硫化氫供體分子研究進(jìn)展

申欣欣，張奕華，黃張建

(中國藥科大學(xué)新藥研究中心，南京 210009)

硫化氫(H2S)是一種具有臭雞蛋味的難聞氣體，幾個(gè)世紀(jì)以來都被認(rèn)為是有毒的空氣污染物，直到1996年Abe和Kimura[1]報(bào)道了H2S的內(nèi)源性生成和信號(hào)傳導(dǎo)能力后，人們才發(fā)現(xiàn)它是繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第3種內(nèi)源性氣體信使分子，對人類的健康具有極其重要的作用[2]。

內(nèi)源性H2S主要由兩種吡哆醛-5′-磷酸(PLP)依賴性酶：胱硫醚-β-合成酶(CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)催化底物半胱氨酸生成[3]。另外，也可以由PLP非依賴性的半胱氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(CAT)催化半胱氨酸形成巰基丙酮酸，進(jìn)一步在3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶(3-MST)的作用下釋放生成[4-5](圖1-A)。H2S主要在線粒體氧化代謝，其機(jī)制是其和硫化物醌還原酶(SQR)反應(yīng)形成SQR-SSH中間體，然后在谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)介導(dǎo)下，將該中間體的硫原子轉(zhuǎn)給谷胱甘肽(GSH)，生成氧化型谷胱甘肽(GSSH)，再經(jīng)硫雙加氧酶(SDO)氧化，形成硫代硫酸鹽或硫酸鹽[6](圖1-B)。

圖1 (A)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)源性H2S產(chǎn)生的機(jī)制；(B)體內(nèi)H2S代謝途徑

H2S可以在短時(shí)間內(nèi)迅速地跨越細(xì)胞膜內(nèi)外，半衰期較短，但具有廣泛的生物學(xué)作用，包括舒張血管[7]、保護(hù)心臟[8]、抗炎[9]、抗氧化[10]和抗腫瘤[11-12]等。H2S介導(dǎo)的生理作用主要通過以下3種途徑產(chǎn)生。途徑一是H2S對蛋白質(zhì)半胱氨酸殘基S-硫化作用，即將硫醇(-SH)轉(zhuǎn)化為過硫化物(-SSH)。通過該途徑，H2S可以改變包括受體、離子通道和酶等細(xì)胞蛋白質(zhì)功能[13]，比如舒張血管/腸道和氣道的平滑肌細(xì)胞，調(diào)節(jié)離子通道的開放和關(guān)閉，促進(jìn)或抑制炎癥反應(yīng)等。途徑二是H2S與NO等有機(jī)親電體的相互作用。例如，H2S與NO反應(yīng)可生成相對分子質(zhì)量最小的亞硝基硫醇(HSNO)，它可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的亞硝化[14]；H2S也易與含過渡態(tài)金屬的蛋白反應(yīng)，生理環(huán)境中最主要的靶標(biāo)即是血紅蛋白，產(chǎn)生磺化血紅蛋白[15]。

大量的研究表明，H2S具有廣泛的生物學(xué)活性，且活性具有一定的劑量依賴關(guān)系，特別是在腫瘤生物學(xué)方面。已知內(nèi)源性H2S或相對較低水平的外源性H2S通過誘導(dǎo)血管生成[16]，調(diào)節(jié)線粒體生物能量[17]，加速細(xì)胞周期進(jìn)程[18]和抗凋亡[19]的機(jī)制來發(fā)揮促癌作用，而相對高濃度的外源H2S可通過誘導(dǎo)不可控的細(xì)胞內(nèi)酸化，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和促進(jìn)細(xì)胞凋亡來抑制腫瘤細(xì)胞的生長[20]。因此，H2S供體藥物研究的關(guān)鍵科學(xué)問題在于如何使H2S供體分子選擇性地在靶部位(一般為病變部位)釋放一定濃度的H2S，而在正常組織器官中不釋放或者僅釋放少量的H2S，在發(fā)揮治療作用的同時(shí)最大限度地避免H2S的不良反應(yīng)。

本文綜述了兩大類H2S供體的結(jié)構(gòu)及其釋放H2S的機(jī)制，重點(diǎn)介紹近年來發(fā)展的具有可控釋放潛力的H2S供體分子，旨在為H2S供體藥物研究提供新的思路。

1 傳統(tǒng)的H2S供體

1.1 硫化物無機(jī)鹽

為了研究H2S的生理和病理活性，傳統(tǒng)方法是制備H2S氣體的水溶液。然而H2S氣體的可控性不佳，難以精確控制體內(nèi)有效濃度，而且制作過程有H2S中毒的危險(xiǎn)，因此應(yīng)用H2S水溶液受到限制[21]。于是人們便把目光轉(zhuǎn)到了硫化物無機(jī)鹽亞硫化鈉(NaHS)和硫化鈉(Na2S)，但這些無機(jī)鹽亦存在著一些缺點(diǎn)。例如，它們釋放H2S速率相對較快且不可控，不能模擬體內(nèi)緩慢而連續(xù)地產(chǎn)生H2S的過程；此外，NaHS在水溶液中會(huì)被O2快速氧化，導(dǎo)致濃度的不準(zhǔn)確和生物效應(yīng)的差異[22]。

1.2 有機(jī)多硫化物

有機(jī)多硫化物是一類含有多硫鍵的H2S供體型活性天然產(chǎn)物，包括大蒜中含量較高的二烯丙基三硫化物(DATS)及二烯丙基二硫化物(DADS)，蘑菇中的lenthionine，蘆筍中的asparagusic acid trisulfide，海鞘中的varacin等[23](圖2)。2007年，Benavides等[24]報(bào)道了DATS和DADS可以在人類紅細(xì)胞內(nèi)或大鼠主動(dòng)脈中釋放H2S，舒張主動(dòng)脈環(huán)。其釋放機(jī)制研究表明，DATS可與GSH快速反應(yīng)生成硫醇二硫化物同時(shí)釋放H2S，而DADS可與GSH的α-碳發(fā)生親核取代反應(yīng)，緩慢釋放出少量的H2S[25]。

圖2 H2S供體型多硫化物類活性天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)

1.3 Lawesson試劑衍生物

Lawesson試劑(LR)是一種常用的硫代試劑，可將酮、酯、酰胺和醇硫化為相應(yīng)的硫類似物。GYY4137是LR的水溶性衍生物，可經(jīng)水解反應(yīng)釋放H2S[26](圖3)。由于其可獲得性和易于處理的特性，GYY4137是一種被廣泛應(yīng)用的H2S供體工具分子。Whiteman等[27]測試了GYY4137對脂多糖(LPS)處理的小鼠RAW 264.7巨噬細(xì)胞釋放促炎或抗炎因子的影響，發(fā)現(xiàn)該化合物對炎癥的影響不僅依賴于H2S的濃度，還取決于H2S的產(chǎn)生速率。但是，GYY4137也存在如下缺點(diǎn)：一方面，它通常被制備成二氯甲烷絡(luò)合物，而二氯甲烷在體內(nèi)會(huì)被代謝為多活性和高毒性的氣體信使分子CO[28]，因此，觀測到的生物效應(yīng)可能部分來自于CO；另一方面，尚沒有合適的對照化合物可以用來排除GYY4137釋放H2S之后產(chǎn)生的副產(chǎn)物所引起的生物活性[29]。

圖3 GYY4137的結(jié)構(gòu)

1.4 1,2-二硫雜-3-硫酮(DTT)

1,2-二硫雜-3-硫酮(DTT，圖4)是一類水解觸發(fā)釋放的H2S供體，其類似物茴三硫(ADT)的脫甲基產(chǎn)物ADT-OH常用于已知藥物分子的H2S供體衍生化[29]。如雙氯芬酸羧基和ADT-OH成酯可得到相應(yīng)的H2S供體衍生物s-diclofenac(圖4)，提高抗炎活性的同時(shí)降低了雙氯芬酸的胃腸道不良反應(yīng)[30]。此外，本課題組利用ADT-OH作為H2S供體，硝酸酯作為NO供體，合成了H2S/NO雙供體型丁苯酞(NBP)衍生物(1)[31]，該化合物在0.1 mmol/L濃度下對ADP誘導(dǎo)的家兔血小板聚集的抑制活性是丁苯酞的5.2倍；化合物1能夠釋放適量濃度的NO和H2S；化合物1能夠顯著改善缺血/再灌(I/R)大鼠的神經(jīng)行為功能，降低腦梗死面積及腦含水量，其效果優(yōu)于等物質(zhì)的量的丁苯酞；作用機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，化合物1可通過提高I/R大鼠腦內(nèi)GSH、超氧陰離子歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的水平，降低丙二醛(MDA)的含量，發(fā)揮抗氧化作用，從而對缺血性腦損傷產(chǎn)生保護(hù)作用(圖4)。

傳統(tǒng)的H2S供體雖然為H2S基礎(chǔ)生物學(xué)研究方面提供了易得的工具分子，但缺乏H2S釋放的選擇性及釋放速率的可控性，因此成藥性較差。下面介紹近年來發(fā)展的幾類新型H2S供體及其釋放H2S的機(jī)制。

2 可控釋放的H2S供體

2.1 硫醇觸發(fā)的H2S供體

硫醇觸發(fā)的H2S供體是一類常見的非水解觸發(fā)的供體。哺乳動(dòng)物體內(nèi)含有較多游離的硫醇小分子，如半胱氨酸、GSH等，其作為親核試劑與此類H2S供體親核加成后發(fā)生硫醇交換，可實(shí)現(xiàn)H2S的選擇性釋放[29]。研究人員發(fā)現(xiàn)N-巰基化合物中的S-N鍵在生理?xiàng)l件下易受到硫醇的進(jìn)攻而斷裂，可作為潛在的H2S供體[32]。但由于N-SH衍生物不穩(wěn)定，Zhao等[33]對SH基團(tuán)保護(hù)后得到穩(wěn)定的H2S供體N-(苯甲酰巰基)苯甲酰胺化合物NSHD-1(圖5)。再將NSHD-1與半胱氨酸(10當(dāng)量)反應(yīng)，研究NSHD-1釋放H2S的機(jī)制，得到了3種降解產(chǎn)物：N-苯甲?；腚装彼幔郊柞０泛碗装彼?。該法雖有一定的實(shí)用性，但由于體內(nèi)小分子硫醇化合物分布廣泛，所以此類硫醇觸發(fā)的H2S供體的選擇性有待進(jìn)一步提高。

圖4 1,2-二硫雜-3-硫酮(DTT)和茴三硫(ADT)及其衍生物的結(jié)構(gòu)

圖5N-(苯甲酰巰基)苯甲酰胺化合物NSHD-1經(jīng)硫醇觸發(fā)釋放H2S的機(jī)制

2.2 酶觸發(fā)的H2S供體

理想的酶觸發(fā)型H2S供體應(yīng)在生理?xiàng)l件下穩(wěn)定存在，但可在特定酶的作用下釋放H2S，以實(shí)現(xiàn)選擇性釋放H2S的目的。Zheng等[34]利用內(nèi)酯化前藥思路，將原藥結(jié)構(gòu)中的酚羥基和乙?；甚?，合成了一種酯酶敏感的H2S前藥BW-HP-101(圖6-A)。該化合物在生理?xiàng)l件下是穩(wěn)定的，但在酯酶作用下，游離的酚羥基可和鄰位的硫代丙酸形成內(nèi)酯，從而釋放出H2S。生物活性研究表明，BW-HP-101在LPS處理的小鼠RAW 264.7巨噬細(xì)胞模型中表現(xiàn)出一定的抗炎作用。其后，該課題組又報(bào)道了一類羥甲基二硫化合物(R1C(OH)HSSR1，3)為骨架的酯酶觸發(fā)的H2S供體2[35]?；衔?表現(xiàn)出一定的穩(wěn)定性，但可經(jīng)酯酶水解為化合物3，后者結(jié)構(gòu)中羥甲基二硫鍵為不穩(wěn)定的半縮醛，能快速斷裂形成有機(jī)過硫化物4，進(jìn)而釋放H2S(圖6-B)。體內(nèi)研究表明，化合物2在小鼠心肌缺血再灌注損傷模型中表現(xiàn)出較好的心臟保護(hù)作用。上述兩類酯酶觸發(fā)的H2S供體存在因酯酶分布廣而導(dǎo)致H2S釋放選擇性差的缺陷。因此，如何基于上述策略，設(shè)計(jì)非酯酶觸發(fā)的H2S供體分子是進(jìn)一步研究的課題。

2.3 光觸發(fā)的H2S供體

與上述硫醇和酯酶觸發(fā)的H2S釋放策略相比，光觸發(fā)策略具有更好的選擇性和可控性。迄今為止，已經(jīng)開發(fā)了數(shù)種不同類型的紫外光活化的H2S供體，如利用光固化劑鄰硝基芐基[36]和占噸酮基取代的叔丁酸基[37]，分別得到了紫外光激活的H2S供體化合物5和6(圖7-A)。最近，Venkatesh等[38]在紫外光照射和單線態(tài)氧光敏劑存在的條件下，研究了1,3-二苯基苯并[C]噻吩(DPET)將三線態(tài)氧(3O2)轉(zhuǎn)化為單線態(tài)氧(1O2)，再與噻吩環(huán)發(fā)生Diels-Alder反應(yīng)，形成過氧化物，進(jìn)一步降解成二酮化合物，釋放H2S(圖7-B)。此類紫外光觸發(fā)的H2S供體的主要缺點(diǎn)是紫外光對細(xì)胞的毒性會(huì)干擾此類供體的生物活性，另外還需要外源的單線態(tài)氧光敏劑來催化釋放H2S。

為了解決這些問題，他們又設(shè)計(jì)、合成了一種可見光(λ≥410 nm)觸發(fā)的H2S供體[38](圖7-C)。它應(yīng)用了激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(ESIPT)效應(yīng)作為光觸發(fā)機(jī)制，其特點(diǎn)是：一方面，ESIPT效應(yīng)有助于酚羥基的去質(zhì)子化并快速光解、釋放H2S分子[39]；另一方面，無需借助外部試劑，光照后產(chǎn)生H2S的同時(shí)釋放具有熒光的化合物，后者可檢測、定位亞細(xì)胞水平H2S的釋放。

圖6 化合物BW-HP-101(A)和化合物2(B)經(jīng)酯酶觸發(fā)釋放H2S的機(jī)制

圖7 (A)紫外光激活的H2S供體5和6的結(jié)構(gòu)；(B)DPET在紫外光和單線態(tài)氧光敏劑(PS)的作用下釋放H2S的機(jī)制；(C)化合物7經(jīng)紫外光激活釋放H2S的機(jī)制

2.4 經(jīng)COS介導(dǎo)的H2S供體

羰基硫化物(COS)是一種氣體分子，在化學(xué)生物學(xué)中具有獨(dú)特的作用。已知COS可在全身廣泛分布的碳酸酐酶(CA)作用下水解為H2S[40]，因此，通過采用選擇性釋放COS并進(jìn)一步在CA的作用下轉(zhuǎn)化為H2S的策略，可為選擇性釋放H2S提供新的途徑。COS前體主要分為硫代氨基甲酸酯和N-硫代羰基酸酐(N-thiocarboxyanhydrides，NTAs)兩類，下面分別加以介紹。

2.4.1 硫代氨基甲酸酯類H2S供體 Pluth課題組的Chauhan等[41]曾報(bào)道了一類COS前體分子，即硫代氨基甲酸-4-疊氮基芐酯(8)，該化合物可在H2S的作用下將疊氮基轉(zhuǎn)化為氨基，觸發(fā)1,6-消除反應(yīng)后釋放COS，再經(jīng)CA水解產(chǎn)生H2S(圖8-A)。此類硫代氨基甲酸芐酯可以通過芐基對位結(jié)構(gòu)修飾，以實(shí)現(xiàn)不同響應(yīng)策略下的H2S釋放[42]。該課題組的Steiger等[43]就利用特戊酸對硫代氨基甲酸芐酯中苯環(huán)的對位羥基進(jìn)行成酯保護(hù)，得到穩(wěn)定的H2S供體9，它可在酯酶作用下水解得到酚羥基中間體，再經(jīng)1,6-消除反應(yīng)，釋放COS，后者可由CA水解產(chǎn)生H2S(圖8-B)。體內(nèi)研究表明，化合物9在LPS處理的小鼠RAW 264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型中表現(xiàn)出一定的抗炎作用。其后，又在硫代氨基甲酸芐酯的苯基對位引入硼酸酯基團(tuán)得到一種選擇性更高的ROS響應(yīng)型H2S供體10[44]，它在體內(nèi)ROS(如H2O2)含量高的組織器官中被氧化，對位的硼酸酯轉(zhuǎn)化為酚羥基，再經(jīng)1,6-消除反應(yīng)后釋放H2S(圖8-C)。

為了實(shí)現(xiàn)更高選擇性的H2S釋放，該課題組想到了生物正交化學(xué)中經(jīng)典的鍵斷裂反應(yīng)。生物正交化學(xué)是指一類可以在活細(xì)胞或者體內(nèi)發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)，但反應(yīng)物和產(chǎn)物并不影響細(xì)胞或者體內(nèi)進(jìn)程。按照反應(yīng)類型分為鍵形成和鍵斷裂兩種，前者最為經(jīng)典的反應(yīng)為點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，已廣泛應(yīng)用于化學(xué)生物學(xué)的研究[45]。利用鍵斷裂反應(yīng)中的反式環(huán)辛烯(TCO)和四嗪之間的inverse-electron demand Diels-Alder(IEDDA)反應(yīng)作為激活策略，Steiger等[46]設(shè)計(jì)、合成了含硫代氨基甲酸酯和TCO片段的化合物11，它在四嗪衍生物的觸發(fā)下發(fā)生IEDDA反應(yīng)，再由互變異構(gòu)化的消除反應(yīng)，釋放COS，進(jìn)而釋放H2S(圖8-D)。

圖8 (A)化合物8經(jīng)H2S觸發(fā)釋放H2S的機(jī)制；(B)化合物9經(jīng)酯酶觸發(fā)釋放H2S的機(jī)制；(C)化合物10經(jīng)ROS觸發(fā)釋放H2S的機(jī)制；(D)化合物11經(jīng)四嗪衍生物觸發(fā)釋放H2S的機(jī)制

Zhao和Pluth等[47]進(jìn)一步將光激活策略和COS結(jié)合起來，設(shè)計(jì)、合成了紫外光激活的H2S供體分子PhotoTCM(圖9-A)。PhotoTCM在紫外光照射下首先產(chǎn)生游離的硫代氨基甲酸中間體12，后者分解產(chǎn)生4-氟苯胺和COS，從而釋放H2S。在此基礎(chǔ)上，Sharma等[48]進(jìn)一步設(shè)計(jì)合成了BDP-H2S(圖9-B)，它是一個(gè)基于氟硼二吡咯(BODIPY)的氨基甲酸硫酯類化合物，在可見光(470 nm)下，B-O鍵斷裂產(chǎn)生中間體13，后者不穩(wěn)定，產(chǎn)生COS，從而釋放H2S。BDP-H2S與PhotoTCM相比具有明顯的優(yōu)勢，雖然前者可在細(xì)胞中引起一定的氧化應(yīng)激，但是H2S釋放所需的光照射時(shí)間短且強(qiáng)度低，因此不會(huì)損害細(xì)胞活力。

圖9 化合物PhotoTCM (A)和BDP-H2S (B)經(jīng)光激活釋放H2S的機(jī)制

2.4.2N-硫代羰基酸酐類H2S供體 1971年，Hirschmann等[49]首次報(bào)道N-硫代羰基酸酐類可作為N-羧酸酐(NCAs)的替代物，用于寡肽的溶液相合成。最近，Powell和他的同事根據(jù)NTAs設(shè)計(jì)、合成了基于親核試劑激活的H2S供體14[50]?；衔?4容易附著于聚合物支架上，與親核試劑如硫醇等反應(yīng)，釋放COS，并產(chǎn)生對生物無害的副產(chǎn)物15(圖10)。盡管該化合物可以緩慢釋放H2S，但依舊存在類似于硫醇激活的H2S供體選擇性差的缺點(diǎn)，有待進(jìn)一步研究。

圖10 化合物14經(jīng)親核試劑激活釋放H2S的機(jī)制

3 結(jié) 語

作為氣體分子，H2S的活性與其釋放的部位、濃度和持續(xù)時(shí)間密切相關(guān)。傳統(tǒng)的H2S供體如硫化物無機(jī)鹽廣泛用于工具分子研究H2S的相關(guān)生物活性，但缺泛H2S釋放部位的選擇性。ADT-OH較多地被用于H2S供體藥物的設(shè)計(jì)、合成，其H2S釋放的選擇性仍有待提高。具有選擇性釋放潛力的H2S供體分子如硫醇、酯酶觸發(fā)的H2S供體分子已引起人們廣泛興趣，但由于硫醇和酯酶在體內(nèi)廣泛存在，H2S體內(nèi)釋放的選擇性也不十分理想。類似地，經(jīng)COS介導(dǎo)釋放H2S所需的碳酸酐酶也幾乎遍布全身且各處濃度不同，故無法保證在激活的原位釋放一定量的H2S。而光激活的H2S供體分子受光穿透能力的限制，實(shí)現(xiàn)動(dòng)物體內(nèi)選擇性的釋放也有一定難度。近年來，基于納米醫(yī)學(xué)的H2S遞送平臺(tái)充分利用上述小分子選擇性釋放H2S的策略，也已取得一定進(jìn)展[51-52]，由于本文篇幅有限，將另文報(bào)道。

相信隨著H2S相關(guān)生理、病理學(xué)研究的深入，更多H2S分子的釋放機(jī)制將被揭示出來；隨著不同學(xué)科之間的交叉合作，高選擇性H2S供體分子以及基于這些分子的藥物研究將會(huì)取得越來越大的進(jìn)展。