平顯著增加(P<0.01，P<0.05)。與Model組相比，DS組、DZ組、SL組顯著降低剪切型的Caspase-12蛋白表達水平(P<0.01，P<0.01，P<0.01)；C組并未有效降低剪切型的Caspase-12蛋白表達水平(P>0.05)；但DS組、DZ組與SL組之間的藥效差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，P>0.05)。提示，SL整方能夠有效降低Caspase-12的活性程度，緩解內質網(wǎng)應激誘導的腹腔巨噬細胞凋亡，且與丹參各提取部位的藥效相同；而ERS可上調Caspase-12的活化程度。結果見圖4、表5。

圖4 腹腔巨噬細胞casepase-12蛋白表達電泳

組別劑量/mg·L-1CleavedCaspase-12/β-actinNC00.45±0.14Model20.001.33±0.21##DS4.320.52±0.09??DZ2.500.69±0.22??C3.181.07±0.22SL10.000.78±0.10??TM1.000.60±0.32#

注：與NC組比較，#P<0.05，##P<0.01；與Model組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

在As疾病發(fā)生發(fā)展過程中，同時存在著促炎和炎癥消散兩大調控體系，兩種進程間彼此制約且相互轉化[1，16]。其中，主要由巨噬細胞胞葬作用(efferocytosis)介導的脂質過氧化物清除是炎癥消散過程的重要機制[17-18]。在生理狀態(tài)下，有效的胞葬作用可以保證脂質過氧化物等炎癥原在動脈內膜等病灶內的快速有效清除，能夠改變促炎機制的相對激活水平，重塑斑塊局灶的炎癥促-抑平衡，進而保證斑塊局灶內炎癥反應在時空上的精確調控[19-20]。

在病理失衡狀態(tài)下，巨噬細胞吞噬脂質后，引發(fā)內質網(wǎng)應激，誘導泡沫細胞出現(xiàn)生存障礙，導致脂質吞噬物的反復釋放和壞死細胞碎片的大量出現(xiàn)[21-22]。這一病理障礙極大地降低了脂質過氧化炎癥原的清除效率，同時將會引發(fā)更為劇烈且持續(xù)的炎癥損傷，加速壞死核心和不穩(wěn)定斑塊的形成[18，23]。因此，ox-LDL誘導的巨噬細胞的泡沫化和病理性死亡不僅僅是急性心血管事件發(fā)病的重要誘導因素，也是AS疾病進展中炎癥失衡調控具有代表性的體現(xiàn)。綜上所述，巨噬細胞的清除效率和泡沫細胞的生存保護是從炎癥的源頭調控病理性炎癥損傷高強度、長時程進行的關鍵要素，也形成了基于炎癥消散進程的全新有效治療靶點。最新研究表明，通過減少巨噬細胞的凋亡，維持有效的胞葬作用，對動脈粥樣硬化疾病的綜合治療具有明確而積極的意義。

本課題組對SL提取物具有較為深厚的研究積淀和較為系統(tǒng)的藥理學認識。目前研究成果主要集中在：1)物質組成和藥物安全性評價(SL提取物5～40 mg·L-1在各個時間點均無明顯細胞毒性[15])；2)對AS的干預活性和治療價值(SL提取物能夠減少AS斑塊面積，調節(jié)血脂，阻斷AS炎癥反應[13-14])；3)基于抑制促炎反應的抗AS藥理機制研究(SL提取物有效抑制NF-κB的活化，調節(jié)內源性促炎介質和炎癥消散介質的再平衡而達到抑制AS炎癥的作用[14])。上述研究雖然對SL治療AS的主要藥效活性和通過抑制炎癥反應治療AS的藥理機制較為清楚和明確，但SL對炎癥反應平衡調控，特別是對炎癥消散反應的調節(jié)活性仍尚未得到清楚的科學闡釋，同時對提取物中不同組分的活性比較和藥效貢獻度評價仍未涉及?；诖?，本實驗的目的是以巨噬細胞泡沫化形成和泡沫細胞的凋亡為切入點，明確SL提取物全方對AS炎癥消散進程的影響和對脂質過氧化炎癥損傷平衡的重塑；評價和比較SL提取物不同提取組分藥效的貢獻度和活性差異，為SL提取物組方科學性和優(yōu)效性提供初步的研究提示和思路；揭示SL提取物在脂質攝取過程中內質網(wǎng)應激保護的藥理機制。

在上述AS治療的新思路和新靶點的指引下，本研究發(fā)現(xiàn)SL提取物整方可以顯著減少脂質的積累。更為重要的是，我們在機制水平首次創(chuàng)新提出SL提取物能夠通過對泡沫細胞內質網(wǎng)應激的調控，改善巨噬細胞吞噬脂質后的生存障礙，減少泡沫細胞的凋亡，有效搭建起脂質在斑塊內動態(tài)的代謝鏈條，提高了巨噬細胞對脂質的清除效率。因此，本課題在巨噬細胞水平上，從炎癥原(脂質過氧化物)和脂質沉積形成脂質壞死核心的整體角度，揭示了SL提取物促進炎癥消散的藥效和作用機制。

同時，在對SL提取物進行藥效藥理創(chuàng)新研究的基礎上，我們還通過比較各提取部位之間的活性差異，初步從炎癥消散和巨噬細胞對脂質攝取清除的角度，對SL提取物抗AS的成分基礎進行了探索。實驗中，我們發(fā)現(xiàn)，在整方活性可靠穩(wěn)定的基礎上，穿心蓮脂溶性提取物減少脂質沉積的藥效優(yōu)于丹參各提取物部位；丹參脂溶性提取部位和丹參水溶性提取部位減少ERS介導的細胞凋亡的藥效優(yōu)于穿心蓮脂溶性提取部位。上述各提取部位之間藥效的差異可能成為SL復方配伍科學性的重要論據(jù)，為后續(xù)SL提取物配方優(yōu)效性和物質基礎研究提供初步的研究提示。本實驗中設置了誘導內質網(wǎng)應激TM組，實驗發(fā)現(xiàn)TM誘導的ERS可引起巨噬細胞脂質蓄積、鈣離子濃度升高、Caspase-3活性增加、Caspase-12活化程度增加，誘導巨噬細胞源泡沫細胞凋亡。TM組實驗結果與ox-LDL組誘導的巨噬細胞泡沫化和凋亡結果相符，進一步提示SL提取物減少脂質過氧化物誘導泡沫細胞凋亡的機制可能與ERS有關。

未來研究中我們將著力在分子水平開展SL提取物調控內質網(wǎng)應激的信號通路研究，論證其減少泡沫細胞凋亡的具體作用機制。特別是針對穿心蓮脂溶性提取物減少脂質沉積的情況，我們將依據(jù)脂質炎癥原在動脈粥樣硬化病灶內“攝取-轉化-流出”動態(tài)平衡調控的理論基礎，從巨噬細胞膽固醇攝取、酯化和外排的角度進一步開展研究，探究其抑制泡沫細胞形成的具體作用機制。同時，我們還擬將進一步圍繞“斑塊局灶內脂質代謝的完整鏈條”，從炎癥細胞遷出的角度，更加全面地揭示出SL提取物促進脂質過氧化病理性炎癥消散的活性特征。