樹形分子在siRNA遞送載體中的應(yīng)用

蔡龔莉，陳 裕，林舒婷，朱丹丹，董怡文，李 寧，劉瀟璇*

(中國藥科大學(xué) 1天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室；2藥物科學(xué)研究院高端藥物制劑與材料研究中心，南京 210009)

RNA干擾(RNA interference,RNAi)在1998年由Fire等[1]首次報道，它是一種由小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)觸發(fā)的特異性基因沉默效應(yīng)。在RNAi過程中，雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)分子被RNase-Ⅲ類核酸內(nèi)切酶Dicer切割成21～23個核苷酸的雙鏈siRNA，該雙鏈siRNA和Argonaute 2(Ago2)蛋白、核酸內(nèi)切酶Dicer、解旋酶結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex,RISC)，雙鏈解開，其中正義鏈被降解，反義鏈保留并激活RISC。當(dāng)反義鏈通過Watson-Crick堿基互補(bǔ)配對原則與特定的靶mRNA結(jié)合時，mRNA被RISC中的Dicer切割后降解，無法進(jìn)一步翻譯成蛋白質(zhì)并導(dǎo)致基因沉默。此外，RNAi具有級聯(lián)放大效應(yīng)，在mRNA降解后，活化的RISC再參與另一個mRNA降解循環(huán)[2](圖1)。基于此，研究人員設(shè)計特定序列的siRNA用于特異性沉默致病基因，從而達(dá)到治療的目的。2018年美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)了首款siRNA藥物patisiran(Onpattro?)用于治療遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性(hATTR)引起的周圍多發(fā)性神經(jīng)疾病(polyneuropathy)，與此同時還有多種siRNA藥物正在進(jìn)行臨床試驗[3]?；趕iRNA的RNAi療法具有很多優(yōu)點，比如良好的安全性、特異性和高效性。但siRNA分子本身的一些特點，如血漿半衰期短、易被核酶降解、易被腎臟清除、帶負(fù)電荷難以自發(fā)穿過細(xì)胞膜等，使其具有較差的成藥性。因此，提高siRNA成藥性的關(guān)鍵在于發(fā)展安全高效的siRNA遞送系統(tǒng)。

目前常用的siRNA遞送載體可分為病毒類載體和非病毒類載體。病毒載體具有很高的轉(zhuǎn)染效率，但是自身的安全性不佳，如有免疫原性等，且生產(chǎn)成本高昂，限制了其臨床應(yīng)用[4]。相比之下，非病毒載體具有低免疫原性、低生產(chǎn)成本和低毒性等優(yōu)點，吸引了研究人員的廣泛關(guān)注。這些非病毒載體主要分為陽離子脂質(zhì)和陽離子聚合物兩大類。陽離子載體通過靜電相互作用結(jié)合siRNA形成穩(wěn)定納米粒，保護(hù)siRNA在體循環(huán)過程中不被降解，將其遞送至靶向部位，促進(jìn)細(xì)胞攝取，并在siRNA/載體復(fù)合物內(nèi)化后，通過內(nèi)涵體逃逸并有效將siRNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中，參與RNAi過程，產(chǎn)生有效的基因沉默效應(yīng)(圖2)。

Figure 1Mechanism of RNA interference

Figure 2Non-viral vectors mediated siRNA delivery

在眾多siRNA遞送系統(tǒng)中，樹形分子作為聚合物載體家族中特殊的一員，因其獨特的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)引起研究人員的廣泛關(guān)注[5]。樹形分子概念在20世紀(jì)80年代被首次提出，其英文名(dendrimer)來源于希臘語“dendron”(tree的意思)和“meros”(part的意思)。樹形分子是一類球狀納米級大分子，其結(jié)構(gòu)通?？梢苑譃?個部分：中心核、分支單元和末端基團(tuán)[6]。中心核位于樹形分子的最里層。分支單元(重復(fù)單元)在中心核和分子表面之間，是由核出發(fā)經(jīng)過重復(fù)的反應(yīng)得到的一系列徑向分布的同心層，每一層叫做樹形分子的一代(Generation,G)。分支單元有著精確的結(jié)構(gòu)，作為樹形分子的骨架參與其三維結(jié)構(gòu)的變化。末端基團(tuán)處于樹形分子表面，可經(jīng)修飾后實現(xiàn)不同的用途，在基因或藥物遞送時起著關(guān)鍵的作用(圖3)。

Figure 3Dendrimer structure

樹形分子一般通過發(fā)散法、收斂法或發(fā)散收斂法合成[5](圖4)。發(fā)散法是指從樹形分子的中心核出發(fā)，通過與分支單元的重復(fù)反應(yīng)，逐步增加分子大小和代數(shù)。這種方法的缺陷在于隨著樹形分子代數(shù)的增長，由于表面的空間位阻效應(yīng)使得反應(yīng)難以進(jìn)行完全，導(dǎo)致產(chǎn)生含有缺陷的副產(chǎn)物分子，這種缺陷會隨著代數(shù)積累而且產(chǎn)物難以純化。為了確保反應(yīng)的進(jìn)行和防止副產(chǎn)物的生成，往往需要加入過量的反應(yīng)物，但這又會增加純化難度。與之相對的收斂法則是指從樹形分子結(jié)構(gòu)的表面出發(fā)，通過與分支單元逐步反應(yīng)，形成樹狀單元，再將樹狀單元與樹形分子的中心核連接形成完整的樹形分子。這種方法跟發(fā)散方法相比反應(yīng)易于控制，副產(chǎn)物容易分離，能有效降低產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)缺陷，可以得到較為完整的分子，但同樣由于空間位阻效應(yīng)很難得到高代分子。而發(fā)散收斂法是通過發(fā)散法合成樹形分子的中心核，然后通過收斂法合成樹狀單元，再將中心核與樹狀單元連接得到完整的樹形分子。這種方法結(jié)合發(fā)散和收斂兩種合成方法優(yōu)點，可以縮短合成高代樹形分子的時間，同時這種方法還可以通過可控的方式將不同的樹狀單元結(jié)合到一起，從而得到具有特殊用途的非對稱樹形結(jié)構(gòu)。

Figure 4Strategies of dendrimer synthesis

A:Divergent approach;B:Convergent approach;C:Double-stage convergent approach

樹形分子具有一些獨特的物理化學(xué)性質(zhì)[6]，例如具有精確的結(jié)構(gòu)，良好的單分散性；同時，樹形分子表面具有大量的末端基團(tuán)，可以與溶劑或其他分子發(fā)生多位點的相互作用，使得樹形分子具有較好的溶解性和反應(yīng)活性；此外，樹形分子的末端基團(tuán)還可以進(jìn)行多種修飾，賦予樹形分子不同的性質(zhì)，例如修飾特異性配體可以增強(qiáng)樹形分子的靶向遞送能力。

目前樹形分子在siRNA遞送領(lǐng)域的應(yīng)用日益增多[7]，聚酰胺-胺類[poly(amidoamine)，PAMAM]、聚丙烯亞胺類[poly(prophylenimine)，PPI]、肽類(peptide dendrimer)、聚甘油類(polyglycerol dendrimer，PG)、碳硅烷類(carbosilane dendrimer，CBD)、三嗪類(triazine dendrimer)、兩親類(amphiphilic dendrimer)等多種樹形分子被開發(fā)用于遞送siRNA，其中PAMAM是目前研究得最深入和最廣泛的一類。本文將對以上不同類別的樹形分子在siRNA遞送方面的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 聚酰胺-胺類樹形分子(PAMAM)

在眾多樹形分子載體中，聚酰胺-胺類樹形分子是研究得最早和最深入的一類。Tomalia等[8]在1985年首次合成了PAMAM樹形分子(圖5-A)，傳統(tǒng)的PAMAM樹形分子以氨為核，通過與丙烯酸甲酯的Michael加成和與乙二胺的酰胺化交替反應(yīng)合成。在PAMAM樹形分子遞送siRNA的過程中，陽離子PAMAM樹形分子表面大量的胺基基團(tuán)可以通過靜電相互作用結(jié)合siRNA并形成穩(wěn)定納米粒，從而有效保護(hù)siRNA，避免其被核酶降解。然后，siRNA/樹形分子復(fù)合物納米粒經(jīng)內(nèi)吞途徑被細(xì)胞攝取，被內(nèi)化的納米粒主要聚集在酸性細(xì)胞器中，如內(nèi)涵體和溶酶體。樹形分子結(jié)構(gòu)中存在大量叔胺基團(tuán)，使其具備很強(qiáng)的pH緩沖能力，可通過“質(zhì)子海綿”效應(yīng)實現(xiàn)內(nèi)涵體逃逸，從而促進(jìn)siRNA的釋放，達(dá)到基因沉默效果[9]。

研究表明，相比于完整結(jié)構(gòu)的樹形分子，部分降解的樹形分子具有更高的基因遞送效率[10]。2005年Kang等[11]嘗試通過結(jié)構(gòu)完整的G5PAMAM樹形分子來遞送siRNA，但并沒有觀察到基因沉默效果，他們猜測是siRNA在胞內(nèi)的不完全釋放導(dǎo)致的。而基于PAMAM樹形分子的商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑PolyFect?和SuperFect?的活性成分是部分降解的PAMAM樹形分子，可能是因為部分降解的樹形分子具有更開放和柔順的結(jié)構(gòu)，使其更易于與核酸和水分子作用，有利于核酸的結(jié)合和釋放。這些部分降解的PAMAM樹形分子通常是將結(jié)構(gòu)完整的樹形分子進(jìn)行堿水解或熱降解的方法得到[10]。眾所周知，高代樹形分子(如G5)的合成和純化過程都相當(dāng)耗時耗力，通過合成完整的高代樹形分子再進(jìn)行降解得到部分降解的產(chǎn)物用于高效的基因遞送，是一種不經(jīng)濟(jì)又不環(huán)保的方法。因此，在2006年，Zhou等[12]就報道了以三乙醇胺(TEA)為核的一類具有柔順結(jié)構(gòu)的PAMAM樹形分子(圖5-B)，與傳統(tǒng)氨為核的PAMAM樹形分子相比，這種具有開放和柔順結(jié)構(gòu)的樹形分子的空間位阻較低，利于其與siRNA的結(jié)合，同時水分子也更容易進(jìn)入樹形分子內(nèi)部，增加內(nèi)部叔胺質(zhì)子化的可能，促進(jìn)siRNA 借助“質(zhì)子海綿”效應(yīng)的釋放。實驗證明，該結(jié)構(gòu)柔順型樹形分子能夠和siRNA結(jié)合形成大小約為70 nm的穩(wěn)定納米粒，保護(hù)siRNA并促進(jìn)其細(xì)胞攝取[13]。在前列腺腫瘤細(xì)胞模型[13]中，這類結(jié)構(gòu)柔順的PAMAM樹形分子在其代數(shù)等于或高于5時都能有效遞送siRNA，降低熱休克蛋白27(Hsp27)的表達(dá)并產(chǎn)生Caspase依賴的抗腫瘤活性。此外，這類樹形分子還能有效地將siRNA遞送到人類T細(xì)胞和原代PBMC細(xì)胞中，并產(chǎn)生顯著的基因沉默效應(yīng)[14]。同時，該樹形分子能夠在人源化小鼠艾滋病模型中進(jìn)行系統(tǒng)給藥，遞送可以同時靶向艾滋病毒復(fù)制和感染的siRNA并發(fā)揮基因沉默效應(yīng)，有效預(yù)防宿主CD4+T細(xì)胞耗竭和病毒逃逸，產(chǎn)生顯著抗HIV活性[14]。最新研究表明，該類樹形分子還可將siRNA靶向遞送至卵巢癌干細(xì)胞，顯著抑制卵巢癌干細(xì)胞的擴(kuò)張、黏連、侵襲轉(zhuǎn)移和腫瘤的生長[15]。除了上述的前列腺癌，艾滋病和卵巢癌疾病模型，這類新型結(jié)構(gòu)柔順的樹形分子介導(dǎo)的小RNA治療還成功地應(yīng)用于肝癌[16]、膠質(zhì)瘤[17]等疾病模型中。

PAMAM樹形分子表面具有豐富的末端基團(tuán)，圍繞其末端基團(tuán)可以進(jìn)行多種修飾，這些修飾可以降低siRNA/樹形分子復(fù)合物在遞送過程中的毒性、提高其靶向性、增加細(xì)胞攝取等。

陽離子樹形分子經(jīng)部分修飾后可有效降低其細(xì)胞毒性。高代PAMAM樹形分子攜帶較多的表面正電荷，具有較高的轉(zhuǎn)染效率，同時過多的正電荷會增加納米復(fù)合物的細(xì)胞毒性，因此可以通過對其正電荷表面進(jìn)行一定程度的修飾，在保持其遞送活性的同時降低其細(xì)胞毒性。例如聚乙二醇(PEG)作為在改善陽離子載體細(xì)胞毒性中被開發(fā)最多的聚合物，能夠極大地降低陽離子樹形分子的細(xì)胞毒性。在G5或G6PAMAM上進(jìn)行8%的PEG修飾(圖6-A)[18]可以提高轉(zhuǎn)染效率、降低毒性，其遞送siRNA產(chǎn)生的基因沉默效應(yīng)要遠(yuǎn)優(yōu)于未修飾的樹形分子，與商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(Lipo)效果相當(dāng)。

Figure 5PAMAM dendrimers

A:Amine (NH3) core PAMAM dendrimer;B:Triethanolamine (TEA) core PAMAM dendrimer

在樹形分子表面進(jìn)行特定修飾可以實現(xiàn)siRNA的靶向遞送，有效減少非特異性遞送，提高遞送效率并降低毒性。透明質(zhì)酸是一種天然的具有細(xì)胞特異性的聚合物，其受體CD44在MCF-7和MDA-MB-231等細(xì)胞系中高度表達(dá)，使用透明質(zhì)酸修飾樹形分子可以通過靶向效應(yīng)增加siRNA在相應(yīng)腫瘤細(xì)胞中的遞送效率。Ma等[19]通過修飾透明質(zhì)酸四糖簇的G4PAMAM樹形分子實現(xiàn)siRNA的成功遞送(圖6-E)。與透明質(zhì)酸寡糖相比，透明質(zhì)酸四糖簇與受體CD44的結(jié)合能力增強(qiáng)，修飾后的樹形分子與siRNA形成復(fù)合物，并進(jìn)一步通過CD44介導(dǎo)的胞吞作用大大增加其細(xì)胞攝取，從而發(fā)揮顯著的基因沉默效應(yīng)。除此之外，一些靶向肽和某些腫瘤細(xì)胞高表達(dá)的受體之間存在著特異性相互作用，也常用于修飾樹形分子末端以促進(jìn)siRNA/樹形分子復(fù)合物的靶向遞送。如Liu等[20]將雙靶向肽RGDK引入到結(jié)構(gòu)柔順型PAMAM樹形分子的siRNA遞送系統(tǒng)中，其中RGD可以通過與腫瘤血管上過表達(dá)的ανβ3整合素的相互作用靶向腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞，增加siRNA/樹形分子復(fù)合物在腫瘤部位的富集，減少非特異性遞送；RGDK則可與腫瘤細(xì)胞表面的Nrp-1受體結(jié)合，增加細(xì)胞攝取。

對樹形分子表面進(jìn)行特定的修飾還可以提高細(xì)胞對復(fù)合物的攝取，從而提高siRNA的基因沉默效率。眾所周知，含有豐富精氨酸的細(xì)胞穿透肽能夠促進(jìn)細(xì)胞攝取，因為在生理條件下，每個精氨酸殘基都含有一個帶正電荷的胍基，胍基可以通過其平面結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜相互作用，從而促進(jìn)膜的滲透。因此，將精氨酸修飾于樹形分子的末端(圖6-B)[21]，能夠增強(qiáng)樹形分子與siRNA的相互作用，促進(jìn)細(xì)胞攝取，提高轉(zhuǎn)染效率。在樹形分子上進(jìn)行脂質(zhì)修飾是另一種增加攝取的方法。脂質(zhì)修飾后可以平衡樹形分子的陽離子電荷和脂質(zhì)含量，促進(jìn)納米粒的細(xì)胞攝取和內(nèi)涵體逃逸，進(jìn)而優(yōu)化siRNA遞送及轉(zhuǎn)染效率。C12飽和烷基鏈修飾的PAMAM(圖6-C)[22]介導(dǎo)的siRNA的遞送中，即使在低siRNA劑量(10 nmol/L)下，也具有80%的基因沉默效果。同時，脂質(zhì)修飾后的樹形分子還可以實現(xiàn)抗腫瘤藥物和siRNA共同遞送治療多藥耐藥。Biswas等[23]將1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇(DOPE-PEG)連在PAMAM樹形分子上所得的共聚物能夠自組裝成尺寸低于100 nm的膠束，其對阿霉素和siRNA的遞送能力都有了極大的提高。除了細(xì)胞滲透肽和脂質(zhì)之外，全氟烷基化合物因其獨特的性質(zhì)也常被用于修飾樹形分子以提高遞送效率。含氟化合物既疏水又疏脂，同時存在獨特的氟氟相互作用，有利于siRNA/樹形分子復(fù)合物在低N/P比條件下實現(xiàn)最佳的轉(zhuǎn)染效果，提高其血清穩(wěn)定性，增加細(xì)胞攝取，促進(jìn)內(nèi)涵體逃逸。He等[24]在不同代數(shù)PAMAM樹形分子上綴合雙尾氟化合物2-氯-4,6-雙[(全氟己基)丙氧基]-1,3,5-三嗪(CBT)顯示出高siRNA遞送功效，并且所修飾的樹形分子在其最佳轉(zhuǎn)染條件下表現(xiàn)出最低的細(xì)胞毒性。Wang等[25]合成的七氟丁酸修飾的PAMAM也表現(xiàn)出優(yōu)異的siRNA遞送能力(圖6-D)，在低劑量條件下其基因沉默效應(yīng)甚至優(yōu)于商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑Lipo。

2 聚丙烯亞胺類樹形分子(PPI)

聚丙烯亞胺類樹形分子是另一類常用的樹形分子(圖7)。它主要以胺為起始原料，通過與丙烯腈的Michael加成、腈基還原成氨基兩步反應(yīng)的交替進(jìn)行得到。Buhleier等[26]在1978年首次報道了PPI的合成，但存在反應(yīng)不完全、副反應(yīng)多、產(chǎn)率低等問題。在此基礎(chǔ)上，研究人員優(yōu)化了PPI的制備方法[27-28]，在胺和丙烯腈的Michael加成反應(yīng)中加入水，使得過量的丙烯腈能夠與水形成共沸物并除去，腈基末端的化合物可經(jīng)水洗滌純化得到；隨后，使用Raney/Cobalt對腈基進(jìn)行加氫還原，過濾后得到純產(chǎn)物。優(yōu)化后的制備方法顯著降低了產(chǎn)物的純化難度、減少了副反應(yīng)、提高了產(chǎn)率，可應(yīng)用于大量生產(chǎn)。PPI結(jié)構(gòu)中含有大量胺基基團(tuán)，包括末端的伯胺和內(nèi)部的叔胺，因此也適用于siRNA的遞送。為了提高PPI的遞送效率和靶向能力，研究人員常常在PPI結(jié)構(gòu)中修飾靶向基團(tuán)，期望通過受體-配體的特異性識別，以提高靶向遞送能力。Tietze 等[29]開發(fā)了基于麥芽糖修飾的PPI樹形分子的載體系統(tǒng)，其中，載體中的單抗片段可靶向識別腫瘤細(xì)胞過表達(dá)的表皮生長因子受體Ⅲ(EGFRvIII)，實現(xiàn)siRNA的高效靶向遞送。此外，促黃體激素釋放激素(LHRH)也常用于修飾PPI以提高載體的靶向性。如LHRH修飾后的PPI靶向卵巢癌細(xì)胞遞送DJ-1 siRNA，顯著降低了卵巢癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力[30]。在利用LHRH提高PPI遞送系統(tǒng)靶向性的同時，Taratula等[31]同時在PPI表面修飾了PEG，該策略有效提高了siRNA的血清穩(wěn)定性，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的特異性識別和攝取，從而發(fā)揮基因沉默效應(yīng)，提高腫瘤治療的療效。

然而，在研究PPI的細(xì)胞毒性時發(fā)現(xiàn)，PPI樹形分子會改變A431和A549細(xì)胞的內(nèi)源基因表達(dá)[32]，因此，PPI可能會影響人類固有基因的功能，這也大大地限制了PPI在臨床上的進(jìn)一步應(yīng)用。

Figure 6Surface-modified PAMAM dendrimers

A:PEG-modified PAMAM dendrimer;B:Arginine-modified PAMAM dendrimer;C:Lipid-modified PAMAM dendrimer;D:Fluorinated PAMAM dendrimer;E:Hyaluronic acid-modified PAMAM dendrimer

Figure 7Poly (propylene imine) dendrimer (PPI)

3 肽類樹形分子

肽類樹形分子在廣義上是指在中心核、分支單元或者末端基團(tuán)含有氨基酸或肽序的樹形分子，而在狹義上則是指樹形分子的整個結(jié)構(gòu)均由氨基酸構(gòu)成[33]，其中聚L-賴氨酸樹形分子(PLL)就是一種典型的肽類樹形分子(圖8)。PLL由賴氨酸組成，一般以胺為核心，通過帶有保護(hù)基的賴氨酸之間的縮合-脫保護(hù)兩個交替的反應(yīng)，得到不同代數(shù)的PLL樹形分子[34]。PLL具有良好的生物相容性，可以在生物體內(nèi)經(jīng)過酶或者酸的作用發(fā)生降解[33]。雖然PLL表面的胺基在生理條件下便可發(fā)生質(zhì)子化攜帶正電荷，能與siRNA通過靜電相互作用形成復(fù)合物，但其結(jié)構(gòu)中不含有與PAMAM和PPI類似的叔胺結(jié)構(gòu)，致使siRNA無法通過“質(zhì)子海綿”效應(yīng)從內(nèi)涵體中逃逸出來發(fā)揮基因沉默效應(yīng)[35]。研究人員開始嘗試通過對PLL進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造以提高其siRNA遞送能力。例如，對PLL表面進(jìn)行脂質(zhì)修飾可以提高siRNA遞送能力，C18不飽和烷基鏈修飾的PLL樹形分子在體內(nèi)表現(xiàn)出有效的RNA干擾能力而無明顯的細(xì)胞毒性[36]。同時，氟化修飾也能增強(qiáng)PLL的遞送能力。Cai等[37]設(shè)計了基于氟化G2PLL樹形分子遞送系統(tǒng)，可以提高siRNA在遞送過程中的生理穩(wěn)定性和血清抗性，促進(jìn)siRNA/樹形分子復(fù)合物的腫瘤內(nèi)富集、細(xì)胞內(nèi)化及內(nèi)涵體逃逸。

Figure 8Poly (L-lysine) dendrimer (PLL)

4 聚甘油類樹形分子(PG)

聚甘油類樹形分子的研究也較為廣泛，其分支單元為甘油，一般以醇為起始原料，通過醇的烯丙基化、烯丙基雙鍵的催化二羥基化兩步反應(yīng)交替可以得到[38]。陽離子胺基末端的聚甘油樹形分子表現(xiàn)出良好的siRNA遞送能力。Haag課題組一直致力于聚甘油樹形分子的研究，F(xiàn)ischer等[39]設(shè)計了含有各種陽離子胺基末端的聚甘油樹形分子，其中PG-NH2(圖9)在轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性之間表現(xiàn)出最佳平衡。PG-NH2可以通過將聚甘油樹形分子上的羥基以胺基替代得到。研究表明，PG-NH2中胺基取代程度對其遞送能力有著顯著影響，50%胺基取代的PG-NH2的核酸親和力最強(qiáng)。與此同時，體內(nèi)外轉(zhuǎn)染研究結(jié)果也表明，只有50%胺基取代的PG-NH2才能有效轉(zhuǎn)染siRNA[40]。為了進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)染效率，Zeng等[41]還對PG-NH2進(jìn)行了進(jìn)一步的氨基酸修飾研究。通過在PG-NH2末端修飾不同種類的氨基酸，同時調(diào)整氨基酸的組合、氨基酸的數(shù)量和PG-NH2的代數(shù)，發(fā)現(xiàn)組氨酸和色氨酸比例為3/1的雙功能化PG-NH2比未修飾的PG-NH2具有更高的遞送效率和更低的細(xì)胞毒性。這是因為組氨酸中的咪唑基團(tuán)在弱酸性條件下可質(zhì)子化，增加siRNA/樹形分子復(fù)合物的pH緩沖能力，從而促進(jìn)其內(nèi)涵體逃逸；同時咪唑基團(tuán)具有化學(xué)惰性，可提高其血清穩(wěn)定性[42]。疏水性氨基酸色氨酸則發(fā)揮與脂質(zhì)相似的作用，平衡樹形分子的電荷及疏水性，從而促進(jìn)細(xì)胞攝取，提高轉(zhuǎn)染效率。因此，氨基酸雙功能化修飾可達(dá)到協(xié)同增效的作用，進(jìn)一步增強(qiáng)PG-NH2的siRNA遞送效果。相似的，組氨酸與精氨酸比例為3/1的雙功能化的PG-NH2在NIH 3T3細(xì)胞系中也表現(xiàn)出高效的siRNA轉(zhuǎn)染效率和較低的細(xì)胞毒性(細(xì)胞存活率為90%)[43]。

Figure 9Polyglycerolamine dendrimer (PG-NH2)

5 碳硅烷類樹形分子(CBD)

碳硅烷類樹形分子具有一個含硅的核心，其骨架通常由碳碳鍵和碳硅鍵構(gòu)成，形成高度疏水的樹形分子結(jié)構(gòu)。它的合成通常以帶烯基的硅烷為中心核，與甲基二氯硅烷進(jìn)行硅氫加成反應(yīng)；隨后與格氏試劑反應(yīng)得到烯基末端樹狀物，兩步反應(yīng)交替進(jìn)行得到不同代數(shù)的樹形分子[44]。碳硅烷樹形分子表面連接銨鹽后(圖10)，可以通過靜電相互作用結(jié)合siRNA，用于siRNA遞送。Weber等[45]的研究表明，G2銨鹽末端的碳硅烷樹形分子可有效遞送siRNA。在對比氧硅鍵碳硅烷樹形分子(CBD-OS)和碳硅鍵碳硅烷樹形分子(CBD-CS)后發(fā)現(xiàn)，兩者都可有效遞送siRNA用于HIV基因治療[46]，但也都存在各自的不足，氧硅鍵在水溶液中不穩(wěn)定，容易緩慢發(fā)生水解，影響CBD-OS的廣泛應(yīng)用；CBD-CS不含氧硅鍵，相對較穩(wěn)定，但存在siRNA釋放困難的問題[47]。此外，銨鹽末端的碳硅烷樹形分子表面帶有大量正電荷，在遞送過程中也可能帶來毒性問題。為了降低其毒性，研究人員嘗試將銨鹽連接的一個甲基用羥甲基替代，發(fā)現(xiàn)樹形分子表面電荷略微降低，其毒性也隨之降低[48]；同時還發(fā)現(xiàn)利用三甲基磷鹽替代銨鹽進(jìn)行修飾后得到的磷鹽末端的碳硅烷樹形分子具有相對較低的體內(nèi)毒性，在魚類胚胎模型中其半數(shù)致死量(LD50)比其他陽離子樹形分子高10倍以上[49]。

6 三嗪類樹形分子

三嗪類樹形分子是以鹵代1,3,5-三嗪環(huán)為分支單元，利用氨基化合物的氨基和鹵素之間的反應(yīng)，將三嗪環(huán)連接起來得到不同代數(shù)的樹形分子[50]。Merkel等[51]研究發(fā)現(xiàn)，三嗪類樹形分子的中心核結(jié)構(gòu)、末端基團(tuán)和代數(shù)都會影響siRNA的遞送。其中剛性的G2三嗪類樹形分子比柔性結(jié)構(gòu)類似物表現(xiàn)出更好的基因沉默效應(yīng)；在剛性三嗪類樹形分子上修飾精氨酸或者短鏈脂質(zhì)(圖11)可以促進(jìn)其內(nèi)涵體逃逸以及 siRNA在胞質(zhì)中釋放，從而有效提高了基因沉默效率。Pavan等[52]進(jìn)一步通過計算機(jī)模擬研究了三嗪類樹形分子與siRNA之間的相互作用，研究人員預(yù)期柔性結(jié)構(gòu)的三嗪類樹形分子能夠利用其結(jié)構(gòu)的靈活性，增加樹形分子與siRNA的結(jié)合，但研究結(jié)果表明，柔性結(jié)構(gòu)的三嗪類樹形分子反而形成了更緊密的球形構(gòu)象，弱化了樹形分子與siRNA 的結(jié)合。與其他類型的樹形分子相比，三嗪類樹形分子在siRNA遞送方面的應(yīng)用相對較少一些，進(jìn)一步的研究仍在進(jìn)行之中。

Figure 10Ammonium-terminating carbosilane dendrimer (CBD)

7 兩親類樹形分子

在siRNA遞送中，樹形分子的代數(shù)與遞送效率有著直接關(guān)系，較高代數(shù)的樹形分子具有更好的siRNA結(jié)合能力，其遞送效率也較高。但因空間位阻等因素的影響，高代樹形分子的制備難度相對較大，批量化生產(chǎn)困難。為了解決樹形分子載體“高代高效但難制備”這一共性問題，研究人員制備具有兩親性的較低代數(shù)的樹形分子，運用自組裝的策略，使其組裝形成超分子樹形分子組裝體，以實現(xiàn)高效的siRNA遞送。

Figure 11Lipid-modified triazine dendrimer

Yu等[53]結(jié)合脂質(zhì)分子和樹形分子載體的優(yōu)勢設(shè)計了一系列低代數(shù)的兩親性PAMAM樹形分子，這類樹形分子含有疏水性的烷基長鏈和親水性的低代PAMAM樹形結(jié)構(gòu)(圖12-A)，這兩部分是通過click反應(yīng)連接到一起，在保留樹形分子結(jié)構(gòu)明確和獨特的多價特性優(yōu)點的同時，顯著降低制備難度；同時，兩親性樹形分子自組裝形成樹形分子納米膠束以模擬高代球型樹形分子，高效地將siRNA 遞送至人源的原代細(xì)胞和干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞中，展現(xiàn)出優(yōu)異的siRNA遞送能力。深入的構(gòu)效關(guān)系研究表明此類兩親性樹形分子結(jié)構(gòu)中的親水部分PAMAM的代數(shù)和疏水部分烷基鏈的長度對遞送效率都有影響[54]。疏水鏈缺失或者以親水性PEG鏈替代疏水部分所構(gòu)建的樹形分子都不具備兩親性，無法自組裝形成膠束遞送siRNA；減少親水部分的末端胺基數(shù)量或者縮短疏水部分的烷基鏈長度，也無法產(chǎn)生顯著的基因沉默效應(yīng)。其主要原因為PAMAM代數(shù)過低，表面正電荷基團(tuán)偏少，則無法與siRNA形成有效的靜電相互作用；烷基鏈長度太短，則組裝時的疏水相互作用也會減弱，無法與siRNA形成穩(wěn)定的組裝體；疏水鏈過長則會使疏水作用增強(qiáng)，形成的復(fù)合物過于致密和穩(wěn)定，siRNA無法實現(xiàn)有效的胞內(nèi)釋放，導(dǎo)致其遞送效率也較低。在此構(gòu)效關(guān)系的研究基礎(chǔ)上，Liu等[55]進(jìn)一步調(diào)整疏水部分烷基鏈的數(shù)目構(gòu)建了一類含有兩條烷基鏈的兩親性樹形分子(圖12-B)，這類兩親性樹形分子自組裝形成納米囊泡結(jié)構(gòu)，但在與siRNA相互作用時能自適應(yīng)重排形成球形膠束結(jié)構(gòu)。這種從囊泡到膠束結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變可以實現(xiàn)末端正電荷基團(tuán)的最大化暴露，有利于與siRNA的靜電相互作用，從而更好地結(jié)合和保護(hù)siRNA。為了提高兩親性樹形分子的遞送效率，他們將精氨酸修飾于兩親性樹形分子的親水端以提高細(xì)胞對siRNA/樹形分子復(fù)合物的攝取，從而顯著增強(qiáng)其基因沉默效率[56]。為了更進(jìn)一步增加遞送系統(tǒng)的靶向性，Dong等[57]利用雙靶向肽RGDK對兩親性樹形分子遞送系統(tǒng)進(jìn)行修飾，體內(nèi)實驗結(jié)果證明使用此靶向遞送系統(tǒng)的siRNA有效劑量降低了91.7%(由3 mg/kg降低至0.25 mg/kg)。此外，Liu等[58]還設(shè)計了一種含氟bola型兩親性樹形分子(圖12-C)，在分子中引入縮硫醛鍵，能夠響應(yīng)于腫瘤細(xì)胞中高水平活性氧(ROS)，實現(xiàn)siRNA的按需遞送。同時，該分子結(jié)構(gòu)中的氟原子還可以實現(xiàn)氟譜示蹤樹形分子介導(dǎo)的siRNA遞送過程。

此外，這類兩親性樹形分子結(jié)構(gòu)中疏水部分的存在使得這類分子能夠用于疏水性藥物和基因藥物的共遞送，實現(xiàn)多種藥物協(xié)同治療。Li等[59]建立了腫瘤微環(huán)境敏感多肽(TMSP)修飾的兩親性樹形分子(G0-C14)遞送系統(tǒng)(圖12-D)，實現(xiàn)siRNA和紫杉醇的共遞送。TMSP由細(xì)胞穿透肽和屏蔽肽組成，其中屏蔽肽含有基質(zhì)金屬蛋白酶-2/9(MMP-2/9)敏感的肽段PVGLIG。TMSP被MMP-2/9活化后暴露細(xì)胞穿透肽部分，進(jìn)一步促進(jìn)納米復(fù)合物的細(xì)胞攝取，該共遞送系統(tǒng)在人黑素瘤中表現(xiàn)出協(xié)同治療的效果。

除此之外，其他種類的樹形分子如聚甘油類和碳硅烷類也被設(shè)計成兩親性的結(jié)構(gòu)用于siRNA的遞送。研究人員構(gòu)建了不同代數(shù)的聚甘油兩親性樹形分子[60-61]，其疏水部分是C18疏水烷基鏈，親水部分的聚甘油表面修飾了不同數(shù)量的甘氨酸或N,N-二-(3-氨基丙基)-N-(甲基)胺(DAPMA)以通過靜電相互作用結(jié)合siRNA(圖13-A)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在疏水部分加入硫辛酸結(jié)構(gòu)使樹形分子可以自組裝形成生物交聯(lián)型膠束，在還原條件下交聯(lián)鍵斷裂實現(xiàn)siRNA的進(jìn)一步釋放[62]。疏水性碳硅烷和親水性PEG連接也可以形成新型兩親性雜交樹形分子(圖13-B)，可有效遞送siRNA至外周血單核細(xì)胞用于HIV治療[63]。

Figure 12Amphiphilic PAMAM dendrimers

A:Amphiphilic PAMAM dendrimer carrying a hydrophobic C18 alkyl chain;B:Amphiphilic PAMAM dendrimer carrying two hydrophobic C18 alkyl chains;C:Bola amphiphilic PAMAM dendrimer;D:G0-C14 amphiphilic PAMAM dendrimer

Figure 13Amphiphilic polyglycerol dendrimer (A) and amphiphilic carbosilane dendrimer (B)

8 結(jié) 語

基于siRNA的RNAi療法因其特異的基因沉默效應(yīng)受到廣泛關(guān)注，2018年首款siRNA藥物Onpattro?上市，標(biāo)志著RNAi療法從概念走向臨床實際應(yīng)用。然而siRNA分子本身不能在體內(nèi)發(fā)揮其基因沉默效應(yīng)，需要載體對其進(jìn)行保護(hù)和遞送。樹形分子作為一種高效的非病毒siRNA遞送載體，引起了越來越多的關(guān)注。它們的優(yōu)勢在于結(jié)構(gòu)精確可控，具有獨特的多價性等等，這些特性使其成為理想的siRNA遞送載體。研究學(xué)者們對傳統(tǒng)樹形分子進(jìn)行了一系列的結(jié)構(gòu)改造，以此開發(fā)了各種用于siRNA遞送的多功能樹形分子遞送平臺，以期待最大限度地提高遞送的有效性和特異性，并將毒性降至最低。在上述各類樹形分子遞送平臺中，聚丙烯亞胺類、碳硅烷類、三嗪類樹形分子由于分子本身的毒性或生物相容性不佳等原因使它們在siRNA遞送中的應(yīng)用相對較少；而聚酰胺-胺類、肽類和聚甘油類樹形分子具有相對較好的生物相容性，其中聚酰胺-胺類樹形分子的研究最為深入，其siRNA遞送效果也最為理想。這主要是因為一方面在生理條件下PAMAM樹形分子中帶正電的胺基基團(tuán)可與帶負(fù)電的siRNA通過靜電相互作用結(jié)合并透過細(xì)胞膜將其輸送到目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)，另一方面PAMAM樹形分子內(nèi)部的叔胺基團(tuán)通過“質(zhì)子海綿”效應(yīng)促進(jìn)siRNA/樹形分子納米粒的內(nèi)涵體逃逸和siRNA的有效釋放；反觀傳統(tǒng)的肽類和聚甘油類樹形分子，因無法同時具備結(jié)合siRNA和促進(jìn)其內(nèi)涵體逃逸及siRNA釋放的結(jié)構(gòu)，所以在一定程度上限制了這兩類樹形分子在siRNA遞送中的應(yīng)用。雖然目前樹形分子進(jìn)行siRNA遞送的研究已經(jīng)取得了一些令人鼓舞的實驗結(jié)果，但在推進(jìn)其臨床轉(zhuǎn)化的過程中仍存在一些亟待解決的問題：例如如何實現(xiàn)符合藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GMP)要求的樹形分子的工業(yè)化生產(chǎn)，以及缺乏樹形分子體內(nèi)代謝過程和安全性等的認(rèn)知研究等。相信在化學(xué)、生物、物理、醫(yī)學(xué)等各領(lǐng)域?qū)＜业膮f(xié)同合作下，將會有越來越多的樹形分子被開發(fā)和研究作為siRNA遞送載體，其在臨床應(yīng)用中也將日益廣泛。