核桃內(nèi)果皮木質(zhì)素生物合成途徑關(guān)鍵基因研究進(jìn)展

郭永翠 秦江南 張銳

摘要：木質(zhì)素（Lignin）是陸生維管植物次生細(xì)胞壁中含量豐富的高分子有機(jī)化合物，與植物細(xì)胞壁內(nèi)的纖維素和半纖維素交織在一起。木質(zhì)素在核桃硬殼（內(nèi)果皮）中含量豐富且是其構(gòu)成的主要成分，含量約在60%以上，目前生產(chǎn)中核桃縫合線松弛以及核桃內(nèi)果皮發(fā)育不全（露仁）現(xiàn)象成為制約新疆核桃優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的主要因素，新疆要實(shí)現(xiàn)核桃的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)以及木質(zhì)素的充分合理的利用，需進(jìn)一步了解木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)、組成及關(guān)鍵基因表達(dá)調(diào)控。因此，重點(diǎn)對(duì)木質(zhì)素結(jié)構(gòu)、木質(zhì)素生物合成過(guò)程及基因調(diào)控規(guī)律等方面分析基因調(diào)控規(guī)律，為從植物木質(zhì)素合成及表達(dá)量方面改善新疆核桃品質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：核桃;木質(zhì)素;生物合成途徑;調(diào)控基因

核桃（Juglans regia L）在中國(guó)資源豐富且栽培歷史悠久，因其富含蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等人體所必需物質(zhì)及鐵、鋅、錳等多種微量元素，對(duì)于延緩人體衰老、心血管的保健作用、預(yù)防慢性疾病等具有非凡意義，有著極佳的保健效果和藥用價(jià)值，在國(guó)內(nèi)、國(guó)際市場(chǎng)均具有巨大的消費(fèi)潛力。新疆得天獨(dú)厚的自然生態(tài)條件使其是我國(guó)核桃重要產(chǎn)區(qū)之一，伴隨著核桃種植面積及品質(zhì)的綜合發(fā)展，培育出仁率高、易機(jī)械脫皮適于深加工的核桃品種是當(dāng)前核桃育種及品種改良的主要目標(biāo)之一。其中新疆珍稀核桃種質(zhì)‘溫138平均出仁率高達(dá)83.2%，產(chǎn)量極高、果殼極薄、極易脫皮，但殼面（內(nèi)果皮發(fā)育不完整或部分退化）開(kāi)裂導(dǎo)致露仁，是珍貴的遺傳育種資源。

研究表明，核桃內(nèi)果皮的主要組分是木質(zhì)素（Lignin），木質(zhì)素是陸生維管植物適應(yīng)環(huán)境的進(jìn)化特征之一，同時(shí)也是構(gòu)成其細(xì)胞壁的主要成分之一，主要存在于植物木質(zhì)化程度高的硬組織中與纖維素、半纖維素等多糖分子通過(guò)氫鍵、共價(jià)鍵等作用相互交聯(lián)在一起，通常起到增強(qiáng)細(xì)胞壁的沉積、提高細(xì)胞壁機(jī)械強(qiáng)度及硬度的作用，具有較強(qiáng)的不滲水性，對(duì)病原體具有保護(hù)的作用，其穩(wěn)定性較高從而使得植物細(xì)胞壁具有抗氧化、阻燃、機(jī)械支持及生物防御等功能。木質(zhì)素的物理及化學(xué)性質(zhì)也使得植物體具有防止蟲(chóng)害和病原體侵入的作用。植物體木質(zhì)素生物合成途徑及調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，目前關(guān)于木質(zhì)素單體合成途徑已基本清晰，但木質(zhì)素聚合機(jī)理仍未系統(tǒng)闡述清楚。本文從木質(zhì)素結(jié)構(gòu)、木質(zhì)素生物合成過(guò)程及基因調(diào)控規(guī)律等方面分析基因調(diào)控規(guī)律，以期從分子育種途徑調(diào)節(jié)核桃內(nèi)果皮木質(zhì)素生物合成途徑中關(guān)鍵基因，為進(jìn)一步改良核桃果實(shí)品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1核桃內(nèi)果皮研究

核桃由內(nèi)果皮（硬殼）和種仁組成，內(nèi)果皮作為核桃重要組成部分，具有比表面積和孔隙率大、機(jī)械強(qiáng)度高、可再生和降解等優(yōu)點(diǎn)，在核桃果實(shí)發(fā)育、加工及貯藏中均起著重要作用。目前對(duì)核桃內(nèi)果皮結(jié)構(gòu)（縫合線緊密度、厚度、機(jī)械強(qiáng)度）與種仁商品品質(zhì)的關(guān)系研究較多，及內(nèi)果皮做吸附劑吸附重金屬獲染料的研究較多。

研究表明，核桃內(nèi)果皮最主要組分為木質(zhì)素（GS型木質(zhì)素，其中G型木質(zhì)素高達(dá)80.68%），內(nèi)果皮越厚核桃縫合線越緊密，且硬殼厚度與堅(jiān)果質(zhì)量存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系，與出仁率存在極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。近年來(lái)通過(guò)研究核桃內(nèi)果皮（包括核桃殼粉）對(duì)Cu²⁺、As³⁺、Cr⁶⁺、pb²⁺等金屬離子分別進(jìn)行直接吸附、活性吸附劑等吸附試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)通過(guò)物理化學(xué)方法活化后吸附量比直接做吸附劑的效果好，其吸附性均對(duì)金屬離子均具有選擇吸附性。

2木質(zhì)素結(jié)構(gòu)

木質(zhì)素是具復(fù)雜三維網(wǎng)狀芳環(huán)結(jié)構(gòu)的酚類高分子聚合物，是一種珍貴難降解的天然可再生資源且含量高。其相對(duì)含量達(dá)生物質(zhì)的1/3左右且能量最高。通過(guò)氫鍵、酯鍵、醚鍵、范德華力等共價(jià)鍵與非共價(jià)鍵的共同作用，與纖維素、半纖維素連接并交織在形成復(fù)合體，在植物中起到抵抗壓力、硬化細(xì)胞壁、增強(qiáng)植物體的機(jī)械強(qiáng)度的作用，但很難造成分離純化木質(zhì)素。

木質(zhì)素是植物體內(nèi)含有大量醇羥基、酚羥基、羰基等活性基團(tuán)的復(fù)雜天然大分子，其含碳60%、氧30%、氫6%及氮0.67%左右，同時(shí)具備糖及酚的特點(diǎn)，因此反應(yīng)類型十分豐富，能與不同物質(zhì)發(fā)生不同化學(xué)反應(yīng)。木質(zhì)素主要由對(duì)一羥基苯基木質(zhì)素（bydroxy-phenyllignin，H-木質(zhì)素）、愈創(chuàng)木基木質(zhì)素（guaiacyl lignin，G-木質(zhì)素）和紫丁香基木質(zhì)素（syringyl lignin，S-木質(zhì)素）3種木質(zhì)素單體亞單位構(gòu)成，分別來(lái)自香豆醇（p-coumaryl alcohol）、松柏醇（coniferyl alcohol）和芥子醇（sinapyl-alcohol）3種苯丙烷。其中香豆醇結(jié)構(gòu)中沒(méi)有甲氧基基團(tuán)，芥子醇比松柏醇多了一個(gè)甲氧基基團(tuán)且芥子醇無(wú)游離的C-5，導(dǎo)致不能與其它單體形成較穩(wěn)定的C-C連接，因此S-木質(zhì)素結(jié)構(gòu)疏松在木質(zhì)素分離時(shí)較G和H型木質(zhì)素易被去除。通常20多種化學(xué)鍵連接在一起構(gòu)成木質(zhì)素單體，隨著木質(zhì)素相關(guān)研究的深入，發(fā)現(xiàn)植物體木質(zhì)素的構(gòu)成不僅由這3種木質(zhì)醇組成，還有木質(zhì)醇的不完全生物合成過(guò)程中生成的5-羥基松柏醇、羥基肉桂醛、羥基肉桂酸等單體也參與了木質(zhì)素的聚合過(guò)程，且在植物中發(fā)現(xiàn)錳過(guò)氧化物酶（MnP）、漆酶（L）、漆酶/木聚糖酶體系（LXS）、漆酶/介體體系（LMS）等可直接降解木質(zhì)素。

3木質(zhì)素生物合成途徑

木質(zhì)素生物合成途徑通常由羥基化、連接反應(yīng)、甲基化、氧化還原反應(yīng)、聚合反應(yīng)等復(fù)雜過(guò)程交互完成，由于植物自身發(fā)育、外界環(huán)境的影響，加之一些未知酶或基因?qū)δ举|(zhì)素生物合成造成影響或修正原有功能及作用，目前木質(zhì)素基本合成過(guò)程中木質(zhì)素單體的合成、貯藏、運(yùn)輸及木質(zhì)素單體脫氫羥化聚合為木質(zhì)素的過(guò)程還不是完全清楚。經(jīng)過(guò)木質(zhì)素方面多年的研究基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素單體生物合成途徑首先是二氧化碳在植物光合作用下產(chǎn)生的葡萄糖經(jīng)酶促反映生成苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸的莽草酸途徑，這是植物體、細(xì)菌及真菌特有的代謝途徑;其次是苯丙氨酸經(jīng)過(guò)脫氨基、甲基化、羥基活化等過(guò)程到反式-4-羥基肉桂酸（HCA）及其輔酶A脂類化合物的苯丙烷代謝途徑;最后是對(duì)羥基肉桂酸（HCA）及其輔酶A脂類化合物氧化還原為木質(zhì)素單體，再進(jìn)一步強(qiáng)化脫氫聚合生成木質(zhì)素的木質(zhì)素合成特異途徑。

木質(zhì)素生物合成途徑主要包括苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase，簡(jiǎn)稱PAL）、肉桂酸-4-羥基化酶（Cinnamic acid 4-hydroxylase，簡(jiǎn)稱C4H）、肉桂酸-3-羥基化酶（Coumaric acid 3-hydroxylase，簡(jiǎn)稱C3H）、咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（Caffeic acid O-methyl-transferase，簡(jiǎn)稱COMT）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4-coumarate CoA ligase，簡(jiǎn)稱4CL）、阿魏酸-5-羥基化酶（Ferulic acid 5-hydroxylase，F(xiàn)5H）、莽草酸/奎尼酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶（Shikimate/Quinate hydroxycin-namo訂transEerase，簡(jiǎn)稱HCT）、咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（Caffeoyl-CoA O-methyltransferase，簡(jiǎn)稱CCoAOMT）、對(duì)羥基苯乙烯酰輔酶A-3-脫氫酶（Coumaroyl-CoA3-Hydroxylase，簡(jiǎn)稱CCoA3H）、肉桂酰輔酶A還原酶（CinnamoyI-CoA reductase，簡(jiǎn)稱CCR）、肉桂醇脫氫酶（Cinnam訂alcohol dehydrogenase，簡(jiǎn)稱CAD）等參與。目前苯丙烷代謝途徑和木質(zhì)素合成途徑占據(jù)木質(zhì)素生物合成過(guò)程重要地位但其相關(guān)研究還不夠深入徹底，也因此這兩種途徑成為國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者在木質(zhì)素方面的研究熱點(diǎn)。

4木質(zhì)素合成途徑中關(guān)鍵調(diào)控基因

木質(zhì)素生物合成途徑及其調(diào)控過(guò)程復(fù)雜，根據(jù)其途徑中關(guān)鍵酶調(diào)控效果可分為3類：（1）苯丙烷代謝途徑調(diào)控基因，主要由PAL（苯丙烷類代謝途徑首個(gè)限速酶）、C4H（細(xì)胞中起結(jié)構(gòu)支架作用的單氧化酶）及4CL（連接木質(zhì)素前體及各個(gè)分支反應(yīng)的關(guān)鍵酶）參與調(diào)控;（2）木質(zhì)素特異合成途徑上游基因調(diào)控，主要由Call（控制木質(zhì)素代謝過(guò)程H-單體向G/S-單體轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶）、COMT（參與C5位置甲基化的重要甲基化酶）、CCoAOMT（參與芳香環(huán)上羥基的甲基化酶）、FsH（CYP84家族決定S一木質(zhì)素前體的限速酶）參與調(diào)控;（3）木質(zhì)素單體特異合成途徑下游基因調(diào)控，下游調(diào)控基因由CCR（控制木質(zhì)素合成及微纖夾角）和CAD（木質(zhì)素生物合成中最后一步關(guān)鍵催化反應(yīng)酶）組成。

4.1苯丙烷代謝途徑調(diào)控基因

PAL存在于多數(shù)綠色植物和少數(shù)細(xì)胞細(xì)菌、真菌和藻類中，在植物體內(nèi)苯丙烷代謝途徑中催化苯丙氨酸脫氨生成氨和反式肉桂酸，對(duì)細(xì)胞分化、木質(zhì)化過(guò)程、抗旱、抗寒、抗病蟲(chóng)害等方面均起到重要作用。Korth等在轉(zhuǎn)基因煙草中上調(diào)PAL基因，木質(zhì)素含量及PAL的活性均增加;鄒麗紅等在砂梨研究中抑制PAL活性降低了木質(zhì)素含量及石細(xì)胞含量，但并未改良砂梨果品品質(zhì)。C4H是細(xì)胞色素P450家族CYP亞家族中的一種單氧化酶，在細(xì)胞中起著結(jié)構(gòu)支架的作用，Sewalt等對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草研究中發(fā)現(xiàn)抑制C4H表達(dá)會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)S/G值下降，木質(zhì)素含量出現(xiàn)降低同時(shí)其構(gòu)成改變，但植株生長(zhǎng)正常未出現(xiàn)異常;Blee K等在煙草研究發(fā)現(xiàn)中發(fā)現(xiàn)抑制植株中C4H活性，S/G比值出現(xiàn)顯著降低且木質(zhì)素的含量明顯下降，植物生長(zhǎng)正常未出現(xiàn)異常。通過(guò)對(duì)4CL序列分析發(fā)現(xiàn)4CL基因主要從玉米、水稻等單子葉植物和擬南芥、煙草等雙子葉植物中被克隆出來(lái)，隨后研究發(fā)現(xiàn)4CL在植物體內(nèi)主要以基因家族的形式存在，位于苯丙烷類及其衍生物生物合成的關(guān)鍵點(diǎn)上。倪志勇等在擬南芥、煙草、白楊、毛白楊等植物的研究中發(fā)現(xiàn)，抑制4CL基因表達(dá)會(huì)引起植物體內(nèi)木質(zhì)素含量顯著降低，其中S/G比值卻會(huì)根據(jù)植物種類的不同而有所差異，在擬南芥植株中G-木質(zhì)素的含量顯著降低，在煙草植株中S-木質(zhì)素的含量顯著降低，而在白楊中植株S/G卻沒(méi)有明顯變化。綜上所述，下調(diào)這4種酶活性或抑制基因表達(dá)，植株體內(nèi)木質(zhì)素含量顯著降低。

4.2木質(zhì)素特異合成途徑上游基因調(diào)控

C3H是細(xì)胞色素P450 CYP98A3基因家族之一，在植物木質(zhì)素代謝過(guò)程中主要調(diào)控H單體向G、S單體轉(zhuǎn)化。Reddy等對(duì)苜蓿反義抑制研究中發(fā)現(xiàn)降低C3H活性木質(zhì)素含量沒(méi)有明顯變化，但H單體相較G、S單體其含量顯著增加;Coleman等研究發(fā)現(xiàn)降低C3H基因表達(dá)，S/G比值也顯著增加（木質(zhì)素總含量顯著下降）;Ralph J等降低白楊中C3H基因表達(dá)，木質(zhì)素總量降低為原來(lái)的一半，其中G-木質(zhì)素和S-木質(zhì)素含量均下降，但是原本含量較低的H-木質(zhì)素則顯著增加的現(xiàn)象。COMT植物體內(nèi)主要起到合成和調(diào)控S-型木質(zhì)素的作用。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，抑制玉米、銀合歡、紫花苜蓿等植物中COMT活性，木質(zhì)素含量均出現(xiàn)明顯下降現(xiàn)象。Lapierre等研究轉(zhuǎn)基因白楊、高羊茅等植物發(fā)現(xiàn)，調(diào)控COMT一般只影響S/G比值，木質(zhì)素含量變化不明顯，只有在高水平抑制表達(dá)時(shí)才能起到降低木質(zhì)素總含量的作用。CCoAOMT比COMT發(fā)現(xiàn)的晚些，主要參與S/G-型木質(zhì)素的合成及調(diào)控作用。最早對(duì)擬南芥、苜蓿等植物研究發(fā)現(xiàn)，抑制CCoAOMT的表達(dá)木質(zhì)素含量明顯降低同時(shí)其組分發(fā)生改變;在抑制甜蕎、桉樹(shù)等植物中CCoAOMT基因的表達(dá)，能顯著降低木質(zhì)素含量，其中甜蕎中CCoAOMT基因表達(dá)量與木質(zhì)素含量呈顯著正相關(guān);在亞麻、楊樹(shù)等植物中抑制CCoAOMT基因的表達(dá)，木質(zhì)素含量不僅降低同時(shí)伴有植株生長(zhǎng)畸形、木質(zhì)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化等現(xiàn)象。其中反義共轉(zhuǎn)化COMT、CCoAOMT基因表達(dá)，使轉(zhuǎn)基因煙草植株木質(zhì)素含量下降幅度更大，說(shuō)明存在協(xié)同效應(yīng)及交叉作用。F5H在植物體中起限制S一型木質(zhì)素合成的作用，通過(guò)調(diào)控F5H基因的表達(dá)雖然不能起到降低木質(zhì)素總含量的作用，但過(guò)量表達(dá)F5H基因?qū)е耂-型木質(zhì)素單體含量增加（S/G比值增大），使的木質(zhì)素更易于從植物體內(nèi)去除。調(diào)控上述3種酶活性不僅起到降低植物木質(zhì)素含量的作用且起到改變木質(zhì)素組分的作用。

4.3木質(zhì)素單體特異合成途徑下游基因調(diào)控

CCR催化3種羥基肉桂酸輔酶A酯生成相應(yīng)肉桂醛，緊接著CAD通過(guò)NADPH將3種肉桂醛通過(guò)氧化還原反應(yīng)催化生成3種對(duì)應(yīng)的肉桂醇，對(duì)其展開(kāi)的相關(guān)研究相對(duì)較早。Relph等（1998）研究發(fā)現(xiàn)，抑制CCR的表達(dá)使植物體內(nèi)木質(zhì)素總含量顯著下降，且組分會(huì)發(fā)生相應(yīng)改變。研究發(fā)現(xiàn)降低轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)（Populus tremula×Populus alba）、玉米、黑麥草中CCR的活性，植株中木質(zhì)素總體含量將會(huì)降低甚至到原來(lái)含量的一半，植株的表型出現(xiàn)異常且生長(zhǎng)活力不足。研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥、楊樹(shù)、甜蕎等植物中降低CAD基因的表達(dá)量往往伴隨著木質(zhì)素含量降低或影響木質(zhì)素單體的組成，植株表現(xiàn)型通常正常。

5木質(zhì)素研究問(wèn)題與展望

通過(guò)近年來(lái)的不斷探索目前已研究開(kāi)發(fā)出上百種的木質(zhì)素產(chǎn)品，但是由于木質(zhì)素結(jié)構(gòu)復(fù)雜多變、化學(xué)成分尚不完全清楚、化學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定等因素制約，我們對(duì)木質(zhì)素的空間結(jié)構(gòu)和代謝途徑了解還不透徹，目前只有少數(shù)植物中的木質(zhì)素建立了結(jié)構(gòu)模型，可能還有很多與木質(zhì)素相關(guān)的基因沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)，關(guān)于核桃露仁現(xiàn)象及與之相關(guān)核桃內(nèi)果皮硬化過(guò)程中木質(zhì)素沉積的系統(tǒng)分子機(jī)理尚不清楚，如何深挖露仁核桃資源在生產(chǎn)加工、遺傳育種上的應(yīng)用潛能，加強(qiáng)新疆特有露仁核桃種質(zhì)資源的保存與保護(hù)，深層次發(fā)揮露仁優(yōu)良基因在新疆高品質(zhì)露仁核桃育種中的實(shí)踐價(jià)值，是當(dāng)前核桃育種基礎(chǔ)研究和生產(chǎn)實(shí)踐中亟需解決的問(wèn)題。通過(guò)克隆得到木質(zhì)素生物合成途徑中關(guān)鍵基因并加以調(diào)控，從而起到改變植物體木質(zhì)素含量及其組分的相關(guān)研究也成為近幾年研究的熱點(diǎn)。在基因調(diào)控方面，人們?cè)诓煌参锟寺〔@得木質(zhì)素含量改變植株，目前核桃（Juglans regia）全基因組測(cè)序已完成，深入研究核桃內(nèi)果皮木質(zhì)素代謝途徑相關(guān)基因的功能、核桃硬核期基因調(diào)控方面提供理論基礎(chǔ)，可以為今后開(kāi)展核桃遺傳圖譜構(gòu)建、分子標(biāo)記輔助選擇和品質(zhì)改良、重要性狀基因的克隆與功能驗(yàn)證等分子育種工作打好基礎(chǔ)。