口服胰島素腸溶聚合物脂質(zhì)雜化納米粒的制備與評(píng)價(jià)

林 霞，李 娜，李金蔚，楊子毅，金 堅(jiān)

(江南大學(xué)藥學(xué)院，無錫 214122)

糖尿病已成為目前全球最嚴(yán)重的健康問題之一，根據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會(huì)的數(shù)據(jù)，全球成年糖尿病患者人數(shù)在2017年已經(jīng)達(dá)到4.25億，預(yù)計(jì)到2045年將達(dá)到6.29億。而中國是糖尿病患者最多的國家，約有1.14億糖尿病患者[1]。胰島素(INS)是一種廣泛應(yīng)用于糖尿病患者的生物大分子藥物，其半衰期短，脂溶差，不易穿透生物膜，長期以來一直以注射給藥為主。這種給藥方式不僅順應(yīng)性差，還會(huì)出現(xiàn)一些不良反應(yīng)(如耐藥和注射部位炎癥、硬結(jié)等)[2]。

為此，許多國內(nèi)外學(xué)者致力于INS非注射劑型的研究與應(yīng)用，如口服制劑、鼻用制劑、肺部給藥系統(tǒng)等[3-6]。自諾和諾德公司宣布放棄口服胰島素研發(fā)后，目前僅有Diasome公司的HDV-I和Oramed公司的ORMD-0801胰島素膠囊進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)[7-8]。目前，關(guān)于胰島素口服給藥系統(tǒng)的研究主要集中于脂質(zhì)體、納米粒、膠囊、微球、乳劑等[9]。其中，納米粒作為蛋白多肽類藥物的口服給藥載體時(shí)，由于其不僅能防止藥物被消化道內(nèi)的強(qiáng)酸和消化酶降解，而且在腸道中納米?？梢砸哉w形式被Peyer淋巴結(jié)上的M細(xì)胞吞噬，通過腸黏膜上的淋巴系統(tǒng)吸收，或者通過細(xì)胞間通道吸收[10]，已成為胰島素口服給藥系統(tǒng)的研究熱點(diǎn)之一。近年來，研究發(fā)現(xiàn)將胰島素包載于聚合物-脂質(zhì)雜化納米粒中，可有效控制藥物釋放，且可獲得較高的包封率[10]。Sun等[11]以胰島素-油酸鈉復(fù)合物和聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)制備的納米粒口服生物利用度為37.7%。但當(dāng)以親水性載體材料制備納米粒時(shí)，載體易溶解于組織液中，無法控制蛋白藥物在胃腸道中緩慢釋放；以疏水性材料為載體時(shí)，由于胰島素的高度親水性，二者相容性差、包封率低，且很容易引起突釋，仍無法控制藥物在胃腸道中緩慢釋放[12]。因此，研究一種可在胃腸道中穩(wěn)定緩慢釋放并有效吸收的口服胰島素制劑仍是目前多肽蛋白藥物口服給藥系統(tǒng)亟需解決的問題。

本研究擬以兩親性高分子載體PEG-PLA為聚合物載體材料，以磷脂s75為脂質(zhì)材料、制備胰島素聚合物脂質(zhì)雜化納米粒(INS-NPs)，再將INS-NPs與腸溶材料Eudragit L100混合，制備胰島素口服腸溶聚合物脂質(zhì)雜化納米粒(INS-NPs L100)；以包封率、粒徑和體外釋放為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行處方優(yōu)化，并對(duì)最優(yōu)處方進(jìn)行健康大鼠降血糖作用評(píng)價(jià)，旨在探索出一種在胃腸道中可緩慢釋放、生物利用度較高的胰島素口服給藥系統(tǒng)，為口服胰島素提供新的研究思路。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

胰島素(insulin，INS，江蘇萬邦生化醫(yī)藥有限公司，效價(jià)27 IU/mg，批號(hào)1806A11)；膽酸鈉(sodium cholate，SC，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；單甲氧基聚乙二醇聚乳酸共聚物(mPEG5000-PLA14808，PEG-PLA，山東濟(jì)南岱罡生物科技有限公司)；單、雙硬脂酸甘油酯(geoleol mono and diglycerides NF，GMD，批號(hào)158661法國Gattefosse公司)；磷脂s75(德國Lipoid公司)；泊洛沙姆188(Poloxamer 188，德國巴斯夫公司)；聚丙烯酸樹脂L100 (Eudragit?L100，德國Evonik公司)；鄰苯二甲酸羥丙甲基纖維素酯55(HP-55，信越化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社)；胃蛋白酶和胰酶(上海麥克林生化科技有限公司)；乙腈為色譜純，其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

高效液相色譜系統(tǒng)(Agilent 1260，美國安捷倫公司)；JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；T18高速剪切分散機(jī)(德國IKA公司)；超速冷凍離心機(jī)(天美科學(xué)儀器有限公司)；SU-1510掃描電子顯微鏡(日本日立株式會(huì)社)；NICOMPTM380ZLS動(dòng)態(tài)光散射粒度測定儀(美國PSS公司)；冷凍干燥機(jī)(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司)；MX-S渦旋儀(美國Scilogex公司)；BSA24S電子天平(德國賽多利斯公司)；pH計(jì)(瑞士Mettler Toledo公司)；血糖儀(三諾生物傳感股份有限公司)。

1.3 動(dòng) 物

SPF雄性SD大鼠，(250±20) g，購于昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(蘇)2018-0006，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)No.201806730，倫理審核編號(hào)JN.No20180430S0250531[71]。

2 方 法

2.1 胰島素經(jīng)口腸溶聚合物脂質(zhì)雜化納米粒(INS-NPs L100)的制備

2.1.1 胰島素聚合物脂質(zhì)雜化納米粒(INS-NPs)的制備 采用W/O/W復(fù)乳-溶劑揮發(fā)法制備INS-NPs。稱取適量胰島素和膽酸鈉，溶解于0.01 mol/L鹽酸溶液作為內(nèi)水相。精密稱取適量PEG-PLA和脂質(zhì)超聲溶解于乙酸乙酯中作為油相。另配制1% Poloxamer 188水溶液作為外水相。將內(nèi)水相邊渦旋邊注入油相中，渦旋0.5 min，然后冰水浴探針式超聲3 min，功率40%，形成W/O初乳。再將初乳在高速攪拌下注入外水相中，8 000 r/min攪拌0.5 min，然后常溫水浴探針式超聲6 min，超聲功率60%，形成W/O/W的復(fù)乳。37 ℃下將所得復(fù)乳減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至乙酸乙酯揮發(fā)完全，即得胰島素聚合物脂質(zhì)雜化納米粒 (INS-NPs)。

2.1.2 INS-NPs L100的制備 將INS-NPs與10%腸溶材料水溶液等體積混勻，再加入適量2 mol/L鹽酸溶液使之沉淀，12 000 r/min離心10 min，收集沉淀，冷凍干燥，即得INS-NPs L100。

2.2 INS-NPs的粒徑、多分散系數(shù)(PDI)及Zeta電位的測定

將INS-NPs用去離子水稀釋至適當(dāng)濃度，采用動(dòng)態(tài)光散射粒度測定儀測定粒徑、PDI及Zeta電位。

2.3 載藥量和包封率的測定

2.3.1 色譜條件 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫公司)，流動(dòng)相：0.2 mol/L無水硫酸鈉溶液(pH 2.3)-乙腈(73∶27)，檢測波長：214 nm，流速：1 mL/min，柱溫：40 ℃，進(jìn)樣量：20 μL，胰島素的濃度采用外標(biāo)法以峰面積定量。

2.3.2 載藥量的測定 精密稱取適量INS-NPs L100于10 mL量瓶中，加入pH 6.8磷酸鹽緩沖液1 mL使包衣材料溶解，再加入乙腈2 mL超聲使納米粒溶解，用0.01 mol/L 鹽酸稀釋至刻度。15 000 r/min離心10 min，取上清液，進(jìn)樣，測定峰面積。按外標(biāo)法計(jì)算出胰島素的濃度，按公式(1)計(jì)算載藥量：

載藥量=(胰島素濃度×10 mL)/INS-NPs L100的質(zhì)量×100%

(1)

2.3.3 包封率的測定 取新制備的INS-NPs溶液6 mL，超高速離心機(jī)離心1 h，轉(zhuǎn)速30 000 r/min，以分離未游離的胰島素，收集上清溶液。胰島素含量用HPLC法測定，按公式(2)計(jì)算納米粒包封率(encapsulation efficiency，EE):

包封率(%)=(投入胰島素總量-上清液中游離胰島素量)/投入胰島素總量×100

(2)

2.4 INS-NPs L100的體外釋放

將凍干的INS-NPs L100 20 mg分散于pH 1.0的介質(zhì)45 mL中，于37 ℃、100 r/min水浴搖床中釋放，2 h時(shí)加入0.2 mol/L磷酸鈉溶液15 mL，調(diào)pH為6.8。即溶出條件為37 ℃，100 r/min，0～2 h在pH 1.0鹽酸介質(zhì)中，2～8 h在pH 6.8的溶出介質(zhì)中，分別于5 min和1、2、2.25、2.5、2.75、3、4、6、8 h取出溶出介質(zhì)200 μL,并補(bǔ)充等體積的新鮮溶出介質(zhì)200 μL，采用HPLC測定游離胰島素含量，繪制累積藥物釋放曲線。

2.5 INS-NPs的表面形態(tài)

將少量凍干后的納米粒和包裹腸溶材料的納米粒涂在導(dǎo)電硅膠黏性面，然后真空噴金，在掃描電子顯微鏡下觀察粒子的外貌形態(tài)。

2.6 INS-NPs L100在人工胃液中的穩(wěn)定性試驗(yàn)

參照《中華人民共和國藥典》(2015年版)四部0921附注，配制人工胃液(SGF)。

分別稱取INS NPs和INS-NPs L100 50 mg各3份，分別分散于裝有人工胃液5 mL的離心管中，再將離心管置37 ℃、100 r/min水浴搖床孵育。分別于5 min、1 h和2 h，采用HPLC法測定人工胃液中INS-NPs和INS-NPs L100的胰島素濃度，計(jì)算胰島素百分含量。

2.7 INS-NPs L100在人工腸液中的穩(wěn)定性試驗(yàn)

參照《中華人民共和國藥典》(2015年版)四部0921附注，配制人工腸液(SIF)。

分別稱取INS NPs、INS-NPs L100和INS-NPs+Eudragit?L100物理混合物50 mg各3份，分別分散于裝有人工腸液5 mL的離心管中，再將離心管置于37 ℃、100 r/min水浴搖床孵育。分別于5 min、3 h和6 h測定人工腸液中INS-NPs和INS-NPs L100的胰島素濃度，計(jì)算胰島素百分含量。

2.8 健康大鼠經(jīng)口給藥降血糖試驗(yàn)

將24只雄性SD大鼠隨機(jī)分成4組，實(shí)驗(yàn)組每組6只，給藥前禁食不禁水12 h。陽性對(duì)照組：皮下注射胰島素注射液，參考文獻(xiàn)[11]給藥劑量設(shè)定為1 IU/kg；陰性對(duì)照組：灌胃給予復(fù)溶后的空白納米粒(NP L100)；實(shí)驗(yàn)組A：灌胃給予復(fù)溶后的INS-NPs，參考文獻(xiàn)[11]給藥劑量設(shè)定為38 IU/kg；實(shí)驗(yàn)組B：灌胃給予用1%的羧甲基纖維素鈉(CMCNa)混懸的INS-NPs L100，20 IU/kg。于給藥前0 h和給藥后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、8和10 h尾靜脈取血，采用血糖儀測定大鼠的血糖濃度。

以血糖濃度下降百分比繪制血糖下降百分比-時(shí)間曲線，血糖下降百分比=t時(shí)血糖濃度/0時(shí)血糖濃度×100%。

3 結(jié) 果

3.1 INS-NPs L100處方優(yōu)化

前期試驗(yàn)研究顯示內(nèi)水相與油相體積比為1∶5，油相與外水相體積比為1∶8時(shí)，所制備的納米粒粒徑最小。因此，確定W/O/W體積比為1∶5∶40條件下進(jìn)行其他處方因素的優(yōu)化。

3.1.1 胰島素與膽酸鈉物質(zhì)的量比的確定 胰島素具有高度親水性，脂溶性差，采用傳統(tǒng)的W/O/W法所制備的納米粒EE很低，不足20%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，將胰島素與膽酸鈉制備成脂質(zhì)復(fù)合物，能顯著改善胰島素的脂溶性，從而能提高納米粒的EE[13-14]。因此，本研究以膽酸鈉為脂質(zhì)復(fù)合物材料，制備胰島素-膽酸鈉脂質(zhì)復(fù)合物，以提高EE。對(duì)胰島素與膽酸鈉的物質(zhì)的量比進(jìn)行了考察，胰島素與膽酸鈉的物質(zhì)的量比對(duì)INS-NPs的粒徑和EE的影響如圖1所示。結(jié)果顯示，隨著膽酸鈉比例的增加，納米粒的EE逐漸增加，粒徑逐漸減小，當(dāng)胰島素與膽酸鈉的物質(zhì)的量比為1∶22.5時(shí)，所制備的納米粒EE最高為75.98%，粒徑最小。繼續(xù)增加膽酸鈉比例時(shí)，EE不再增加，粒徑反而增大。因此，確定胰島素與膽酸鈉的物質(zhì)的量比為1∶22.5。

3.1.2 PEG-PLA質(zhì)量濃度的確定 對(duì)PEG-PLA在油相中的質(zhì)量濃度(20、30、40 mg/mL)進(jìn)行了考察，PEG-PLA對(duì)納米粒的粒徑和EE的影響如圖2所示。由圖2可知，隨著PEG-PLA質(zhì)量濃度增加，EE無明顯增加的趨勢，盡管PEG-PLA質(zhì)量濃度為20 mg/mL時(shí)EE較高，但粒徑較大。綜合考慮EE和粒徑，優(yōu)選PEG-PLA質(zhì)量濃度為30 mg/mL。

3.1.3 胰島素質(zhì)量濃度的確定 對(duì)內(nèi)水相中胰島素質(zhì)量濃度(10、15、20 mg/mL)進(jìn)行考察，其對(duì)INS-NPs粒徑及EE的影響如圖3所示，隨著胰島素質(zhì)量濃度的增加，EE逐漸增加。但由于胰島素在0.01 mol/L HCl中的質(zhì)量濃度大于20 mg/mL后便不易迅速溶解，因此確定內(nèi)水相中胰島素質(zhì)量濃度為20 mg/mL。

3.1.4 脂質(zhì)材料的確定 比較了磷脂s45、s75和GMD 3種脂質(zhì)對(duì)INS-NPs的EE和粒徑的影響，結(jié)果如圖4-A所示。結(jié)果顯示，由GMD制備的納米粒EE最高，粒徑最小。將所制備的3種INS-NPs參照“2.1.2”項(xiàng)下方法以Eudragit L100為腸溶材料分別制備成INS-NPs L100腸溶制劑后，對(duì)其體外藥物釋放進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果如圖4-B所示。結(jié)果顯示，以磷脂s75為脂質(zhì)材料所制備的INS-NPs L100在人工腸液(pH 6.8磷酸鹽緩沖液)中藥物釋放速度最慢，以GMD為脂質(zhì)材料所制備的INS-NPs L100在人工腸液(pH 6.8磷酸鹽緩沖液)中藥物釋放速度最快。因此確定以磷脂s75為脂質(zhì)材料制備INS-NPs L100。

GMD：Geoleol mono and diglycerides NF

3.1.5 磷脂s75與PEG-PLA質(zhì)量比的確定 由于脂質(zhì)材料與聚合物材料的比例不同，導(dǎo)致載體與胰島素的相互作用不同，有機(jī)相黏度也不同，進(jìn)而影響INS-NPs的粒徑、EE和藥物釋放速度。因此，本研究考察了磷脂s75與PEG-PLA的質(zhì)量比對(duì)INS-NPs的EE和粒徑影響，結(jié)果如圖5-A所示。由圖5-A可知，隨著磷脂s75與PEG-PLA的質(zhì)量比的增加，EE呈現(xiàn)先增加后不變或微降的趨勢。當(dāng)磷脂s75與PEG-PLA的質(zhì)量比為1∶10時(shí)EE最高，為70.24%，粒徑最小，為153.3 nm。

以Eudragit L100為腸溶材料，將上述INS-NPs制備成INS-NPs L100腸溶制劑，進(jìn)一步評(píng)價(jià)磷脂s75與PEG-PLA的質(zhì)量比對(duì)藥物釋放的影響，結(jié)果如圖5-B所示。圖5-B顯示，隨著脂質(zhì)比例的增加，釋放減慢。當(dāng)磷脂s75與PEG-PLA的比例為1∶5時(shí)，釋放最為緩慢，pH 1.0鹽酸溶液中2 h的累積釋放量小于10%，pH 6.8磷酸鹽緩沖液8 h的累積釋放為67.31%。由于納米粒在體內(nèi)釋放越慢越有利于提高胰島素在胃腸道中的穩(wěn)定性，進(jìn)而提高其生物利用度，故確定脂質(zhì)材料為磷脂s75及其與PEG-PLA的質(zhì)量比1∶5。

根據(jù)上述研究結(jié)果，最終確定胰島素與膽酸鈉的物質(zhì)的量比為1∶22.5，PEG-PLA的質(zhì)量濃度為30 mg/mL，胰島素質(zhì)量濃度為20 mg/mL，脂質(zhì)材料為磷脂s75與PEG-PLA的比例為1∶5，即磷脂s75的質(zhì)量濃度為6 mg/mL。

3.1.6 腸溶材料的確定 本研究選用腸溶制劑常用的兩類腸溶材料，包括纖維素酯類HP-55和聚丙烯酸樹脂類Eudragit L100，分別制備胰島素腸溶制劑(INS-NPs HP55和INS-NPs L100)，評(píng)價(jià)腸溶材料種類對(duì)胰島素腸溶制劑藥物釋放的影響，結(jié)果如圖6-A所示。結(jié)果顯示，INS-NPs HP55在pH 1.0鹽酸水溶液中，2 h時(shí)累積釋放量高達(dá)50%；而INS-NPs L100在pH 1.0鹽酸水溶液中2 h的累積釋放量僅為8.01%，釋放速度顯著低于INS-NPs HP55。在pH6.8磷酸緩沖液中1 h時(shí)，INS-NPs HP55藥物累積釋放量已達(dá)80%以上，INS-NPs L100的釋放速度顯著低于INS-NPs HP55。由此可見，INS-NPs L100在人工胃液和人工腸液中的藥物釋放速度均顯著低于INS-NPs HP55。因此，確定以Eudragit L100為腸溶材料，制備胰島素腸溶制劑。

3.1.7 Eudragit L100濃度的確定 由于Eudragit L100濃度(即腸溶材料與INS-NPs的質(zhì)量比)可直接影響腸溶材料對(duì)INS-NPs的包載作用，因此，本研究以藥物釋放速度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)Eudragit L100濃度進(jìn)行了考察，結(jié)果如圖6-B所示。結(jié)果顯示，當(dāng)Eudragit L100濃度為2%時(shí)，所制備的INS-NPs L100在pH 1.0鹽酸水溶液中5 min時(shí)的藥物累積釋放已達(dá)到70%以上，幾乎無腸溶作用。隨著Eudragit L100濃度的增加，INS-NPs L100在人工胃液和人工腸液中的藥物釋放速度逐漸降低。當(dāng)Eudragit L100濃度增加至10%時(shí)，在pH 1.0鹽酸水溶液中2 h時(shí)的藥物釋放量不足8%，在pH 6.8緩沖液中也具有明顯的緩釋效果。因此，最終確定Eudragit L100濃度為10%。

3.2 INS-NPs L100的表征

采用優(yōu)化后的處方制備INS-NPs L100，并對(duì)其粒度分布、EE、體外藥物釋放進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)。

3.2.1 粒度分布及Zeta電位的測定 采用動(dòng)態(tài)光散射粒度測定儀測定最優(yōu)處方制備的Ins-NPs和INS-NPs L100復(fù)溶后的粒度分布及其Zeta電位，結(jié)果顯示，Ins-NPs的平均粒徑為225.2 nm，PDI為0.191，Zeta電位為-14.84 mV。INS-NPs L100經(jīng)人工腸液復(fù)溶后的平均粒徑為278.0 nm，多分散系數(shù)為0.596，Zeta電位為-13.21 mV，均較新制備的INS-NPs略有增加。

3.2.2 載藥量與包封率的測定 采用HPLC測得凍干后的INS-NPs L100載藥量為8.34 μg/mg，EE為62.18%。

3.2.3 形態(tài)學(xué)觀察 采用掃描電鏡對(duì)INS-NPs經(jīng)腸溶衣包裹前后的表面形態(tài)進(jìn)行觀察，如圖7所示。圖7-A為按最優(yōu)處方制備的INS-NPs的外觀形態(tài)，呈現(xiàn)為淡藍(lán)色膠體體系。圖7-B為經(jīng)凍干后INS-NPs的表面形態(tài)，可明顯觀察到大量球形粒子，且分散性良好。而上述INS-NPs經(jīng)Eudragit L100腸溶材料包裹后所制備的INS-NPs L100腸溶制劑，呈片塊狀，表面僅可觀察到少量球形納米粒子(圖7-C箭頭所示)。上述結(jié)果表明，經(jīng)Eudragit L100腸溶材料包裹后，可將大部分INS-NPs包裹于腸溶制劑內(nèi)部。

Figure7 Photo pictures of INS-NPs solution (A)，and the morphology of INS-NPs (B) and INS-NPs L100 (C) observed by scanning electron microscope

3.2.4 INS-NPs L100體外釋放 為模擬藥物口服給藥后在胃中及從胃進(jìn)入小腸中的釋放，分別考察了INS-NPs和INS-NPs L100在pH 1.0鹽酸水溶液(0～2 h)和pH 6.8磷酸鹽緩沖液(2～8 h)的藥物釋放，釋放曲線如圖8所示。結(jié)果顯示，INS-NPs在pH 1.0鹽酸水溶液中，5 min時(shí)已釋放94.2%，最大累積釋放量為95.83%；INS-NPs L100在pH 1.0的鹽酸水溶液中2 h的累積釋放量為8.01%，在pH 6.8的磷酸鹽緩沖液8 h的累積釋放量為67.31%，較INS-NPs有明顯的腸溶緩釋效果。

3.2.5 INS-NPs L100在人工胃液和人工腸液中的穩(wěn)定性 為進(jìn)一步確證INS-NPs L100能提高在胃腸道中的穩(wěn)定性，本研究對(duì)INS-NPs L100和INS-NPs在SGF和SIF中的穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果如圖9所示。

圖9-A顯示，INS-NPs在人工胃液中5 min后胰島素濃度已低于檢測限，表明INS-NPs中的胰島素可迅速被胃蛋白酶降解，胃穩(wěn)定性差。而INS-NPs L100在37 ℃的人工胃液中孵育2 h后仍未溶解，胰島素百分含量高達(dá)75.36%，胰島素降解百分比不足25%。與INS-NPs相比，INS-NPs L100在SGF中的穩(wěn)定性顯著提高，這是由于INS-NPs在人工胃液中胰島素釋放速度快，5 min時(shí)已釋放大部分藥物，導(dǎo)致所釋放的胰島素迅速被胃蛋白酶降解，穩(wěn)定性差；而INS-NPs L100在人工胃液中藥物釋放速度慢，大部分胰島素被包載于腸溶制劑內(nèi)部，可有效避免胃蛋白酶的降解，穩(wěn)定性顯著提高。

圖9-B顯示，INS-NPs在人工腸液中穩(wěn)定性差，5 min后胰島素濃度已低于檢測限。而INS-NPs L100在人工腸液中37 ℃孵育5 min后胰島素含量約為50%，6 h后胰島素含量仍為39.28%，穩(wěn)定性顯著提高。此外，研究發(fā)現(xiàn)，INS-NPs與Eudragit L100的物理混合物在人工腸液中初始穩(wěn)定性較好，孵育5 min時(shí)胰島素含量約為40%；但3 h時(shí)，胰島素含量已降至10%以下，這可能是由于Eudragit L100可以抑制胰酶活性，從而提高胰島素穩(wěn)定性。與INS-NPs相比，INS-NPs L100可顯著提高胰島素在人工腸液中的穩(wěn)定性，這可能是由于以下兩方面原因：一方面是由于Eudragit L100可能會(huì)抑制胰酶活性，使穩(wěn)定性提高；另一方面可能是由于將INS-NP制備成腸溶制劑后，粒徑增大，在人工腸液中藥物釋放速度明顯變慢，進(jìn)而提高了胰島素的穩(wěn)定性。

上述結(jié)果表明，與INS-NPs相比，INS-NPs L100可顯著提高胰島素在人工胃液和人工腸液中的穩(wěn)定性，有望提高胰島素口服降血糖作用。

3.3 INS-NPs L100對(duì)健康大鼠的降血糖作用

以皮下注射胰島素溶液為陽性對(duì)照組，對(duì)INS-NPs、INS-NPs L100、空白腸溶納米粒(NPs L100)經(jīng)口給予健康大鼠后的降血糖作用進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果如圖10所示。結(jié)果顯示，經(jīng)皮下注射給予大鼠胰島素溶液后，血糖濃度迅速下降，1.5 h降至最低水平，4 h后恢復(fù)至正常血糖濃度，降血糖作用約持續(xù)了4 h。經(jīng)口給予大鼠空白腸溶制劑(NPs L100)后，無明顯降血糖作用，表明本研究所使用的載體材料對(duì)血糖無明顯作用。經(jīng)口給予INS-NPs的大鼠在給藥后2 h血糖濃度出現(xiàn)略微降低，在2.5 h血糖濃度降至最低，為初始血糖濃度的94%，幾乎無明顯降血糖作用；經(jīng)口給予INS-NPs L100的大鼠在2 h血糖濃度開始降低，2.5 h血糖濃度為初始濃度的91%，于3.5 h降至最低，為初始濃度的76%，具有明顯的降血糖作用，且降血糖作用約持續(xù)了8 h。此外，經(jīng)口給予INS-NPs和NPs L100后0.5 h血糖濃度均出現(xiàn)異常升高現(xiàn)象，可能是由于在大鼠尾靜脈取血時(shí)對(duì)動(dòng)物造成一定的刺激所導(dǎo)致的應(yīng)激反應(yīng)。

上述結(jié)果表明，與皮下注射胰島素溶液相比，INS-NPs L100降血糖作用持續(xù)時(shí)間更久，具有明顯的緩釋效果。與INS-NPs相比，INS-NPs L100降血糖作用更優(yōu)。這與體外釋放結(jié)果及在人工胃液和人工腸液中的穩(wěn)定性結(jié)果相一致。將胰島素制備成INS-NPs，直接灌胃后，由于藥物在胃中釋放速度極快，5 min即可達(dá)到90%以上，導(dǎo)致所釋放的胰島素在胃蛋白酶作用下快速失活，從而導(dǎo)致無明顯的降血糖作用。而對(duì)于INS-NPs L100，其在胃液中釋放速度極慢，2 h時(shí)釋放量不足8%，從而使胰島素在胃中穩(wěn)定性大幅度提高；經(jīng)胃排空作用進(jìn)入腸段后，腸溶載體逐漸溶解，釋放出INS-NPs，由于其粒徑增大，藥物釋放速度減慢，腸中穩(wěn)定性提高，可保證部分在胰島素INS-NPs憑借脂質(zhì)材料的親脂性，以整體形式進(jìn)入體循環(huán)，逐漸釋放胰島素，發(fā)揮持續(xù)降血糖作用。

4 討 論

胰島素與其他大分子蛋白質(zhì)多肽類藥物一樣，受到細(xì)胞間緊密連接(1～5 nm)的限制，不能穿透細(xì)胞旁通路。INS-NPs在腸道的吸收主要有兩種基本機(jī)制，一種是納米粒黏附于腸上皮黏液層(由杯狀細(xì)胞產(chǎn)生)通過細(xì)胞間通道吸收；另一種是通過跨細(xì)胞途徑的滲透(M細(xì)胞內(nèi)吞作用；被動(dòng)擴(kuò)散通過腸細(xì)胞、纖毛細(xì)胞)[11]。

本研究使用安全無毒的兩親性聚合物載體材料PEG-PLA和脂質(zhì)材料磷脂s75作為胰島素納米粒的載體。這種雜化系統(tǒng)具備兩種載體材料的優(yōu)勢：一方面高分子載體PEG-PLA的親水性鏈段PEG可提高載體與胰島素的相容性和分散性，疏水性鏈段PLA則控制胰島素的釋放速率，從而可有效地調(diào)控載體的親疏水性、藥物釋放速率和載藥率[15]；另一方面，脂質(zhì)材料磷脂s75能增加納米粒藥物的脂溶性，提高納米粒在小腸黏膜上的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)[16]；同時(shí)，由于胰島素與膽酸鈉形成脂溶性復(fù)合物可使胰島素脂溶性增加，顯著提高了納米粒的EE與穩(wěn)定性[11]。在此基礎(chǔ)上，本研究以Eudragit L100為腸溶載體，將納米粒包載于腸溶載體中，進(jìn)一步避免胃液對(duì)納米粒或胰島素的破壞作用，使納米粒在小腸段釋放，以提高口服胰島素的生物利用度[11]。本研究制備的INS-NPs L100在pH 1.0的鹽酸中的釋放明顯低于INS-NPs，降血糖效果也較INS-NPs更為顯著，作用時(shí)間更長，生物利用度更高。

5 結(jié) 論

本研究采用乳化溶劑揮發(fā)法制備了一種基于聚合物(PEG-PLA)-脂質(zhì)(磷脂)雜化納米粒的口服胰島素腸溶制劑(INS-NPs L100)。當(dāng)胰島素與膽酸鈉物質(zhì)的量比為1∶22.5，脂質(zhì)材料為磷脂s75與PEG-PLA質(zhì)量比為1∶5時(shí)，所制備的INS-NPs L100經(jīng)復(fù)溶后平均粒徑為278.0 nm，EE為62.18%；在可顯著降低人工胃液中藥物釋放量，2 h僅釋放8.01%，顯著提高胰島素胃中穩(wěn)定性；在人工腸液環(huán)境中可緩慢釋藥。健康大鼠經(jīng)口給予INS-NPs L100后，與INS-NPs相比，具有明顯的持續(xù)降血糖作用。本研究結(jié)果表明，本研究所設(shè)計(jì)的基于聚合物-脂質(zhì)雜化納米粒的口服腸溶制劑在蛋白多肽類藥物的口服遞送中具有良好的應(yīng)用前景。